专利名称：用于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针、试剂盒和方法
技术领域：
本发明属于动物检测生物技术领域，具体涉及应用实时荧光定量PCR的方法检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针、试剂盒和方法。
背景技术：
牛白细胞粘附缺陷病((bovineleukocyte adhesion deficiency, BLAD)是一种常染色体单基因隐性遗传疾病，它的特征表现为严重的重复性感染、伤口愈合延迟和发育不良，而且还伴有明显的持续性中性粒细胞增多。BLAD发生的分子生物学理论根据是在基因CD18的383的位置上发生点突变，腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即导致在粘附分子CD18的氨基酸128天门冬氨基酸由甘氨酸代替(D128G)。患有BLAD牛的中性粒细胞的白细胞粘附分子的β 2整合素(⑶11a，b，c/⑶18)的表达出现障碍，致使白细胞粘附依赖性功能表现出明显的异常。1983年，报道了一例Holstein小母牛发病，怀疑是白细胞功能障碍，称为粒细胞病。1987年，日本报道有几例Holstein牛与持续性和反复性中性粒细胞病有相似的临床特征。1990年，人们从一头患粒细胞综合症的牛身上发现β 2整合素分子在白细胞上的表达缺陷，这种病与人LAD是非常相似的，因此命名为BLAD。二十多年来已给奶牛业带来了巨大的经济损失。目前本病在澳大利亚、英格兰、法国、美国、日本、德国、荷兰、丹麦和瑞士等国均有发生的报道，2006年我国也发现有BLAD携带牛的报道。近几年来鉴于我国大量引进奶牛及其精液，不可避免地将BLAD带入，而目前有关BLAD的危害性还 没引起人们的高度重视，目前国内外通过PCR扩增含有基因⑶18的383片段并采用限制性内切酶分析，人们可以将正常，BLAD携带者和BLAD患病动物区分开来。Tajima等用一对引物扩增大约600 bp的片段，使用TaqI处理后健康牛产生100 bp,200 bp,300 bp三个片段，BLAD牛产生200 bp,400 bp 二个片段，而BL AD携带牛则出现 100 bp,200 bp,300 bp,400 bp 四个片段。基于PCR方法结合限制性内切酶分析的DNA检测技术可以用于本病的诊断，但在实际应用中有其弊病，结果的判定不够客观，过程繁琐且需经过限制性内切酶酶切和测序鉴定等。双探针实时荧光定量PCR检测牛白细胞粘附缺陷病的基因分型方法，其原理是针对同一 SNP位点的不同基因型设计两条不同的探针，把它们同时加入到PCR反应体系中，只有与靶序列完全匹配的探针才能被水解并释放出荧光信号。两条探针分别标记不同的荧光基团，分别用实时荧光定量PCR仪中对应的荧光检测通道检测荧光信号。某种基因型对应的荧光探针能够释放荧光信号，说明在原始DNA样本中含有该种基因型。如果只有一条探针能释放荧光信号，那么检测的SNP位点上是纯合子，要么为健康牛，要么为发病牛；如果两条探针都有荧光信号，那么在该SNP位点上是杂合子，为疾病基因携带者。有鉴于此，本发明人对牛白细胞粘附缺陷病的检测进行了改进，本案由此产生。
发明内容
本发明的一个目的，在于提供检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针、试剂盒和方法。本发明针对牛白细胞粘附缺陷病的CD18基因突变的特点，设计了一种特异检测引物及探针、另提供了含此特异检测引物及探针的试剂盒及检测方法，该方法具有操作简便，耗时短，成本低，特异性强，重复性和稳定性高，灵敏度高的特点。本发明设计的特异性检测引物及探针，以及提供的试剂盒和检测方法，既可以用于活体牛的检测，又可用于非活体牛的检测。为达成上述目的，本发明的技术解决方案是:
一种检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针，引物包括上游引物及下游引物，其序列如下:
上游引物:5’ - TTGCGTTCAACGTGACCTTC-3’ ；
下游引物 5’ - TCACCCCCCAGCTTCTTG -3’。探针包括突变型等位基因探针及野生型等位基因探针，其序列如下:
突变型等位基因探针:HEX-5’ -CCATCGGCCTGTAC-3’ -MGB ；
野生型等位基因探针:FAM-5’ -CCCATCGACCTGTACT-3’ -MGB。一种检测牛白细胞粘附缺陷病的试剂盒，含有如上述所述的引物和探针。一种检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，包括如下步骤:提取牛血总DNA ;配制实时荧光定量PCR反应体系；进行实时荧光定量PCR反应；根据扩增曲线进行结果判定。进一步，实时荧光定量PCR反应体系(50 μ L)的配制如下:
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2 X)25 μ L ；
