与常见型先天肠管无神经节细胞症发生相关的血浆miRNA标志物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程及临床医学领域，公开了与常见型先天肠管无神经节细胞症发生相关的血浆miRNA标志物及其应用。该标志物选自hsa-miR-31、hsa-miR-147和hsa-miR-206中的多种。该标志物对常见型先天肠管无神经节细胞症具有特异性和敏感性，可用于制备常见型先天肠管无神经节细胞症诊断或监测的试剂，可避免侵入性诊断，并可在早期进行筛查和诊断，可反复检测并易于动态监测。
【专利说明】与常见型先天肠管无神经节细胞症发生相关的血浆miRNA标志物及其应用
发明领域
[0001]本发明属于基因工程及临床医学领域，涉及与常见型先天肠管无神经节细胞症发生相关的血衆微小核糖核酸(microRNA, miRNA)标志物及其应用。
【背景技术】
[0002]常见型先天肠管无神经节细胞症(NCA)是小儿外科常见的消化道畸形，在先天性消化道畸形的发生中仅次于先天性肛门直肠畸形。CA以消化道远端神经节细胞缺如为主要特征，主要表现为肠神经系统发育过程中肠神经迁移障碍或迁移后发育异常，从而导致远端肠管神经节细胞缺如，远端肠管功能受限，最终以排便困难，腹胀及肠梗阻为主要临床症状。CA根据其狭窄段的长短主要分为短段型、常见型、长段型及全结肠型。其中，NCA是指肠管病变段位于肛门口开始至乙状结肠远端。基于NCA的高发病率，病情相对较轻，良好预后的基础，本发明以此型作为研究对象。目前我国统计NCA发病率约为1:3000，男女比大约为4:1，即每年有近一万的新生儿会出现该种出生缺陷。NCA的发病原因目前尚不完全明了，主要认为:在胚胎发育过程中，胚胎第5周神经母细胞开始沿迷走神经干由头侧向尾侧迁移，于胚胎第12周到达消化道远端，在此过程中任何原因导致神经母细胞迁移发生停顿即可造成远端肠管肠壁神经节细胞缺如。病理解剖提示直肠及远端结肠狭窄，近端肠管扩张，狭窄段肠壁黏膜下层及黏膜肌层神经节细胞缺如。狭窄段肠壁胆碱能受体及肾上腺能β受体含量较正常肠段减少，导致肠管及内括约肌痉挛，并且缺乏正常的肠蠕动，因此会形成功能性肠梗阻。长期慢性肠梗阻导致患儿食欲下降、营养吸收障碍、生长发育迟缓、贫血等，严重者引起小肠结肠炎、肠穿孔及多器官功能衰竭，危及患儿生命，给患儿及其家庭带来严重后果。
[0003]NCA患儿治疗多`需手术，并且就目前来说手术是解决患儿临床症状的根治办法。但在临床工作中仍然会面临很多困难，特别是手术时机如何选择等。而新生儿常见型先天肠管无神经节细胞症的诊断相当困难，结合其临床表现:不排胎便及胎便排出延迟合并腹胀、梗阻、呕吐，直肠指检伴有气便排出，需考虑该疾病诊断，同时需对患儿进行一系列辅助检查如:χ线，钡剂灌肠检查，肛门直肠测压，酶组织化学检查及活检等。以上辅助检查可以帮助诊断该疾病，但尚存在一些缺陷，如检查价格昂贵、射线辐射危险，操作繁琐且有一定的创伤性及风险。这都给患儿带来极大的痛苦并且给家庭带来严重的经济负担。更为重要的是，这类检查均基于不排胎便及胎便排出延迟等临床症状，而出现此类症状往往已在患病后数日常错过了最佳的早期手术时机，并给患儿带来了相当长时间的痛苦，寻找一种简单、准确、微创的早期常见型先天性肠管无神经节细胞症诊断方法意义重大。
[0004]微小核糖核酸(microRNA,即miRNA)是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在转录后水平对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA已逐渐成为调控mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。现在预测miRNA至少能调控数千个人类基因，占所有基因的30%以上。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现。目前，miRNA与肿瘤的关系已成为研究的重点，已发现若干miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。然而，血浆miRNA与常见型先天肠管无神经节细胞症等人类出生缺陷的相互关系尚未见报道。
[0005]最新的研究成果发现血浆中存在上百种的miRNA，性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血浆miRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋，血浆miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。该研究迅速引起国际媒体的广泛关注，路透社、合众社、《科学的美国人》、美国《技术评论》等都对该研究成果进行了专门报道，《Nature》杂志也在其网站首页的“最新研究进展”专栏中展示了这一最新研究进展。然而血浆中miRNA在常见型先天肠管无神经节细胞症早期诊断监测中的应用还未 得到相应的关注，若能发现稳定的与常见型先天肠管无神经节细胞症发病相关的特异血浆miRNA作为生物标志物，并研发相应疾病的诊断、监测试剂盒，不仅能创造令人瞩目的经济效益，对我国出生缺陷的防治也将是一次强有力的推动。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为常见型先天肠管无神经节细胞症发生提供相关的血浆microRNA标志物。
[0007]本发明的另一个目的是为上述血浆microRNA标志物提供引物。
[0008]本发明还有一个目的是为含有上述血浆提供microRNA标志物或其引物的应用。
[0009]本发明再有一个目的是为含有上述血提供浆microRNA标志物或其引物的用于常见型肠管无神经节细胞症诊断或监测的试剂盒。
[0010]本发明的目的是通过下列技术措施实现的:
[0011]与常见型先天肠管无神经节细胞症相关的血浆microRNA标志物，选自hsa-miR-31、hsa-miR-147 和 hsa-miR-206 中的多种。
[0012]所述的血衆microRNA 标志物由 hsa-miR-31、hsa-miR-147 和 hsa-miR-206 构成。
[0013]所述的血浆microRNA标志物，其中hsa-miR-31 的序列为 AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU(SEQ ID N0.1), hsa-miR-147 的序列为 GUGUGUGGAAAUGCUUCUGC (SEQ ID N0.2),hsa-miR-206 的序列为 UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG (SEQ ID N0.3)。
[0014]所述的血浆microRNA标志物的引物，其中序列为SEQ ID N0.1的标志物的上游引物为SEQ ID N0.4，下游引物为SEQ ID N0.5 ;序列为SEQ ID N0.2的标志物的上游引物为SEQ ID N0.6，下游引物为SEQ ID N0.7 ;序列为SEQ ID N0.3的标志物的上游引物为SEQID N0.8，下游引物为 SEQ ID N0.9。
