专利名称：一种从松针中制备酪氨酸酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种从松针中制备酪氨酸酶抑制剂的方法，更具体地说涉及一种以雪松松针为原料提取生物活性成分的方法，属于化学化工技术领域。
背景技术：
酪氨酸酶(EC I. 14. 18. I)广泛存在于自然界中，是催化酪氨酸氧化成多巴、多巴氧化成多巴醌反应的含铜酶。酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶。黑色素是色素沉着聚合物的一种，在人体和动物的皮肤、眼睛和毛发中都有分布。黑色素的过量会导致一系列疾病，包括皮肤癌、雀斑、褐斑病、老年斑，这不仅影响了人们的美观，更严重的是黑色素细胞的大量增殖而导致的黑色素瘤已成为严重威胁人类生命健康的重大疾病之一。同时，酪氨 酸酶是果蔬酶促褐变的重要酶。在食品加工过程中，果蔬中的多酚类物质与空气中的氧气在酪氨酸酶(又称多酚氧化酶，ΡΡ0)的催化下反应生成邻醌类化合物，随后，邻醌继续将多酚类物质氧化成羟基醌，羟基醌最终聚合成黑褐色的黑色素物质，它严重影响果蔬的质量品质。因此，从天然植物中提取新的高效、低毒的酪氨酸酶抑制剂是国内外的研究热点。雪松(Cedrus deodara)，又名喜马拉雅雪松，是裸子植物门、松科、雪松属植物，在我国广泛栽培。雪松不仅可作为优良的木材资源，也是常见的绿化树木。松针是松属植物的叶，《本草纲目》中记载松针气味苦、温，无毒，久服令人不老，轻身益气，主治风湿疮，生毛发，安五脏，守中，不饥延年。在传统中医医学中，松针的药理功效包括祛风活血、明目安神、解痛止痒，能治疗流行性感冒、风湿关节痛、高血压多种疾病。其它研究表明，松针具有镇痛抗炎、镇咳止喘、调血脂、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤和抑菌的多种药理作用。此外，松针也被广泛的应用于食品香料、饮料中，如松针酒、松针粉和松针茶。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种从松针中制备酪氨酸酶抑制剂的方法，其特点是原料来源广、工艺简单、操作方便、抑制效率高。本发明的目的由以下技术实施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。从松针中制备酪氨酸酶抑制剂的方法包括以下步骤(I)将干雪松松针粉碎，平均粒度为400 600μπι，按料液比Ig : 10 50ml，优选为Ig : 20 30ml加入浓度40 80%，优选为加入浓度50 70%的甲醇作为提取剂，在室温下震荡36 48h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得甲醇浸膏，得率为15 25% ；(2)将上述甲醇浸膏分散于蒸馏水中，料液比为Ig 10 30ml，优选为Ig 15 20ml，然后按体积比I : 2 4加入醋酸乙酯震荡萃取2 3次，收集水相萃取物；(3)将上述水相萃余物浓缩至20 30ml，上反相树脂SciBioChem MCI-GEL (重量为80g)层析柱，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、20%、40%、100%甲醇，洗脱流速为I 2ml/min,优选流速为lml/min,收集具有活性的40%甲醇洗脱峰；(4)将上述具有活性的40%甲醇洗脱峰的组分浓缩到10 15ml,上SephadexLH-20 (重量为IOOg)层析柱，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、50%、100%甲醇，洗脱流速为I 2ml/min,优选流速为lml/min,收集具有活性的50%甲醇洗脱峰；(5)将上述具有活性的50%甲醇洗脱峰的组分浓缩到10 15ml，上反相树脂SciBioChem MCI_GEL(重量为IOOg)层析柱，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、10%、20%、30%、50%、100·%甲醇，洗脱流速为I 2ml/min，优选流速为lml/min，收集具有活性的30%甲醇洗脱峰，浓缩干燥后得到酪氨酸酶抑制剂有效成分，得率为O. 5 2% (活性组分重量/步骤I中甲醇总提取物重量)。从雪松松针中制备酪氨酸酶抑制剂的方法制备得到的酪氨酸酶抑制剂有效组分。所述酪氨酸酶抑制剂的有效组分用于抗食品褐变、预防和治疗黑色素合成异常而导致人体色素沉着性疾病及美白化妆品。性能测试通过高效液相色谱对上述步骤(5)中活性洗脱峰进行成分分析，结果详见图I所
