用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸的制作方法

用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于多核苷酸、初级转录物和mmRNA分子的制备、制造和治疗用途的组合物和方法。
【专利说明】用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核 苷酸
[0001] 序列表参考
[0002] 本申请连同序列表以电子格式一同提交。名称为M300PCTSQLST. txt的序列表文 件在2013年3月9日创建并且大小为49, 417, 315字节。所述序列表的电子格式中的信息 以引用的方式整体并入本文。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求以下各项的优先权：2012年8月10日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides 的美国临时专利申请号61/681，742、2012年12月14日提交的名称为Terminally Optimized Modified RNAs的美国临时专利申请号61/737,224、2012年12月14日提交的 名称为 Modified Nucleoside，Nucleotide，and Nucleic Acid Compositions 的国际申请 号 PCT/US2012/069610、2012 年 4 月 2 日提交的名称为 Modified Polynucleotides for the Production of Biologies的美国临时专利申请号61/618,862、2012年8月10提交 的名称为 Modified Polynucleotides for the Production of Biologies 的美国临时专 利申请号 61/681，645、2012 年 12 月 14 日提交的名称为 Modified Polynucleotides for the Production of Biologies的美国临时专利申请号61/737, 130、2012年4月2日提交 的名称为 Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies 的美国临时专 利申请号 61/618, 866、2012 年 8 月 10 提交的名称为 Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies的美国临时专利申请号61/681，647、2012年12月14日提交 的名称为 Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies 的美国临时专 利申请号 61/737, 134、2012 年 4 月 2 日提交的名称为 Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines的美国临时专利申请号61/618,868、2012年8月10提交的名 称为 Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines 的美国临时专利申 请号 61/681，648、2012 年 12 月 14 日提交的名称为 Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines的美国临时专利申请号61/737, 135、2012年4月2日提交的名 称为 Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides的美国临时专利申请号61/618,870、2012年8月10日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides 的美国 临时专利申请号61/681，649、2012年12月14日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides 的美国临时专利申请号 61/737, 139、2012年4 月 2 日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins的美国临时专利申请号61/618,873、2012年8月10日提交的名 称为 Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins 的美国临 时专利申请号61/681，650、2012年12月14日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins 的美国临时专利申请号 61/737, 147、2012 年 4 月 2 日提交的名称为 Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins的美国临时专利申请号61/618,878、2012年8月10提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins的美国 临时专利申请号61/681，654、2012年12月14日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins的美国临时专利申请号61/737, 152、 2012年4月2日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins的美国临时专利申请号61/618, 885、2012年8 月10日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins的美国临时专利申请号61/681，658、2012年12月14日 提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins的美国临时专利申请号61/737, 155、2012年4月2日提交的名称 为Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins的美国临时专利申请号61/618, 896、2012年7月5日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins的 美国临时专利申请号61/668, 157、2012年8月10提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins的美国临时专利 申请号61/681，661、2012年12月14日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins的美国临时专利申请 号61/737, 160、2012年4月2日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins的美国临时专利申请号61/618,911、2012年8月10提 交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins的美国 临时专利申请号61/681，667、2012年12月14日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins的美国临时专利申请号61/737, 168、2012年4 月2日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins的美 国临时专利申请号61/618, 922、2012年8月10日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins的美国临时专利申请号61/681，675、2012年12月14 日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins的美国临 时专利申请号61/737, 174、2012年4月2日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美国临时专利申请号 61/618, 935、2012年8月10提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美国临时专利申请号61/681，687、2012 年12月14日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美国临时专利申请号61/737, 184、2012年4月2日提 交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美国临时专利申请号61/618,945、2012年8月10日提交的名称为 Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美国临时专利申请号61/681，696、2012年12月14日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的 美国临时专利申请号61/737, 191、2012年4月2日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美国临时专利 申请号61/618, 953、2012年8月10日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美国临时专利申请 号61/681，704、2012年12月14日提交的名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美国临时专利申请号 61/737,203、2012年4月2日提交的名称为Dosing Methods for Modified mRNA的美国临 时专利申请号61/618,961、2012年5月17日提交的名称为Dosing Methods for Modified mRNA的美国临时专利申请号61/648, 286,所述申请各自的内容以引用的方式整体并入本 文。
