蒸发待干时每孔补加100 y 1 4%的多聚甲醒，固 定15min。干燥后保存于-80°C。该玻片即为HCMVpp65抗原血症阳性玻片。
[0083] 图1为用PCR方法对HCMV TR株pp65编码基因进行改造结果，其中泳道1为第一 轮PCR结果，泳道2为第二轮PCR结果，泳道3为第S轮PCR结果；
[0084] 图2为改造后的pp65编码基因连接至真核表达载体PCDNA3. 1A酶切结果，其中泳 道1为酶切之前的结果，泳道2为化0 I单酶切结果，泳道3为化n I单酶切结果，泳道4 为化0 I和化n I双酶切结果；
[0085] 图3为改造后的HCMV pp65编码基因连接至真核表达载体pcDNA3. lA重组质粒测 序结果；
[0086] 图4为转染改造后pp65编码基因的肥K293细胞免疫巧光鉴定结果，其中A为转 染了改造后pp65编码基因的肥K293细胞，可见其表达目的蛋白，而且可W被商品化的pp65 单抗识别，B为正常肥K293细胞，不表达目的蛋白；
[0087] 图5为转染改造后pp65编码基因的肥K293细胞Western blot鉴定结果。其中 泳道1为转染了改造后pp65编码基因的肥K293细胞，可见其表达目的蛋白，而且可W被商 品化的pp65单抗识别，条带大小与预测相符合。泳道2为正常肥K293细胞，不表达目的蛋 白；
[008引图6为本发明制备pp65抗原血症阳性玻片的实际工作效果和国外某公司pp65抗 原血症阳性对照玻片的对比。其中A为本发明制备的阳性对照玻片，B为国外某公司pp65 抗原血症阳性对照玻片。
[0089] 本实施例所制备的HCMV pp65抗原血症阳性玻片与荷兰IQ公司pp65抗原血症检 测试剂盒中阳性对照玻片各十张，针对每张玻片细胞总数、阳性细胞数、涂片面积等项目比 较结果如下：
[0090]
【主权项】
1. 一种人巨细胞病毒PP65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒阳性对照玻片的制备方 法，其特征在于：将HCMV TR株的pp65编码基因改造、构建至真核表达载体pcDNA3. 1，再转 染至HEK293细胞，并筛选稳定转染细胞株用于制作pp65抗原血症检测试剂盒阳性对照玻 片。
2. 根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒阳 性对照玻片的制备方法，其特征在于：对HCMV TR株的pp65编码基因改造通过如下方法实 现： (1) 先以HCMV TR株pp65基因序列为模版，以pp65NLS-F和pp65NLS-Rl为引物进行第 一轮 PCR ; (2) 再以第一轮PCR产物为模板以pp65NLS-F和pp65NLS-R2为引物进行第二轮PCR ; (3) 后以第二轮PCR产物为模板以pp65NLS-F和pp65NLS-R3为引物进行第三轮PCR ; (4) 将第三轮PCR产物通过命/? /和通〇 /限制性酶切位点连接至真核表达载体 pcDNA3. IA ； 三轮PCR循环引物如下： pp65NLS-F ：CTCGAGATGGAGTCGCGCGGT pp65NLS-Rl ：TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCACCTCGGTGCTTTTTG pp65NLS-R2 ：TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTGGATCTACCTTTC pp65NLS-R3 ：GGTACC TCTAGATCCGGTGGATCCTACCTTTCTCTTTGGATCTACCTTTCTC。
3. 根据权利要求I所述的一种人巨细胞病毒pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒阳 性对照玻片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： A、 HCMV pp65编码基因的改造 (1) 根据Genebank中已公布的HCMV TR株pp65编码基因序列，设计三轮PCR引物，通 过三轮PCR循环在pp65编码基因的3'端加上三段核定位信号和一个脯氨酸； 三轮PCR循环引物如下： pp65NLS-F ：CTCGAGATGGAGTCGCGCGGT pp65NLS-Rl ：TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCACCTCGGTGCTTTTTG pp65NLS-R2 ：TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTGGATCTACCTTTC pp65NLS-R3 ：GGTACC TCTAGATCCGGTGGATCCTACCTTTCTCTTTGGATCTACCTTTCTC 三轮PCR循环指的是：先以HCMV TR株DNA为模版，以pp65NLS-F和pp65NLS-Rl为引 物进行第一轮PCR; 再以第一轮PCR产物为模板以pp65NLS-F和pp65NLS-R2为引物进行第二轮PCR; 最后以第二轮PCR产物为模板以pp65NLS-F和pp65NLS-R3为引物进行第三轮PCR ; (2) 将第三轮PCR产物通过命/? /和通〇 /限制性酶切位点连接至真核表达载体 pcDNA3. 