一种人巨细胞病毒pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒阳性对照玻片的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术、诊断试剂领域，尤其设及一种人巨细胞病毒PP65抗原 血症免疫巧光法检测试剂盒阳性对照玻片的制备方法。
【背景技术】
[000引 人巨细胞病毒化uman cytomegalovirus, HCMV)属于人类瘤疹病毒0亚科病毒， 在人群中的感染极为普遍，呈世界性分布，血清流行病学调查表明，40%?100%成人HCMV 抗体阳性。研究表明，HCMV是人类先天性感染最常见的病原体之一，孕期的HCMV原发感染 危害较大，2/3先天性感染是由孕期原发感染造成的。在先天性感染中，90%的患儿不表现 临床症状，约有5%?10%受感染孕妇可造成流产、死胎、胎儿崎形、发育迟缓及迟发性中 枢神经系统缺陷等后果。此外，HCMV活动性感染也是器官移植失败和艾滋病患者继发感染 死亡的主要原因之一。
[0003] 目前临床上急需快速准确地诊断和监测HCMV感染状态的方法，在一些特定的人 群中尤为突出，比如器官移植手术中的供体和受体的选择；育龄妇女W及接受免疫抑制剂 治疗的人群等的筛查或监测。HCMV在免疫力正常人群中通常呈隐性感染，虽病毒复制受到 抑制，但有间歇性排毒现象存在。而在HCMV活动性感染中，病毒大量复制，可在血液，尿液， 脑脊液等体液中检测到活病毒。病毒分离是诊断HCMV活动性感染最重要的指标之一。但 是由于病毒自身的复制特点，病毒分离实验周期较长，约需2?4周时间。而且病毒分离本 身操作繁琐，对实验条件、设备及技术均具有较高的要求，不适用于临床对该病毒的及时监 测及诊断。市场现有的用于检测HCMV特异性IgM抗体的化ISA试剂因免疫抑制患者抗体 应答能力降低或抗体延迟出现，常导致检出率降低，出现假阴性。
[0004] 抗原血症指在血液中检测病原微生物特定的抗原，常用的方法有免疫巧光法和基 于磁珠的化学发光发法。HCMV pp65抗原血症指在外周血单核细胞或中性粒细胞中检测到 HCMVpp65抗原。该方法是由WIM Vander BIJ等1988年建立，CMV-10和CMV-11两株单抗 也是由该实验室制备。HCMV pp65是一种被膜蛋白，在病毒中含量较高，占完整病毒颗粒的 15%，在致密小体中高达90%。致密小体主要由病毒包膜包裹的被膜蛋白pp65形成。在有 蛋白合成抑制剂如放线菌酬存在下，病毒包膜和细胞膜融合后，病毒自身携带该蛋白进入 细胞后，即可用免疫巧光的方法检测到HCMV pp65抗原。有研究表明，在血液中检测到HCMV 抗原与病毒活动性感染有很好的一致性。因此HCMV pp65抗原血症已经成为一种检测HCMV 活动性感染新的"金标准"。目前，全球仅有荷兰IQ Pro化cts生产的"CMV Brite?化rbo Kit"获得了美国FDA的批准，用于临床检测，但还未进入我国市场。
[0005] HCMV pp65抗原血症免疫巧光法检测试剂盒的两大技术核屯、为制备pp65单克隆 抗体和阳性对照品（玻片）。由于制备pp65阳性对照品（玻片）的方法未见报道，本发明 旨在解决该一核屯、技术难题。已有通过EGFP示踪技术研究发现，单独转染pp65基因时的 其亚细胞定位和病毒感染时的该基因亚细胞定位截然不同现象：单独转染时pp65主要定 位在细胞质，而HCMV感染时pp65主要定位在细胞核。该就造成了采用基因工程技术单独 稳定转染pp65的细胞不适合做阳性对照品（玻片）。因此我们对pp65编码基因进行改造， 通过S轮PCR在其3'端加S个核定位信号，而且在核定位信号之前加上一个脯氨酸（Pro) 用来终止其可能存在的a螺旋结构。将改造后的pp65编码基因导入真核细胞时发现，其 已完全定位于细胞核。用该种改造后的细胞株制作的阳性品（玻片）辨识度更高，符合病 毒感染时的实际情况。另外，HCMV标准株AD169在实验室长期传代过程中，其基因组会发 生变异。通过对AD169株pp65编码基因与野毒株pp65编码基因的比对后我们发现，存在 多处的碱基突变（替换），该些突变分布在整个编码序列。如果该突变发生在与抗体结合表 位，将会导致制备的相应特异性抗体不能够与其相互反应。因此，我们采用临床分离株（TR 株）作为改造模版，避免了基因突变导致的抗原与抗体不能够结合的结果，保证了用于检 测时的可靠性和分辨率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对现有检测技术的不足及国外技术资料的封锁，自行研发构 建了一种稳定表达HCMV pp65抗原的细胞株，用作HCMV pp65抗原血症免疫巧光法检测试 剂盒的阳性对照品（玻片）。
[0007] 本发明的目的是通过W下方案实现的：
[000引一种人巨细胞病毒pp65抗原血症免疫巧光法检测试剂盒阳性对照玻片的制备方 法，其特征在于：将HCMV TR株的pp65编码基因改造、构建至真核表达载体PCDNA3. 1，再转 染至肥K293细胞，并筛选稳定转染细胞株用于制作pp65抗原血症检测试剂盒阳性对照玻 片。
[0009] 所述的一种人巨细胞病毒PP65抗原血症免疫巧光法检测试剂盒阳性对照玻片的 制备方法，其特征在于：对HCMV TR株的pp65编码基因改造通过如下方法实现：
