一种草鱼出血病病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及兽用生物制品技术领域，具体设及一种草鱼出血病病毒抗体化ISA检 测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 草鱼是我国淡水养鱼的主要品种，其产量约占淡水养殖总产量的20%。草鱼出血 病是鱼种培育阶段一种流行地区广泛、流行季节长、发病率高、死亡率高、危害性大，是危害 草鱼最为严重的病毒性疾病，造成重大的经济损失。目前，没有治疗草鱼出血病的特效药 物，主要通过疫苗、养殖环境等方面控制草鱼出血病疫情的发生。在评价疫苗效果方面，草 鱼出血病疫苗免疫鱼产生的抗体效价是重要的指标。目前，市场上没有关于检测草鱼出血 病病毒抗体的化ISA试剂盒。
[0003] 本发明主要根据草鱼出血病病毒繁殖和其产生抗体的特征，专口制备了相应检测 抗体的化ISA试剂盒。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种草鱼出血病病毒抗体 ELISA检测试剂盒，该试剂盒中ELISA板包被的草鱼出血病病毒纯度高，检测更灵敏；经过 酶解胶原蛋白封闭、戊二醒固定、干燥后有效延长保存期。
[0005] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0006] 一种草鱼出血病病毒抗体化ISA检测试剂盒，其包括鼠抗兔IgG的酶标记物、包被 有草鱼出血病病毒的化ISA板。
[0007] 上述的化ISA检测试剂盒还包括标准血清、洗漆液、TMB底物显色液、终止液。
[000引本发明还提供了上述草鱼出血病病毒抗体的化ISA检测试剂盒的制备方法，其包 括W下几个步骤：
[0009] 1化LISA板包被抗原的制备；采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒获得病毒悬浮液； 对病毒悬浮液进行离屯、、超滤浓缩后得到浓缩液，将浓缩液依次经过分子筛层析、阴离子交 换层析、超滤浓缩后获得精纯病毒液；
[0010] 2)包被液的制备：包被液为0. 05mol/L磯酸盐缓冲液，该包被液的抑为9?9. 8 ;
[0011] 3)洗漆液的制备：洗漆液为0. 15mol/L含吐温-20的磯酸盐缓冲液，该洗漆液的 抑为7. 4,吐温-20的体积浓度为0. 05% ;
[0012] 4)封闭液的制备；在上述洗漆液中加入50?500 y g/ml的酶解胶原蛋白，即得封 闭液；
[0013] 5化LISA板的制备；将步骤1)制得的精纯病毒液加入到包被液中进行稀释至浓度 为0.5?10 yg/ml的病毒蛋白稀释液，将病毒蛋白稀释液加入到化ISA板的每孔中，2? 8°C解育过夜；然后使用洗漆液洗漆，接着向化ISA板每孔中加入100 y 1封闭液后置于2? 8°C冰箱中解育过夜；再使用洗漆液洗漆后，加入0. 3ml含有浓度为0. 5?2%的戊二醒的 洗漆液在2?8°C下解育过夜；使用洗漆液洗漆后在37°C下干燥12?2化，干燥后使用膜 封闭化ISA板，37°C保存。
[0014] 具体地，在上述的步骤1)中采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒具体包括W下步 骤：
[0015] a、在无菌条件下采用孔径为10?100K的超滤膜对胎牛血清进行超滤，收集滤出 液，得到营养液；较佳的超滤膜孔径为30K ;
[0016] b、采用M199培养基培养CIK细胞，长满单层后加入膜蛋白酶进行消化，然后使用 移液管反复轻轻吹打成单细胞悬浮液，在25°C下按照体积比1:3接种传代培养；
[0017] C、待CIK细胞生长至单层致密后接种0.03M0I的草鱼出血病病毒，加入步骤a所 制得的营养液后25°C下培养4?6天后获得病毒悬浮液。
[0018] 具体地，在上述的步骤1)中所述的离屯、是将病毒悬浮液在4000?6000r/min的 转速下进行离屯、，离屯、时间为20?60min，然后收集上清液。其中，较佳的方案中，离屯、转速 为4500?6000r/min，离屯、时间为30?60min。
[0019] 将上述离屯、步骤后得到的上清液采用孔径为10?300K的超滤膜进行超滤，收集 非滤出液，得到浓缩液。较佳的方案中超滤膜的孔径为10?100K。
[0020] 具体地，在上述的步骤1)中的分子筛层析采用填料为Superdex? 200、填料高度 为20?80cm的层析柱；上样前用PH为7. 2的0. Olmol/L磯酸盐缓冲液平衡层析柱，然后 将体积为填料体积的5?20%的浓缩液上样至层析柱中，使用PH为7. 2的0. Olmol/L磯酸 盐缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱峰样品，得到初纯液。
[002U 具体地，在上述的步骤1)中的阴离子交换层析采用填料为Cellufine Sul化te的 层析柱；上样前用PH为7. 2的0. Olmol/L磯酸盐缓冲液平衡层析柱，然后将初纯液上样至 层析柱中，使用0. 5mol/L化C1溶液进行梯度洗脱，收集第二洗脱峰样品，得到精纯液。