上游引物(ΙΟμπιοΙ/L)lyL；
下游引物(ΙΟμπιοΙ/L)I μ L ；
突变型等位基因探针(lOymol/L)luL；
野生型等位基因探针(ΙΟμπιοΙ/L)luL；
DNA 模板(25ng/y L)5μ L ；
补水至50 μ L0进一步，实时荧光定量PCR反应包括以下步骤:
1)95°C变性 IOmin ；
2)95°C变性30s，60°C退火延伸lmin，循环40次。进一步，根据扩增曲线结果判定如下:
若荧光检测通道检测到HEX荧光信号，即检测到的是突变型等位基因，根据结果判定是病牛；
若荧光检测通道检测到FAM荧光信号，即检测到的是野生型等位基因，根据结果判定是健康牛；
若荧光检测通道即检测到HEX荧光信号又检测到FAM荧光信号，则检测到的是突变型等位基因和野生型等位基因，根据结果 判定是疾病基因携带牛。本发明的有益效果为:
1、本发明针对牛白细胞粘附缺陷病的CD18基因突变的特点，设计了一种特异检测引物及探针，使用该引物和探针只需要进行一次实用荧光定量PCR反应就能同时快速区分BLAD病牛、BLAD携带牛和健康牛，该方法操作简便，耗时短，成本低，特异性强，重复性和稳定性高，灵敏度高，为本病的大规模检验检疫工作提供了广阔的应用前景。2、本发明的检测试剂盒可对牛白细胞粘附缺陷病进行快速检测，样品适用范围广，试剂中均无感染性的和生物安全隐患的成分，使用安全。
图1引物扩增后的1.5%琼脂糖凝胶电泳图。O为空白对照；M为IOObp标准分子量；I 6为6个被测样品。图2探针I阳性质粒标准品扩增曲线图。1 8依次为IO8-1O拷贝数/ μ L。图3探针2阳性质粒标准品扩增曲线图。1 8依次为IO8-1O拷贝数/ μ L。图4部分被检样品和对照样品的检测结果图(I为健康牛样本及其对照样本；2为BLAD阳性对照样本；3为杂合子牛样本和杂合子对照样本；4为空白对照样本)。
具体实施例方式一、设计引物和探针
本发明选取现有GENNANK中基因CD18的基因序列进行同源性比较，根据其保守区域，通过Primer Express软件和primer 5.0软件设计，并经过大量的反应条件优选，对比试验和验证试验才获得的用于BLAD的特异性引物。所形成的引物组合包含的引物碱基数为18 24个，引物的熔解温度Tm值为56 63°C，引物GC%为40% 60%。同时进行筛选，保留不能形成引物二聚体的引物，所获得的这对引物其扩增的目标片段长度为118bp，得到的引物序列如下:
上游引物:5’ -TTGCGTTCAACGTGACCTTC-3’ ；
下游引物:5’ -TCACCCCCCAGCTTCTTG-3，。针对患牛白细胞粘附缺陷病的牛基因CD18的突变基因，设计了突变型等位基因探针，而对健康牛基因CD18，设计了野生型等位基因探针，探针序列如下:
突变型等位基因探针:HEX-5’ -CCATCGGCCTGTAC-3’ -MGB ；
野生型等位基因探针:FAM-5’ -CCCATCGACCTGTACT-3’ -MGB。引物和探针送上海基康生物技术有限公司合成，突变型等位基因探针和野生型等位基因探针的5’端标记报告荧光染料FAM，3’端标记TaqMan-MGB ;探针和引物均经过HPLC纯化，按各自的摩尔数计算，用双蒸水溶解成10 μ M贮存液备用。二、构建⑶18基因部分片段的重组质粒及其标准品的制备
按照萨姆布鲁克.J《分子克隆实验指南》(上下册)第三版(黄培堂译)，科学出版社出版(2005年)，进行⑶18基因部分片段的克隆，构建在pMD18-T载体上，转化至DH5a大肠杆菌中，挑取阳性克隆增殖后提取质粒DNA进行序列测定以鉴定插入序列，并测定质粒DNA浓度进行拷贝数的换算。应用上述引物以构建的重组质粒为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。三、样品DNA的提取与纯化采用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒按照操作说明提取牛血DNA样品。牛血DNA样品，既可以来源于活体牛，也可以来源于非活体死亡的牛。高质量的DNA检测样品是本检测方法成功与否的保证，所提取和纯化样品DNA进行260nm和280nm的紫外光吸收率的测定，OD26tl值应该在0.05 I的区间内，且0D26Q/0D26。比值应介入1.5 2.0之间。根据OD26tl值计算DNA浓度，并将DNA溶液稀释到25ng/ μ L，_20°C保存备用。四、实时荧光PCR扩增体系的建立及优化
1.TaqMan-MGB双探针实时荧光定量PCR检测BLAD方法的建立实时荧光定量PCR的反应体系(50 μ L)如下:
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2 X)25 μ L ；
上游引物(ΙΟμπιοΙ/L)lyL；
下游引物(ΙΟμπιοΙ/L)I μ L ；
突变型等位基因探针(lOymol/L)luL；
野生型等位基因探针(ΙΟμπιοΙ/L)luL；