/Jn ο结果表明上述步骤(5)的活性组分中主要含有多酚类化合物；在浓度为50 μ g/ml时，对酪氨酸酶活性的抑制率达到56. 3%，IC50值为46. 7Pg/ml。高效液相色谱分析条件如下0DS-3色谱柱(04. 6X250mm, 5 μ m);流速，lml/min ；柱温，25°C;检测波长，254nm ;梯度洗脱液=Omin, 0%甲醇(O. 1%甲酸);lOmin，20%甲醇(O. 1%甲酸);20-40min，25% 甲醇(O. 1% 甲酸);50min，30% 甲醇(O. 1% 甲酸);60min，40% 甲醇(O. 1%甲酸)；70min,50% 甲醇(O. 1% 甲酸)；80min, 100% 甲醇(O. 1% 甲酸)。本发明具有如下优点(I)上述的松针提取物在制备活性植物多酚中的应用，具有原料来源广、工艺简单、操作方便、抑制效率高的优点；(2)抑制活性强。实验证明，利用本发明提供的方法获得的有效组分显示了很强的酪氨酸酶抑制活性，在浓度为50 μ g/ml时，对酪氨酸酶活性的抑制率达到56. 3%，IC5tl值为46.7 μ g/ml。
图I :为松针提取物酪氨酸酶活性抑制组分的高效液相色谱分析。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据发明的内容作出一些非本质的改进和调整。实施例I :(I)将IOg干雪松松针粉碎至平均粒度为600 μ m,然后用浓度50%的甲醇IOOml作为提取剂，在室温下震荡36h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得I. 6g甲醇浸膏，得率为16% ；
(2)将上述甲醇浸膏分散于16ml蒸馏水中，然后用32ml醋酸乙酯震荡萃取2次，收集水相萃取物；(3)将上述水相萃余物浓缩至20ml，上反相树脂SciBioChem MCI_GEL(重量为80g)层析柱，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、20%、40%、100%甲醇，洗脱流速为lml/min，收集具有活性的40%甲醇洗脱峰；(4)将上述具有活性的40%甲醇洗脱峰的组分浓缩到10ml，上S印hadex LH-20层析柱(重量为100g)，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、50%、100%甲醇，洗脱流速为lml/min，收集具有活性的50%甲醇洗脱峰；(5 )将上述具有活性的50%甲醇洗脱峰的组分浓缩到IOml，上反相树脂SciBioChem MCI-GEL层析柱(重量为100g)，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、10%,20%, 30%、50%、100%甲醇，洗脱流速为lml/min，收集具有活性的30%甲醇洗脱峰，浓缩干燥后得到白色固体20mg,得率为I. 2%。实施例2 (I)将IOg干雪松松针粉碎至平均粒度为500 μ m,然后用浓度60%的甲醇300ml
作为提取剂，在室温下震荡42h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得2. 3g甲醇浸膏，得率为23% ；·(2)将上述甲醇浸膏分散于46ml蒸馏水中，然后用138ml醋酸乙酯震荡萃取2次，收集水相萃取物；(3)将上述水相萃余物浓缩至25ml，上反相树脂SciBioChem MCI-GEU重量为80g)层析柱，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、20%、40%、100%甲醇，洗脱流速为I. 5ml/min,收集具有活性的40%甲醇洗峰；(4)将上述具有活性的40%甲醇洗脱峰的组分浓缩到12ml，上S印hadex LH-20层析柱(重量为100g)，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、50%、100%，洗脱流速为I. 5ml/min，收集具有活性的50%甲醇洗脱峰；(5)将上述具有活性的50%甲醇洗脱峰的组分浓缩到12ml，上反相树脂SciBioChem MCI-GEL层析柱(重量为IOOg)，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、10%、20%、30%、50%、100%甲醇，洗脱流速为I. 5ml/min，收集具有活性的30%甲醇洗脱峰，浓缩干燥后得到白色固体41mg，得率为1.8%。实施例3 (I)将IOg干雪松松针粉碎至平均粒度为400 μ m,然后用浓度70%的甲醇500ml
