一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列及其用途和检测方法与流程

本发明涉及一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列及其用途和检测方法，具体涉及一种来源于猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组的microRNA样病毒小RNA的鉴定以及在抗PRRSV中的应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染引起的一种严重危害世界养猪业的重要病毒性传染病，其主要特征为妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍、各年龄阶段猪的呼吸道症状。由于PRRS病毒具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用(ADE)和持续性感染等特征，现有疫苗对该病的保护作用有限，目前还没有抗PRRS病毒的特效药物。

microRNA是一类小的单链非编码RNA，其在病毒与宿主的相互作用中发挥着极其重要的转录后调控作用。一方面，病毒感染能够导致宿主编码的microRNA表达水平的改变，后者通过靶向病毒或者自身的基因，对病毒生命过程的诸多环节进行调控。另一方面，许多病毒同样可以编码microRNA调节宿主及病毒自身基因的表达，在病毒感染宿主细胞的过程中发挥重要作用。

已有研究证实在PRRSV感染宿主细胞的过程中，宿主编码的microRNA对于PRRSV的感染扮演重要调控作用。而PRRSV编码的microRNA迄今并无相关的报道，本发明探索并鉴定了一种来源于病毒基因组的microRNA样病毒小RNA(PRRSV-vsRNA1)，能够通过调节自身基因的表达，进而调控病毒复制和增殖，这为深入了解PRRSV感染过程中病毒与宿主的相互作用以及PRRSV病毒的防控提供了全新的视角和策略。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列及其用途和检测方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。

本发明所要解决的技术问题是提供鉴定来源于PRRSV的病毒小RNA的方法以及检测其作用机制。

本发明提供了源于PRRSV的病毒小RNA的sense链序列：UGCUGACUUGGCGCAACACGU。

本发明提供了源于PRRSV的病毒小RNA的前体序列：GUGAUGCGUCCAAGCUUAGUGAUCCUGCUACGCAGGAGUGGCUCUCUCGCAUGUGGGAUAGGGUUGACAUGCUGACUUGGCGCAACACGU。

本发明提供了预测microRNA样病毒小RNA的二级结构以及最小结合自由能(MFE)的生物信息学方法。

本发明提供了鉴定病毒小RNA所调控靶基因的双荧光素酶报告基因检测方法。

本发明通过体外实验发现所提供的病毒小RNA具有抑制PRRSV复制的特性能够用于开发新型抗PRRSV药物。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列，即PRRSV-vsRNA1，其特征在于，其核苷酸序列编码的RNA序列与SEQ ID NO.1相同。

SEQ ID NO.1包含如下序列：UGCUGACUUGGCGCAACACGU。所述序列为RNA。

所述抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列的前体RNA，其核苷酸序列编码的前体RNA序列与SEQ ID NO.2相同。

SEQ ID NO.2包含如下序列：

GUGAUGCGUCCAAGCUUAGUGAUCCUGCUACGCAGGAGUGGCUCUCUCGCAUGUGGGAUAGGGUUGACAUGCUGACUUGGCGCAACACGU。所述序列为RNA。

其中，所述抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列，预测并鉴定其调控的靶基因位于PRRSV的非结构蛋白2(Nsp2)区域。

PRRSV的非结构蛋白(Non-structural protein，Nsp)，简称Nsp。

一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列的用途，其特征在于，所述抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列转染PAMs细胞达到抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在PAMs细胞中的复制及增殖的效果。

一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

首先采用生物信息学预测microRNA样病毒小RNA的存在；

然后通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定了病毒小RNA所调控的靶基因；

最后通过qRT-PCR和TCID₅₀的方法检测了病毒小RNA模拟物对PRRSV感染宿主细胞的影响，测试待测物抑制PRRSV复制和增殖的作用。

本发明的有益效果：

本发明首先采用生物信息学预测microRNA样病毒小RNA的存在。然后通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定了病毒小RNA所调控的靶基因。最后通过qRT-PCR和TCID₅₀的方法检测了病毒小RNA模拟物对PRRSV感染宿主细胞的影响，并发现此模拟物具有显著抑制PRRSV复制和增殖的作用，这为PRRSV的防控提供了有效的方法。