DNA 模板(25ng/y L)5μ L ；
补水至50 μ L0实时荧光定量PCR反应包括以下步骤:
1)95°C变性 IOmin ；2)95°C变性30s，60°C退火延伸lmin，循环40次。2.敏感性检验将标准品IO8拷贝/ μ L纯野生株(健康牛)质粒和纯变异株(生病牛)质粒IO8拷贝/ μ L分别作I O倍梯度稀释，稀释至10拷贝/ μ L，分别进行荧光定量P C R反应，以确定每个反应能检测出的最低拷贝数，并得到阳性质粒标准品扩增曲线图，见图2和图3。结果表明当阳性质粒低于10拷贝/ μ L时，本反应体系仍可以有效扩增，并得到良好的扩增曲线，证明该方法具有很高的灵敏度，最少可以检测到10拷贝数的模板。3.特异性的检验经过多次实验 ，本研究建立的TaqMan-MGB双探针实时荧光定量PCR检测BLAD患牛阳性样本、本病携带牛对照和健牛对照样本进行检测都具有良好的结果。采取其他不同动物(猪、马、绵羊、山羊、兔、鸡、鸭和鹅等)的血液提取DNA，用TaqMan-MGB双探针实时荧光定量PCR反应系统进行检测，验证方法的特异性，结果均为未出现明显的扩增曲线，表明本方法对检测BLAD具有良好的特异性。4.临床样本的检测本研究采集了 200份从新西兰进口的种母牛，应用建立的TaqMan-MGB双探针实时荧光定量PCR检测BLAD，结果198份样本为阴性(即健康奶牛)，二份样本为携带者(为杂合子)。如图4所示，为其中部分被检样品和阳性对照和杂合子对照样品的PCR检测结果图。以上仅为本发明的一个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
权利要求
1.于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针，其特征在于:引物包括上游引物:5’ -TTGCGTTCAACGTGACCTTC-3’ 和下游引物 5’ - TCACCCCCCAGCTTCTTG -3，;探针包括突变型等位基因探针:HEX-5’ -CCATCGGCCTGTAC-3’ -MGB和野生型等位基因探针:FAM-5’ -CCCATCGACCTGTACT-3’ -MGB。
2.于检测牛白细胞粘附缺陷病的试剂盒，其特征在于:含有如权利要求1所述的引物和探针。
3.于检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，其特征在于:使用如权利要求1所述的引物和探针或如权利要求2所述的试剂盒，采用实时荧光定量PCR的方法，包括实时荧光定量PCR反应体系的配制及实时荧光定量PCR反应。
4.权利要求3所述的用于检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，其特征在于:在实时荧光定量PCR反应之前，还包括提取牛血总DNA的步骤。
5.权利要求4所述的用于检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，其特征在于:实时荧光定量PCR反应体系的配制，总体积为50 μ L，配制如下: TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2 X)25 μ L ； 上游引物(ΙΟμπιοΙ/L)lyL； 下游引物(ΙΟμπιοΙ/L)I μ L ； 突变型等位基因探针(10ymol/L)IuL ； 野生型等位基因探针(ΙΟμπιοΙ/L)luL； DNA 模板(25ng/y L)5μ L ； 补水至50 μ L0
6.权利要求5所述的用于检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，其特征在于:实时荧光定量PCR反应包括以下步骤:1)95°C变性 IOmin ； 2)95°C变性30s，60°C退火延伸lmin，循环40次。
全文摘要
本发明公开了用于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针。本发明还涉及用于检测牛白细胞粘附缺陷病的实时荧光定量PCR检测方法，所述方法包括本发明的引物和探针。本发明还涉及用于检测牛白细胞粘附缺陷病的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的引物和探针。本发明的实时荧光定量PCR检测方法，用于检测活体牛或非活体牛时，具有操作简便，耗时短，成本低，特异性强，重复性和稳定性高，灵敏度高的特点。
文档编号C12N15/11GK103088119SQ20121042020
公开日2013年5月8日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者谢明星, 彭小莉, 刘棠, 陈伟玲, 王群力, 王景明, 徐维佳, 孙福泉, 王伟 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心