作为提取剂，在室温下震荡48h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得2. 5g甲醇浸膏，得率为25% ；(2)将上述甲醇浸膏分散于75ml蒸馏水中，然后用300ml醋酸乙酯震荡萃取2次，收集水相萃取物；(3)将上述水相萃余物浓缩至30ml，上反相树脂SciBioChem MCI-GEU重量为80g)层析柱，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、20%、40%、100%,洗脱流速为2ml/min，收集具有活性的40%甲醇洗脱峰；(4)将上述具有活性的40%甲醇洗脱峰的组分浓缩到15ml，上S印hadex LH-20层析柱(重量为100g)，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、50%、100%，洗脱流速为2ml/min，收集具有活性的50%甲醇洗脱峰；(5 )将上述具有活性的50%甲醇洗脱峰的组分浓缩到15ml，上反相树脂SciBioChe m MCI-GEL层析柱(重量为IOOg)，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、10%、20%、30%、50%、100%甲醇，洗脱流速为2ml/min，收集具有活性的30%甲醇洗脱峰，浓缩干燥后得到白色固体45mg,得率为I. 8%。由上述实施例中获得的酪氨酸酶活性抑制组分的高效液相色谱分析的结果详见图I所示。应用实例I由上述实施例中获得的松针提取物的酪氨酸酶抑制活性试验方法及结果如下取I. 5ml L-Dopa 溶液(I. 5mM)、0· 8ml 憐酸盐缓冲液(pH 6. 8,1OmM)、0· Iml 不同浓度受试物(溶于50% 二甲基亚枫)混匀，在25°C下放置5min。然后加入O. Iml酪氨酸酶溶液(100U/ml)，并在5分钟内测定475nm波段下的OD值变化。抑制百分率=[I-(受试物吸光度的变化值/酶活吸光度的变化值)]X 100%测试结果详见表I所示表I松针提取物对酪氨酸酶抑制活性
提取物浓度(pg/ml)500 250 125 50 25 IC50 (pg/ml)
酪―M酸I 抑制活性率(%) 95 85.1 61.4 56.3 37.4 46.权利要求
1.从松针中制备酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (1)将干雪松松针粉碎，平均粒度为400 600μ m,按料液比Ig : 10 50ml加入浓度40 80%的甲醇作为提取剂，在室温下震荡36 48h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得甲醇浸膏，得率为15 25% ； (2)将上述甲醇浸膏分散于蒸馏水中，料液比为Ig 10 30ml，然后按体积比I : 2 4加入醋酸乙酯震荡萃取2 3次，收集水相萃取物； (3)将上述水相萃物浓缩至20 30ml，上反相树脂SciBioChemMCI-GEL层析柱，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、20%、40%、100%甲醇，洗脱流速为I 2ml/min，收集具有活性的40%的甲醇洗脱峰； (4)将上述具有活性的40%甲醇洗脱峰的组分浓缩到10 15ml，上S印hadexLH-20层析柱，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、50%、100%甲醇，洗脱流速为I 2ml/min，收集具有活性的50%的甲醇洗脱峰； (5)将上述具有活性的50%甲醇洗脱峰的组分浓缩到10 15ml，上反相树脂SciBioChem MCI-GEL层析柱，用甲醇-水梯度洗脱，浓度为0%、10%、20%、30%、50%、100%甲醇，洗脱流速为I 2ml/min，收集具有活性的30%的甲醇洗脱峰，浓缩干燥后得到酪氨酸酶抑制剂有效成分，得率为O. 5 2%。
2.根据权利要求I所述从雪松松针中制备酪氨酸酶抑制剂的方法制备得到的酪氨酸酶抑制剂有效组分。
3.根据权利要求2所述酪氨酸酶抑制剂的有效组分用于抗食品褐变、预防和治疗黑色素合成异常而导致人体色素沉着性疾病及美白化妆品。
全文摘要
本发明公开了一种从松针中制备酪氨酸酶抑制剂的方法，其特点是将干松针粉碎，按料液比1g∶10～50ml加入浓度40～80%的甲醇，在室温下震荡、分离，将上清液浓缩干燥得甲醇浸膏；将浸膏分散于水中，加入醋酸乙酯萃取2～3次；将水相萃余物浓缩至20～30ml，上反相树脂层析柱，用浓度为0%、20%、40%、100%甲醇洗脱；将上述40%组分浓缩到10～15ml，上Sephadex LH-20层析柱，用浓度为0%、50%、100%甲醇洗脱；再将上述50%组分浓缩到10～15ml，上反相树脂层析柱，用浓度为0%、10%、20%、30%、50%、100%甲醇洗脱，收集30%甲醇洗脱峰，浓缩干燥后得到酪氨酸酶抑制剂有效成分，得率为0.5～2%。酪氨酸酶抑制的活性，在浓度为50μg/ml时，对酪氨酸酶活性的抑制率达到56.3%，IC50值为46.7μg/ml。
文档编号A61P17/00GK102872166SQ20121040584
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者高鸿, 梁雪, 钟凯, 黄毅娜, 祝瑞雪, 山口五十磨 申请人:四川大学