专利名称：检测手足口病患者ev71-vp1抗体在预测病情转归中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种滴定手足口患者EV71IgM抗体和EV71IgG抗体滴度的成套试剂及 其在预测手足口病患者病情转归中的应用。
背景技术：
手足口病重症的病原主要是肠道病毒属71血清型(EV71)，其主要临床表现为神 经系统损害、伴有/或心、肺损伤甚至功能衰竭。临床上病情发展往往不可预测，状况尚好 患儿可在短时间内发生急转直下的变化，甚至暴死。重症患者给予及时的被动免疫治疗 (比如免疫球蛋白、恢复期血清等)可使病情转危为安。但是重症的发生发展少见预兆，临 床上也缺乏参考指标，因此临床掌控治疗时机非常困难。发生重症的原因一般认为有二，一是病原学理论，二是免疫学理论。病原学理论认为，EV71为小RNA科病毒，其碱基易发生突变、同源重组、甚至丢失、 插入等，随时产生病毒突变株，这种随机的变异导致了临床病例轻重不同和组织器官损伤 差异的多样性；免疫学理论认为，肠道病毒属家族庞大、亲缘关系错综复杂，结构蛋白VPl用于血 清型别的分类。但型别间VPl存在同源序列，抗原性有交叉，因此机体在感染某种肠道病毒 产生的免疫记忆，可被不同血清型的肠道病毒唤醒。如果手足口患者之前曾感染亲缘密切 的病毒，那么在感染EV71重症病原时，机体表现出快速有效的免疫应答，细胞免疫迅速活 跃、抗体在短时间内升高。从上述免疫学理论可以看出，即便同是重症病原，感染免疫基础不同的机体可产 生不同的临床表现，免疫基础是病情转归的关键因素，提示患儿早期抗体水平与病情转归 之间存在相关性。采用ELISA方法检测患者抗体，可为临床判断EV71患儿的转归、预警重 症发生、决策治疗方案和掌控治疗时机提供重要的参考依据。抗体水平多用于评价疫苗免疫效果。近年来在麻疹的大规模的爆发流行中，科学 家利用麻疹抗体研究和评价了疫苗免疫策略[1]，利用抗体水平预测病情的转归规律已在出 血热研究中见有报道，MacNeil A[2]报道病毒特异性IgG、IgM水平预测出血热转归中起着 重要的作用等。ILee MS, Nokes DJ Predicting and comparing long-term measles antibody profiles of differentimmunization policies.Bull World Health Organ. 2001 ；79(7) 615-24.2MacNeil A， Comer JA, :Sin Nombre virus-specific immunoglobulin M and G kinetics in hantaviruspulmonary syndrome and the role played by serologic responses in predicting disease outcome. J InfectDis. 2010Jul 15 ；202 (2) :
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种检测手足口病患者抗体滴度的成套试剂， 本发明的成套试剂可用于检测手足口病患者的抗体滴度，检测结果可以作为预测病情转归 的判断依据，从而使临床重症可预测、可预防、可控制，减少死亡病例的发生。本发明是通过以下技术方案实现的一种滴定手足口患者EV71IgM抗体和EV71IgG抗体滴度的成套试剂，包括酶标板 和检测试剂；其中，所述EV71IgM抗体的酶标板包括聚苯乙烯板，聚苯乙烯板孔内包被有 IgM捕获抗体，EV71IgG抗体的酶标板包括聚苯乙烯板，聚苯乙烯板孔内包被有IgM捕获抗 体；所述检测试剂为辣根过氧化酶标记的EV71 VPl0所述酶标板是通过以下方法制备的鼠抗人IgG抗体、IgM抗体作为捕获抗体，分 别以1X10_5、1X10_6稀释后分别包被聚苯乙烯板，并用公知方法封闭、洗板，4°C存放；所述 稀释液为PH9. 6的碳酸盐缓冲液。所述检测试剂是通过以下方法制备得到的用基因工程方法克隆表达EV71 VPl (为公知方法，在此不再赘述)，并用公知方法纯化，辣根过氧化酶(HRP)标记，滴定工作 浓度(10_5 10_7)。