附图说明

图1是本发明的PRRSV-vsRNA1前体序列的二级结构预测图。

图2是利用双荧光素酶报告基因载体系统检测PRRSV-vsRNA1的靶基因。

图3是利用qRT-PCR检测不同浓度PRRSV-vsRNA1模拟物转染PAMs细胞后对PRRSV ORF7mRNA表达的影响。

图4是利用qRT-PCR检测不同浓度PRRSV-vsRNA1模拟物转染PAMs细胞后对上清液中PRRSV基因组拷贝数的影响。

图5是利用qRT-PCR检测100nM的PRRSV-vsRNA1模拟物转染PAMs细胞后在感染的不同时间对于PRRSV ORF7mRNA表达的影响。

图6是检测100nM的PRRSV-vsRNA1模拟物转染PAMs细胞后在感染的不同时间对于细胞上清液中PRRSV滴度的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验技术。

实施例中所用生物材料来源如下：

DMEM培养基、Opti-MEM培养基与RPMI-1640培养基购于Life Tech公司；胰蛋白酶和胎牛血清购于BI公司；microRNA模拟物购于上海吉玛公司；引物由上海Invitrogen公司合成；FastStart Universal SYBR Green Master以及siRNA转染试剂购于Roche公司；HS酶，RNA提取试剂(RNAiso Plus)，反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit)购于Takara公司；Trans10感受态细胞，DNA纯化试剂盒(Easy Pure Quick Gel Extraction kit)购于北京全式金生物技术公司；psiCheck2载体以及Dual-Luciferase双荧光素酶报告系统购于Promega公司；PAMs细胞为(猪肺泡巨噬细胞)分离于6周仔猪的肺脏组织；MARC-145细胞(恒河猴肾细胞MA-104的衍生细胞系)，高致病性PRRSV毒株GD-HD(GenBank ID：KP793736.1)由西北农林科技大学兽医免疫生物学实验室保存。

实施例1：PRRSV-vsRNA1的发现以及结构的预测

1.序列下载：从miRBase网站(http：//www.mirbase.org/)中下载已报道的所有microRNA成熟序列(Release 21：June 2014)。从NCBI网站(http：//www.ncbi.nih.gov)中下载PRRSV基因组序列(GenBank ID：KP793736.1)。

2.microRNA前体序列的预测：利用python script程序将GD-HD毒株基因组序列(GenBank ID：KP793736.1)分为1200个长度为90bp的序列片段，利用RNAfold对截取的序列进行hairpin二级结构分析并预测其MFE(最小自由能)，之后选择出MFE小于或者等于-20Kcal.mol^-1的序列作为潜在的microRNA的前体序列。所有的序列进一步通过MiPred软件鉴定，挑选出符合pre-microRNA的序列进行BLASTn(核苷酸序列比对)去除重复序列，最终用BayesMiRFinder软件预测成熟序列。

3.序列比对筛选新的病毒来源的microRNA序列：为了鉴定所预测的microRNA前体序列是否是新的microRNA或者与已知的microRNA序列同源，将预测到的成熟microRNA序列与所下载的已知microRNA序列进行比对，分析同源性，错配低于4个碱基的序列被认为是与已知microRNA具有同源性，则将其从新预测的microRNA成熟序列中去除。

图1为利用RNAfold软件预测PRRSV-vsRNA1前体序列的二级结构图，发现PRRSV-vsRNA1的前体序列具有典型的茎环结构，此结构的最小结合自由能(MFE)值为：-35.40kcal/mol。

实施例2：预测并鉴定PRRSV-vsRNA1调控的靶基因

1.利用生物信息学软件预测PRRSV-vsRNA1调控的靶基因：首先利用RNAhybrid网站(http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)预测PRRSV-vsRNA1潜在靶基因及其结合位点。

具体方法是从NCBI网站中下载PRRSV毒株GD-HD基因组序列，利用在线预测工具，将GD-HD不同基因区域和PRRSV-vsRNA1的序列进行上传，下载所预测的结合位点等信息。

综合考虑如下因素：miRNA与靶位点序列的互补性；所预测的靶位点在不同毒株中的保守性；miRNA-mRNA双链之间的热稳定性；靶位点处不应该有复杂的二级结构等。

PRRSV基因组编码了多个非结构蛋白(Non-structural protein，Nsp)，简称Nsp。通过预测发现，PRRSV基因组的五个区域：Nsp1α，Nsp2，Nsp3，Nsp9以及Nsp10可能存在PRRSV-vsRNA1发挥作用的结合位点。