[0015]所述的血浆microRNA标志物或其引物在制备常见型先天肠管无神经节细胞症诊断或监测试剂中的应用。所述试剂是能够测定这些血浆microRNA标志物在血浆中表达量的试剂。
[0016]一种常见型肠管无神经节细胞症诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述血浆microRNA 标志物(hsa-miR-31、hsa-miR-147 和 hsa-miR-206 中的多种)的引物。
[0017]所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述引物(SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9)中的多对。
[0018]所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有下列3对引物SEQ ID N0.4和SEQ IDN0.5，SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9。
[0019]试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
[0020]本发明详细描述如下:
[0021]本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并米用了 RT-PCR方法、Taqman miRNA Array>Real-time PCRCTaqman探针和染料法)方法的一种或几种进行检测。
[0022]具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分:
[0023]一、研究对象选择和分组依据
[0024]A组:健康对照组(n=100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群验证):
[0025]1.年龄在O至6月间；
[0026]2.无消化系统疾病；
[0027]3.无其它先天`畸形；
[0028]4.无其他全身性重大疾病。
[0029]B组:常见型先天肠管无神经节细胞症组(n=100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群验证):
[0030]1.年龄在O至6月间；
[0031]2.经钡剂灌肠、结肠测压、术后病理证实病变段位于从肛门口至乙状结肠远端；
[0032]3.排除短段型，长段型及全结肠型病变的患儿；
[0033]4.无其他伴随先天畸形；
[0034]5.无其它消化系统疾病；
[0035]6.无其他全身性重大疾病。
[0036]二、血液血浆分离及前处理
[0037](I)新鲜肝素抗凝血5ml于离心机3000rpm离心5min,取上清每100 μ I分装至洁净1.5ml EP管中。
[0038](2)向EP管中加入900 μ I Trizol，充分混匀后，12000转离心15min，立即取上清至一洁净1.5ml EP管中。
[0039](3)向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，1000Orpm离心15秒,弃下层废液。
[0040](4)在离心柱上加入700 μ I RffT缓冲液，1000Orpm离心15秒，弃下层废液。
[0041](5)在离心柱上加入500 μ I RPE缓冲液，1000Orpm离心15秒，弃下层液。重复一遍。
[0042](6)将离心柱加入一个新的2ml的管子，1000Orpm离心I分钟，用于去除RPE缓冲液。
[0043](7)将离心柱装在一个新的1.5ml的离心管中，并在柱子上加入50 μ IDEPC处理的水，离心I分钟。[0044](8)_70°C保存处理后的样本。
[0045]本发明实验中使用的离心柱和配套试剂(RWT缓冲液、RPE缓冲液)均来自QiagenmiRNeasy Mini Kit (货号217004)这个试剂盒,下同。
[0046]三、Real-time PCR方法测量血浆miRNAs表达量
[0047]1.取经前处理的血浆，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。
[0048]按下表所示配制反转录体系:
[0049]
【权利要求】
1.与常见型先天肠管无神经节细胞症发生相关的血浆micix)RNA标志物，选自hsa-miR-31、hsa-miR-147 和 hsa-miR-206 中的多种。
2.根据权利要求1所述的血衆microRNA标志物，其特征在于由hsa-miR-31、hsa-miR-147 和 hsa-miR-206 构成。
3.根据权利要求1或2所述的血衆microRNA标志物,其特征在于hsa-miR-31的序列为 SEQ ID N0.1，hsa-miR-147 的序列为 SEQ ID N0.2，hsa-miR-206 的序列为 SEQ ID N0.3。
4.权利要求3所述的血浆microRNA标志物的引物，其特征在于序列为SEQID N0.1的标志物的上游引物为SEQ ID N0.4，下游引物为SEQ ID N0.5 ;序列为SEQ ID N0.2的标志物的上游引物为SEQ ID N0.6，下游引物为SEQ ID N0.7 ;序列为SEQ ID N0.3的标志物的上游引物为SEQ ID N0.8，下游引物为SEQ ID N0.9。
5.权利要求1或2所述的血浆microRNA标志物在制备常见型先天肠管无神经节细胞症的诊断或监测试剂中的 应用。
6.权利要求4所述的引物在制备常见型先天肠管无神经节细胞症诊断或监测试剂中的应用。
7.—种常见型先天肠管无神经节细胞症诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1或2所述的血浆microRNA标志物的引物。
8.根据权利要求7所述的诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求4所述引物中的多对。
9.根据权利要求8所述的诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有下列3对引物SEQ ID N0.4和 SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.6和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8和 SEQ ID N0.9。
【文档编号】C12N15/113GK103805603SQ201410025928
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2014年1月20日
【发明者】唐维兵, 唐俊伟, 陆春城, 吴炜, 秦晶晶, 李波, 周志刚, 刘康 申请人:南京医科大学附属南京儿童医院