本发明的成套试剂可以用于检测手足口病患者的抗体滴度，具体应用方式为将 待检血清分别作1 2、1 4、1 8稀释，加入IgM板检测孔中，做1 50、1 100、1 200 稀释加入IgG检测板孔中，37 0C反应30min后洗板，加检测试剂VPI-HRP，37 °C反应30min后 洗板，加TMP显色系统显色，并测A540值，采用上述方法检测的抗体滴度作为病情转归指标，检测患者血清IgM低于1 4、 IgG低于1 100，则提示病情有向重症方向发展的趋势；如果重复检测抗体滴度有升高，则 提示病情有向轻症方向发展和转归的趋势。本发明采用免疫学方法对EV71感染患者进行抗体水平检测，显色系统为辣根过 氧化物酶-TMP显色系统(属公知方法)，检测的结果可作为判断病情转归的判断依据，从而 使临床重症可预测、可预防、可控制，减少死亡病例的发生。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例一组装成套试剂，并应用其检测患者的抗体滴度1成套试剂的制备 (1)酶标板的制备鼠抗人IgG、IgM作为捕获抗体，分别以1 X 10_5、1 X 10_6稀释后 (稀释液为PH9. 6碳酸盐缓冲液)分别包被聚苯乙烯板，并用公知方法封闭、洗板，4°C存放。(2)检测试剂的制备用基因工程方法克隆表达EV71 VP1，并用公知方法纯化、辣 根过氧化酶(HRP)标记、滴定工作浓度(10_5 10_7)。2EV71患者血清检测及转归预测，采用上述成套试剂进行检测(1)通过检测患者血清抗体滴度推测病情发展趋势将患儿A、B、C三人静脉子凝 血清分别作1 2、1 4、1 8稀释加入IgM板检测孔中、做1 50、1 IOOU 200稀 释加入IgG检测板孔中，37 0C反应30min后洗板，加检测试剂VPI-HRP，37 °C反应30min后洗 板，加TMP显色系统显色，并测A540值。P/N值彡2.1判为阳性。结果见表1。
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表1EV71患者血清检测
I
权利要求
一种滴定手足口患者EV71IgM抗体和EV71IgG抗体滴度的成套试剂，其特征在于酶标板和检测试剂；其中，所述EV71IgM抗体的酶标板包括聚苯乙烯板，聚苯乙烯板孔内包被有IgM捕获抗体；所述EV71IgG抗体的酶标板包括聚苯乙烯板，聚苯乙烯板孔内包被有IgM捕获抗体；所述检测试剂为辣根过氧化酶标记的EV71VP1。
2.根据权利要求1所述的滴定手足口患者EV71IgM抗体和EV71IgG抗体滴度的成套 试剂，其特征在于所述酶标板是通过以下方法制备的鼠抗人IgG抗体、IgM抗体作为捕获 抗体，分别以1 X 10_5、1 X ΙΟ"6稀释后分别包被聚苯乙烯板，并用公知方法封闭、洗板，4°C存 放；所述稀释液为PH9. 6的碳酸盐缓冲液。
3.权利要求1所述的滴定手足口患者EV71IgM抗体和EV71IgG抗体滴度的成套试剂在 检测手足口病患者抗体滴度中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于将待检血清分别作1 2、1 4、1 8稀 释，加入IgM板检测孔中，做1 50、1 100、1 200稀释加入IgG检测板孔中，37°C反应 30min后洗板，加检测试剂，37°C反应30min后洗板，加TMP显色系统显色，并测A540值，若 P/N值彡2. 1，则判为阳性。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于检测患者VPl-抗体IgGS1 100、 IgM^ 1 2，提示病情有可能向严重方向发展，反之，则向稳定方向发展。
全文摘要
本发明公开了一种滴定手足口患者EV71IgM抗体和EV71IgG抗体滴度的成套试剂，包括酶标板和检测试剂；其中，所述EV71IgM抗体的酶标板包括聚苯乙烯板，聚苯乙烯板孔内包被有IgM捕获抗体，EV71IgG抗体的酶标板包括聚苯乙烯板，聚苯乙烯板孔内包被有IgM捕获抗体；所述检测试剂为辣根过氧化酶标记的EV71VP1。本发明的成套试剂可以用于检测手足口病患者的抗体滴度。检测的结果可作为判断病情转归的判断依据，从而使临床重症可预测、可预防、可控制，减少死亡病例的发生。
文档编号G01N33/569GK101936994SQ20101026584
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者孟红, 宋楠楠, 岳盈盈, 张颖, 李志会, 李鹏, 盖中涛 申请人:山东省医学科学院基础医学研究所;济南市传染病医院