2.构建双荧光素酶报告基因载体：

1)利用Primer Premier 5.0软件设计引物，由上海Invitrogen公司合成，引物5'端和引物3'端含有酶切位点及保护碱基(以psiCheck2-nsp2载体为例)：

SEQ ID No.3psiCheck2-nsp2-F:

GCGATCGCGCCGGAAAGAGAGCAAGGAAAACACG；

SEQ ID No.4psiCheck2-nsp2-R:

GGGTTTAAACCCGCCCAGTAACCTGCCAAGAATGGCAA。

2)提取RNA进行反转录及PCR扩增：使用Takara公司RNAiso Plus提取PRRSV感染PAMs细胞后的总RNA。

步骤为：细胞加TAKARA公司的RNAiso Plus后，充分裂解；按照操作说明依次加入氯仿，异丙醇，离心后RNA沉于管底；加入75％乙醇清洗RNA，待沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水进行溶解。

测定RNA浓度，纯度及完整性，在核酸蛋白测定仪上测定RNA浓度及纯度，要求OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间，浓度大于2ug/μl，同时进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察所检测RNA的5S rRNA,18S rRNA和28S rRNA条带，需要三条带清晰完整。

使用Takara公司反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit)对于所提取的RNA进行反转录。

反转录反应体系：为5×PrimeScript Buffer，2μl；RTEnzyme MixI，0.5μl；Oligo dT Primer(50μM)，0.5μl；Random Primer(100μM)，0.5μl；Total RNA，500ng；RNase Free ddH₂O，补足10μl。

反转录的反应条件为：37℃，20min；85℃，5s；4℃。再利用Takara公司的HS DNA Polymerase对PRRSV的NSP2基因片段进行扩增。50μl反应体系为：5×HS Buffer 10μl；dNTP Mixture(2.5mM each)4μl；F引物(20μM)1μl；R引物(20μM)1μl；模板cDNA 1μl；HS DNA Polymerase 0.5μl；灭菌超纯水32.5μl。

反应条件为：98℃，3min；98℃，10s；55℃，15s；72℃，20s；30个循环；72℃，10min；16℃保存。

3)PCR产物回收：使用北京全式金生物技术公司的DNA纯化试剂盒(Easy Pure Quick Gel Extraction kit)并按照说明书操作步骤进行PCR产物的胶回收。

4)psiCheck2空载体的准备：利用北京全式金生物科技有限公司的质粒提取试剂盒(EasyPure Plasmid MiniPrep kit)并按照说明书操作步骤进行质粒提取，测定质粒的浓度，并跑胶验证质粒条带是否正确。

5)psiCheck2空载体与PRRSV基因片段进行酶切连接：将psiCheck2空载体和回收纯化的PRRSV基因片段，分别进行双酶切，在37℃水浴中反应4h。

20μl酶切反应体系为：酶1 1μl；酶2 1μl；Buffer 2μl；0.1％BSA 2.0μl；目的基因/质粒800ng；灭菌超纯水补足至20μl。

psiCheck2空载体与酶切产物的连接：将线性化psiCheck2载体与酶切片段分别进行胶回收，16℃连接2h。

连接体系为：10×T4DNA Ligase Buffer 2μl；psiCheck2 vector 3μl；酶切片段9μl；T4 DNA Ligase 1μl；灭菌超纯水5μl。

6)连接产物的转化：按照北京全式金生物技术有限公司的Trans10感受态细胞操作说明书，冰上融化100μl感受态细胞，加入10μl连接产物后，进行转化。

7)重组质粒的筛选、鉴定与保存：转化铺板后12h，挑取5个单克隆菌落分别接种于5ml含100μg/ml Amp⁺的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养8～12h。进行菌液PCR验证以及酶切鉴定。将菌液PCR和质粒酶切鉴定均正确的菌液送于Invitrogen公司进行基因测序。将测序的基因序列与NCBI上公布的序列进行比对，鉴定双萤光素酶报告基因载体是否成功构建。

3.利用双荧光素酶报告系统鉴定PRRSV-vsRNA1调控的靶基因：

1)双萤光素酶报告基因载体与所合成的模拟物共转染HEK293FT细胞。利用无内毒素质粒提取试剂盒对于测序正确的双萤光素酶报告基因载体进行质粒的抽提，测定浓度及纯度后，将所提取psiCheck2-nsp2质粒分别与人工合成的PRRSV-vsRNA1模拟物或对照模拟物共转染HEK293FT细胞。