[0010] (1)先W肥MV TR株pp65基因序列为模版，Wpp65化S-F和pp65化S-R1为引物进 行第一轮PCR;
[0011] 似再W第一轮PCR产物为模板Wpp65化S-F和pp65化S-R2为引物进行第二轮 PCR ；
[001引 （3)后W第二轮PCR产物为模板Wpp65化S-F和pp65化S-R3为引物进行第S轮 PCR ；
[0013] (4)将第S轮PCR产物通过化n I和化0 I限制性酶切位点连接至真核表达载体 pcDNAS. 1A ；
[0014] ^轮口0?循环引物如下；
[00巧]卵65化S-F ;CTCGAGATGGAGTCGCGCGGT
[0016] pp65 化 S-R1 ;TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCACCTCGGTGCTTTTTG
[0017] pp65化S-R2 ;TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTGGATCTACCTTTC
[0018] pp65化S-R3 ;GGTACCTCTAGATCCGGTGGATCCTACCTTTCTCTTTGGATCTACCTTTCTC。
[0019] 所述的一种人巨细胞病毒pp65抗原血症免疫巧光法检测试剂盒阳性对照玻片的 制备方法，其特征在于：包括W下步骤：
[0020] A、HCMV pp65编码基因的改造
[0021] --------------------------------------------------------
[00。] (1)根据Genebank中已公布的HCMV TR株pp65编码基因序列，设计S轮PCR引 物，通过S轮PCR循环在pp65编码基因的3'端加上S段核定位信号和一个脯氨酸；
[002引 S轮PCR循环引物如下；
[0024]卵65化S-F ;CTCGAGATGGAGTCGCGCGGT
[00 巧]pp65化S-R1 ;TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCACCTCGGTGCTTTTTG
[0026] pp65化S-R2 ;TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTGGATCTACCTTTC
[0027] pp65化S-R3 ;GGTACCTCTAGATCCGGTGGATCCTACCTTTCTCTTTGGATCTACCTTTCTC
[0028] S轮PCR循环指的是；先W肥MV TR株DM为模版，W PP65化S-F和pp65化S-Rl 为引物进行第一轮PCR。再W第一轮PCR产物为模板W PP65化S-F和pp65化S-R2为引物进 行第二轮PCR。最后W第二轮PCR产物为模板W PP65化S-F和pp65化S-R3为引物进行第S 轮 PCR;
[0029] (2)将第S轮PCR产物通过化n I和化0 I限制性酶切位点连接至真核表达载体 PCDNA3. 1A，构建的重组载体命名为PCDNA3. 1A-PP65化S ;
[0030] B、pp65稳转细胞株的构建
[0031] (1)转染
[0032] 转染前一天将肥K293细胞1 X 105个/ml铺于六孔板中，每孔2ml ;转染时在 e卵endcxrf管中加入150 y 1 DMEM培养液，加入重组质粒2 y g混匀，再加入Promega公司 转染试剂化GE肥皿Transfection Reagent 4 yl混匀，室温放置15min后加入六孔板的 一个孔中，轻轻晃动六孔板，使复合物均匀分散开来，然后至于37°C，5% C〇2培养箱中培养 4她；
[0033] 似筛选
[0034] 步骤（1)的培养结束后，弃去六孔板中培养液，PBS洗漆2次，换成含G-418400ng/ ml的DMEM完全培养基，每隔3天弃去旧培养基和死细胞，换新的含有G-418400ng/ml的 DMEM完全培养基，持续进行上述药物筛选培养2-3周直到明显的细胞集落形成；
[00对 做扩大培养
[0036] 将六孔板中的细胞集落消化下来，转移到25cm2的细胞培养瓶中，继续使用含有 G-418400ng/ml的DMEM完全培养基进行培养，待细胞长满后传代至更大面积的细胞培养 瓶，同时降低G4-18浓度至20化g/ml ;
[0037] (4)细胞冻存
[003引扩大培养后冻存一定数量的种子细胞，即获得稳定转染的细胞备用；
[0039] C、稳定转染细胞株的鉴定
[0040] (1)免疫巧光法鉴定
[0041] 将稳定转染的细胞铺于六孔板中，待其长满后先用PBS洗漆2次，4%多聚甲醒固 定15111；[]1，1%曲拉通37°[穿透15111；[]1，20%小牛血清封闭3〇111；[]1;-抗为油cam公司pp65单 克隆抗体1 ;20稀释，37°C解育化，PBS洗漆S次，每次5min ;二抗为Life公司Alexa Fluor 488conjugated羊抗鼠IgG 1:1000倍稀释，室温解育30min，同时采用DAPI衬染；
[0042] (2) Western blot 鉴定
[0043]