1A，构建的重组载体命名为pcDNA3. lA-pp65NLS ; B、 pp65稳转细胞株的构建 (1)转染 转染前一天将HEK293细胞I X IO5个/ml铺于六孔板中，每孔2ml ;转染时在印pendorf 管中加入150 μ I DMEM培养液，加入重组质粒2 μ g混匀，再加入Promega公司转染试剂 FuGENE HD Transfection Reagent 4 μ 1混勾，室温放置15min后加入六孔板的一个孔中， 轻轻晃动六孔板，使复合物均匀分散开来，然后至于37°C，5%C02培养箱中培养48h ; (2) 筛选 步骤（1)的培养结束后，弃去六孔板中培养液，PBS洗涤2次，换成含G-418 400ng/ ml的DMEM完全培养基，每隔3天弃去旧培养基和死细胞，换新的含有G-418 400ng/ml的 DMEM完全培养基，持续进行上述药物筛选培养2-3周直到明显的细胞集落形成； (3) 扩大培养 将六孔板中的细胞集落消化下来，转移到25cm2的细胞培养瓶中，继续使用含有G-418 400ng/ml的DMEM完全培养基进行培养，待细胞长满后传代至更大面积的细胞培养瓶，同时 降低G4-18浓度至200ng/ml ; (4) 细胞冻存 扩大培养后冻存一定数量的种子细胞，即获得稳定转染的细胞备用； C、 稳定转染细胞株的鉴定 (1) 免疫荧光法鉴定 将稳定转染的细胞铺于六孔板中，待其长满后先用PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定 15min，1%曲拉通37°C穿透15min，20%小牛血清封闭30min ;-抗为abeam公司pp65单克 隆抗体1 :20稀释，37°C孵育2h，PBS洗涤三次，每次5min ;二抗为Life公司Alexa Fluor 488 conjugated羊抗鼠 IgG 1:1000倍稀释，室温孵育30min，同时采用DAPI衬染； (2) Western blot 鉴定 将稳定转染的细胞铺于六孔板中，待其长满后先用PBS洗涤2次；将含有ImM PMSF的 RIPA裂解液150 μ 1滴加入六孔板的一个孔，晃动六孔板，使蛋白裂解液均匀覆盖细胞，冰 上裂解30min，期间每隔5min晃动六孔板一次，使蛋白裂解液均匀覆盖细胞，收集裂解液于 eppendorf管中，加等体积的2 X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混勾，沸水中煮5min，得到制备 好的蛋白样品用15%的SDS-PAGE进行电泳分离，然后转印到PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉 封闭后，一抗为abeam公司pp65单克抗体I :1000稀释，4°C孵育过夜，TPST洗涤三次，每次 5min，二抗为中杉金桥HRP标记的羊抗鼠 IgGl :5000稀释，室温孵育lh，最后TPST洗涤三 次，每次5min，ECL法进行曝光； D、 阳性玻片的制备 准备两瓶细胞，一瓶为稳定转染PP65的，一瓶为正常HEK293细胞；将稳定转染的细胞 消化后，并用PBS重悬，细胞计数后调节细胞浓度为5000个/ml ;将正常HEK293细胞消化后 并用PBS重悬，细胞计数后调节细胞浓度为5 X IO7个/ml ;取Iml稳定转染的细胞与4ml正 常细胞混合均匀，在玻片上涂有疏水性材料形成的直径约Icm的小孔中均匀涂布50 μ 1混 合细胞，将玻片置于风机下，水分蒸发待干时每孔补加100 μ 1 4%的多聚甲醛，固定15min， 干燥后保存于-80 °C，该玻片即为HCMV pp65抗原血症阳性玻片。
4. 根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒阳 性对照玻片的制备方法，其特征在于：一种权利要求2所述改造后的HCMV pp65氨基酸序列 如SEQ No. 1所示。
5. 根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒 阳性对照玻片的制备方法，其特征在于：所述改造后的HCMV pp65核苷酸编码序列如SEQ No. 2所示。
6. 根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒阳 性对照玻片的制备方法，其特征在于：HCMVpp65抗原血症检免疫荧光法测试剂盒阳性对照 玻片所用PP65阳性细胞为转染了所述表达改造后的HCMV pp65真核表达载体。
7. 根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒阳 性对照玻片的制备方法，其特征在于：所述的HCMV TR株pp65基因序列的Genebank登陆号 为：KJ743149。
【专利摘要】本发明公开了一种人巨细胞病毒pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒阳性对照玻片的制备方法。涉及稳定转染HCMV？pp65编码基因的细胞株构建，以及用于HCMV？pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒。所述方法包括采用基因工程方法对HCMV？TR株pp65编码基因进行改造，在其3’端加上三个核定位信号、将改造后的pp65编码基因连接至真核表达载体pcDNA3.1A、将重组表达载体转入HEK293（人胚肾）细胞并筛选稳定转染细胞、将该稳定转染细胞与为转染HEK293细胞按一定比例混合用于制备阳性对照玻片。
【IPC分类】G01N33-569, C12N15-38, C12N5-10, C12N15-85
【公开号】CN104569388
【申请号】CN201510016199
【发明人】王明丽, 张文昌, 刘峰
【申请人】王明丽, 安徽博睿生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月13日