转染试剂为罗氏公司的X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent，按照转染试剂的操作步骤进行转染。首先将细胞密度为80％左右的HEK293FT细胞用胰蛋白酶消化后铺板于48孔板。待细胞长至40-50％汇合度时进行转染，PRRSV-vsRNA1模拟物，NC(阴性对照)模拟物和MUT(突变对照)模拟物的浓度均设置为100nM，重组质粒浓度为50ng/μl。

2)双荧光素酶活性检测：使用Promega公司的双荧光素酶报告系统进行萤火虫和海肾荧光素酶活性检测。

依照说明书操作，用PBS清洗细胞后加入65μl 1×PLB(5倍稀释的passive lysis buffer)到48孔板的每一孔中；再将48孔板放置于平板振荡器上，室温剧烈振荡15min充分裂解细胞，收集于离心管中，12000g离心30s；取96孔酶标板，加入20μl细胞裂解上清液；于每孔中加入50μl LAR II后，延迟2s，读取6s萤火虫荧光素酶的酶活数值。

待萤火虫荧光素酶的酶活测定完之后，每孔加入50μl Stop&GLo试剂，延迟2s，读取6s读取海参荧光素酶的酶活数值。每个样品的海肾萤光素酶(Ranilla Luciferase)活性用萤火虫萤光素酶(Firefly Luciferase)值来校正。

图2可以看出共转染psiCheck2-nsp2载体和PRRSV-vsRNA1模拟物的处理组与共转染psiCheck2-nsp2载体和阴性对照模拟物或突变对照模拟物相比，萤光素酶相对活性存在显著下降，说明PRRSV-vsRNA1所作用的靶基因位于PRRSV NSP2区域。

PRRSV-vsRNA1-突变模拟物SEQ ID No.5UCAUAGUCUCUCGCAACACGU，阴性对照模拟物SEQ ID No.6AGCUGAUUUCGUCUUGGUA。

实施例3：在PAMs细胞中转染不同浓度的PRRSV-vsRNA1模拟物对PRRSV复制的影响

1.PRRSV-vsRNA1模拟物转染及细胞接毒：

1)铺板：从6周龄的仔猪肺脏组织中分离猪肺泡巨噬细胞，并进行细胞计数与铺板，于37℃5％CO2培养箱中培养；

2)转染：转染试剂为罗氏公司的X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent，按照转染试剂的操作步骤进行转染。铺板12h后配制转染混合液(模拟物与siRNA transfection reagent分别溶于Opti-MEM中，再将两者混合)室温孵育20min。将24孔板从温箱中取出，用PBS清洗后换成Opti-MEM，将混合物逐滴加入摇晃混匀，置于细胞培养箱中培养；

3)接毒：转染12h后接毒，以0.01MOI接种GD-HD PRRSV毒株，根据公式PFU＝细胞个数×MOI＝0.7×TCID₅₀计算所需的病毒液。将24孔板取出，用PBS清洗后，加入病毒稀释液，37℃培养1h后弃去所接病毒液，换为血清含量3％的1640培养基；

4)收样：感染后24hpi收取细胞以及细胞培养上清液，-80℃保存。细胞样品用于检测细胞中PRRSV ORF7基因的相对表达水平，细胞培养上清液用于检测释放到培养液上清中病毒基因组的拷贝数。

2.qRT-PCR检测PRRSV ORF7 mRNA相对表达水平：

1)提取细胞中的RNA并反转为cDNA，步骤同实施例2。

2)进行qRT-PCR检测，每个样品需要检测PRRSV ORF7和内参HPRT-1基因的mRNA表达量，步骤同实施例2。用Real-Time PCR System仪器的StepOne Software v2.3软件进行结果的分析。

qRT-PCR引物为：

SEQ ID No.7 PRRSV-ORF7-F：AGATCATCGCCCAACAAAAC；

SEQ ID No.8 PRRSV-ORF7-R：GACACAATTGCCGCTCACTA；

SEQ ID No.9 HPRT1-F：TGGAAAGAATGTCTTGATTGTTGAAG；

SEQ ID No.10 HPRT1-R：ATCTTTGGATTATGCTGCTTGACC。

图3可以看出，在PAMs细胞中转染10nM、30nM、60nM及100nM的PRRSV-vsRNA1模拟物后感染GD-HD毒株时，PRRSV ORF7的相对表达量在24hpi时，PRRSV ORF7的相对表达量与对照组相比分别下降了45％，83％，86％和92％。PRRSV-vsRNA1模拟物呈浓度依赖型抑制了PAMs细胞内PRRSV ORF7的表达。