[0022] 将经阴离子交换层析得到的精纯液采用孔径为10?300K的超滤膜进行超滤，收 集非滤出液，得到精纯病毒液。较佳的方案中，超滤膜的孔径为10?100K。
[0023] 在上述步骤4)中，封闭液的制备具体包括W下步骤：
[0024] A、在5?lOg明胶中加入200ml用超纯水配制的PBS溶液，完全溶解后进行湿热 高压灭菌，温度为121°C、灭菌时间为20min ;
[0025] B、灭菌结束后自然冷却至常温，加入0.25%膜酶溶液，37°C下消化8-2化；重复该 步骤1-3次后得到膜酶消化液；
[0026] C、使用孔径为100K的超滤膜对膜酶消化液进行超滤，收集滤出液；然后使用孔径 为30K的超滤膜对上述滤出液进行超滤，收集非超滤液，得到酶解胶原蛋白；
[0027] D、将上述酶解胶原蛋白W 50?500 y g/ml的量加入到步骤3)所述洗漆液中，即 得封闭液。
[002引相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0029] 1、本发明通过采用胎牛血清中30KDa W下的小分子营养物质培养、收获草鱼出血 病病毒，然后经过超滤、分子筛层析、阴离子交换层析等步骤纯化，获得纯度非常高的病毒， 其病毒滴度（TCIDw)大于1〇7 5/0. 1ml时，蛋白含量小于100 y g/ml，使得本发明所述的试剂 盒检测草鱼出血病病毒抗体更加灵敏精准；其中，超滤膜超滤是为了去除小于超滤膜孔径 的蛋白质，同时具有浓缩的作用；而分子筛层析去除的是与草鱼出血病病毒在层析过程中 能够很好分离开的蛋白质；而阴离子交换层析去除的是与草鱼呼肠孤病毒带负电荷差异较 大的蛋白质。
[0030] 2、本发明通过对包被有高纯度的草鱼出血病病毒的化ISA板采用分子量为30? lOOKDa酶解胶原蛋白进行封闭、并采用0. 5-2%的戊二醒进行固定、干燥，能够有效延长试 剂盒的保存期，可在37°C下保存2个月。
[0031] 3、本发明所述的试剂盒的制备方法操作简单易行。
[0032] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明所述的浓缩液经过分子筛层析的分离效果图；
[0034] 图2为本发明所述的初纯液经过阴离子交换层析的分离效果图。
【具体实施方式】
[0035] 一种草鱼出血病病毒抗体化ISA检测试剂盒，其包括鼠抗兔IgG的酶标记物、包被 有草鱼出血病病毒的化ISA板。
[0036] 上述的草鱼出血病病毒抗体化ISA检测试剂盒还包括标准血清、洗漆液、TMB底物 显色液、终止液。
[0037] 上述草鱼出血病病毒抗体的化ISA检测试剂盒的制备方法，其包括W下几个步 骤：
[003引 1化LISA板包被抗原的制备；采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒获得病毒悬浮液； 对病毒悬浮液进行离屯、、超滤浓缩后得到浓缩液，将浓缩液依次经过分子筛层析、阴离子交 换层析、超滤浓缩后获得精纯病毒液；
[0039] 2)包被液的制备：包被液为0. 05mol/L磯酸盐缓冲液，该包被液的抑为9?9. 8 ;
[0040] 如洗漆液的制备；洗漆液为0. 15mol/L含吐温-20的磯酸盐缓冲液，该洗漆液的 抑为7. 4,吐温-20的体积浓度为0. 05% ;
[004U 4)封闭液的制备；在上述洗漆液中加入50?500 y g/ml的酶解胶原蛋白，即得封 闭液；
[0042] 5化LISA板的制备；将步骤1)制得的精纯病毒液加入到包被液中进行稀释至浓度 为0.5?10 yg/ml的病毒蛋白稀释液，将病毒蛋白稀释液加入到化ISA板的每孔中，2? 8°C解育过夜；然后使用洗漆液洗漆，接着向化ISA板每孔中加入100 y 1封闭液后置于2? 8°C冰箱中解育过夜；再使用洗漆液洗漆后，加入0. 3ml含有浓度为0. 5?2%的戊二醒的 洗漆液在2?8°C下解育过夜；使用洗漆液洗漆后在37°C下干燥12?2化，干燥后使用膜 封闭化ISA板，37°C保存。
[0043] 具体地，在上述的步骤1)中采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒具体包括W下步 骤：
[0044] a、在无菌条件下采用孔径为10?100K的超滤膜对胎牛血清进行超滤，收集滤出 液，得到营养液；较佳的超滤膜孔径为30K ;
[0045] b、采用M199培养基培养CIK细胞，长满单层后加入膜蛋白酶进行消化，然后使用 移液管反复轻轻吹打成单细胞悬浮液，在25°C下按照体积比1:3接种传代培养；
[0046] c、待CIK细胞生长至单层致密后接种0. 03M0I的草鱼出血病病毒，加入步骤a所 制得的营养液后25°C下培养4?6天后获得病毒悬浮液。
[0047] 具体地，在上述的步骤1)中所述的离屯、是将病毒悬浮液在4000?6000r/min的 转速下进行离屯、，离屯、时间为20?60min，然后收集上清液。其中，较佳的方案中，离屯、转速 为4500?6000r/min，离屯、时间为30?60min。
[0048] 将上述离屯、步骤后得到的上清液采用孔径为10?300K的超滤膜进行超滤，收集 非滤出液，得到浓缩液。较佳的方案中超滤膜的孔径为10?100K。
[0049] 具体地，在上述的步骤1)中的分子筛层析采用填料为Su