3.qRT-PCR检测测定上清样品中PRRSV基因组拷贝数：

1)将步骤1中所收取的400ul的细胞培养上清液与1ml RNAiso Plus混合后进行裂解，提取RNA并溶于15μl的RNase-free水中；

2)配置反转录反应体系：为5×PrimeScript Buffer，2μl；RT Enzyme MixI，0.5μl；Oligo dT Primer(50μM)，0.5μl；Random Primer(100μM)，0.5μl；Total RNA，6.5μl。反转录的反应条件为：37℃，20min；85℃，5s；4℃；

3)制备阳性标准品(含有PRRSV ORF7基因片段的质粒标准品)：将PRRSV ORF7完整CDs区域(372bp)克隆入pMD-18T载体，转化至Top10感受态，提取质粒后测序鉴定，克隆步骤同实施例2。测定质粒DNA浓度，作为绝对定量的标准品，命名为pMD-18T-ORF7(初始浓度为5.5ng/μlμlμl)进行以10为倍数的梯度稀释，根据公式：拷贝数(copies)＝(质量/分子量)×6.0×10²³，计算不同稀释度标准品的拷贝数，形成qRT-PCR的标准曲线，用PRRSV-ORF7qRT-PCR引物进行检测，用Real time PCR分析仪分析数据，计算出每毫升细胞培养上清液中的PRRSV基因组拷贝数。

图4可以看出，在PAMs细胞中转染10nM、30nM、60nM及100nM的PRRSV-vsRNA1模拟物后感染GD-HD毒株24hpi时，PAMs细胞培养上清液中PRRSV基因组拷贝数与对照组相比分别下降了74％，82％，89％和97％。PRRSV-vsRNA1模拟物呈浓度依赖型抑制了PAMs细胞中PRRSV的增殖。

实施例4：在PAMs细胞中转染100nM PRRSV-vsRNA1模拟物在不同时间点对PRRSV复制的影响

1.PRRSV-vsRNA1模拟物转染及细胞接毒：

1)铺板转染及接毒同实施例3。

2)收样：分别于感染后0hpi，12hpi，24hpi以及36hpi收取细胞以及细胞培养上清液，-80℃保存。细胞样品用于qRT-PCR检测细胞中PRRSVORF7基因的相对表达水平，细胞培养上清液用于检测释放到培养液中病毒的滴度。

2.qRT-PCR检测PRRSV ORF7mRNA相对表达水平：1)提取细胞中的RNA并反转为cDNA，步骤同实施例2。2)进行qRT-PCR检测，每个样品需要检测PRRSV ORF7和内参HPRT-1基因的mRNA表达量，步骤同实施例3。

图5可以看出，在PAMs细胞中转染100nM的PRRSV-vsRNA1模拟物后感染GD-HD毒株时，PRRSV ORF7的相对表达量在12hpi,24hpi以及36hpi时分别下降了88％，90％和82％。PRRSV-vsRNA1模拟物在感染后对PRRSV的抑制作用至36小时。

3.TCID₅₀测定上清样品中PRRS病毒的滴度：

1)铺板：将胰酶消化好的MARC-145细胞加入适量的含有10％FBS的DMEM培养基，调整密度为1×10⁵个/ml，加到96孔细胞培养板中，使细胞长成单层；

2)在灭菌EP管中用无血清的DMEM培养基将所收取含有病毒的细胞上清液进行连续10倍稀释，从10^-1～10^-10，每个稀释要充分混合均匀；

3)按稀释度从高到低依次接种到MARC-145细胞中，每一稀释度接种一纵排8孔，每孔接种100μl，取两纵排为正常细胞对照；

4)从第二天开始逐日进行观察并记录结果，一般需要观察5～7天；

5)参照Reed-Muench方法对于TCID₅₀进行计算。

图6可以看出，在PAMs细胞中转染100nM的PRRSV-vsRNA1模拟物后感染GD-HD毒株时，细胞培养液上清中的病毒滴度在12hpi,24hpi以及36hpi时分别下降了0.88，1.75和0.83。PRRSV-vsRNA1模拟物在感染后对PRRSV的抑制作用至36小时。

以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。