[0005] 本申请还涉及2012年10月3日提交的名称为Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof的国际公布号PCT/ US2012/58519和2012年12月14日提交的名称为Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions的国际公布号PCT/US2012/69610。
[0006] 本申请还涉及共同未决申请，所述共同未决申请各自在2013年3月9 日与本申请同时提交并且具有代理人案号M301. 20 (PCT/US13/XXXXX)，名称为 Modified Polynucleotides;代理人案号M304. 20 (PCT/US13/XXXXX)，名称为Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins;代理人案号M305. 20 (PCT/ US13/XXXXX)，名称为Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins ;代理人案号M306. 20 (PCT/US13/XXXXX)，名称为Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins;代理人案号M308. 20 (PCT/ US13/XXXXX)，名称为Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins ;代理人案号M309. 20 (PCT/US13/XXXXX)，名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins;代理人案号M310.20(PCT/US13/XXXXX)，名称为Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease； 代理人案号MNCL 20 (PCT/US13/XXXXX)，名称为Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides;以及代理人案号MNC2. 20 (PCT/US13/ XXXXX)，名称为Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides,所述申请各自的内容以引用的方式整体并入本文。 发明领域
[0007] 本发明涉及用于设计、制备、制造和/或配制多核苷酸、初级构建体以及修饰mRNA 分子（_RNA)的组合物、方法、过程、试剂盒以及装置。
[0008] 发明背景
[0009] 影响蛋白质表达的现有方法论存在多种问题。例如，引入的DNA可在一些频率下 整合到宿主细胞基因组DNA中，从而导致宿主细胞基因组DNA的改变和/或损伤。或者，弓丨 入到细胞中的异源脱氧核糖核酸（DNA)可由子代细胞（无论异源DNA是否整合到染色体 中）或由后代继承。此外，假设适当递送并且无损伤或整合到宿主基因组中，那么在制成编 码的蛋白质之前必须发生多个步骤。一旦在细胞内部，DNA必须被转运到细胞核中，在细胞 核中它被转录成RNA。从DNA转录的RNA然后必须进入细胞质，在细胞质中它被翻译成蛋白 质。从施用的DNA至蛋白质的多个加工步骤不仅在产生功能性蛋白质之前形成延迟时间， 而且每个步骤还意味着误差和对细胞造成损伤的机会。此外，已知难以在细胞中获得DNA 表达，因为DNA频繁进入细胞但不表达或不以合理的速率或浓度表达。当将DNA引入到原 代细胞或修饰细胞系中时，这尤其成问题。
[0010] 在二十世纪90年代初期，Bloom和同事通过将体外转录的加压素（vasopressin) mRNA注射至下丘脑中成功地拯救了加压素缺陷的大鼠（Science 255:996 - 998 ;1992)。然 而，低翻译水平和分子的免疫原性阻碍mRNA作为治疗剂的发展，并且自其之后的工作一直 集中于可相反采用这些缺陷的替代应用，即用编码癌症抗原的mRNA进行免疫。
[0011] 其他人研究了使用mRNA来递送目标多肽并且显示mRNA分子的某些化学修饰、特 别是假尿苷和5-甲基-胞嘧啶降低了免疫刺激作用。
[0012] 这些研究在以下中公开：例如Ribostem Limited于2003年7月9日提交（现 已放弃）的英国专利申请序号0316089. 2、2004年7月9日提交的公布为W02005005622 的PCT申请号PCT/GB2004/002981、2006年6月8日提交的公布为US20060247195(现 已放弃）的美国专利申请国家阶段进入序号10/563,897、以及2004年7月9日提交的 公布为EP1646714(现已撤回）的欧洲专利申请国家阶段进入序号EP2004743322中； Novozymes, Inc.于2007年12月19日提交的公布为W02008140615的PCT申请号PCT/ US2007/88060、2009年7月2日提交的公布为US20100028943的美国专利申请国家阶段 进入序号12/520, 072、以及2009年7月7日提交的公布为EP2104739的欧洲专利申请国 家阶段进入序号EP2007874376中；罗彻斯特大学（University of Rochester)于2006 年12月4日提交的公布为W02007064952的PCT申请号PCT/US2006/46120和2006年12 月1日提交的公布为US20070141030的美国专利申请序号11/606,995中；BioNTech AG 在2007年12月14日提交（现已放弃）的欧洲专利申请序号EP2007024312、2008年12 月12日提交的公布为W02009077134的PCT申请号PCT/EP2008/01059、2010年6月2日 提交的公布为EP2240572的欧洲专利申请国家阶段进入序号EP2008861423、2010年11月 24日提交的公布为US20110065103的美国专利申请国家阶段进入序号12/，735,060、2005 年9月28日提交的德国专利申请序号DE 10 2005 046 490、2006年9月28日提交的公 布为W02007036366的PCT申请PCT/EP2006/0448、2012年3月21日公布的国家阶段欧 洲专利EP1934345和2009年8月14日提交的公布为20100129877的国家阶段美国专利 申请序号11/992, 638;免疫疾病研究所有限公司（Immune Disease Institute Inc.)于 2011年4月15日提交的公布为US20120046346的美国专利申请序号13/088, 009和2011 年4月15日提交的公布为恥20110130624 的？(：1'申请？(：17^52011/32679;511丨代！11111^11 Genetic Therapeutics于2010年11月20日提交的公布为US20110244026的美国专利申 请序号12/957, 340中；Sequitur Inc.于1998年9月18日提交的公布为W01999014346 的 PCT 申请 PCT/US1998/019492 中；The Scripps Research Institute 于 2010 年 2 月 24日提交的公布为W02010098861的PCT申请号PCT/US2010/00567和2011年11月 3日提交的公布为US20120053333的美国专利申请国家阶段进入序号13/203,229中； Ludwig-Maximillians University 于 2010 年 7 月 30 日提交的公布为 W02011012316 的 PCT 申请号 PCT/EP2010/004681 中；Cellscript Inc.于 2008 年 6 月 30 日提交并且 2011 年10月18日授权的美国专利号8, 039, 214、美国专利申请序号2010年12月7日提交的 公布为 US20110143436 的 12/962, 498、2010 年 12 月 7 日提交的公布为 US20110143397 的 12/962, 468、2011 年 9 月 20 日提交的公布为 US20120009649 的 13/237, 451 以及 PCT 申请 2010年12月7日提交的公布为TO2011071931的PCT/US2010/59305和2010年12月7日 提交的公布为 W02011071936 的 PCT/US2010/59317 中；The Trustees of the University of Pennsylvania于2006年8月21日提交的公布为W02007024708的PCT申请号PCT/ US2006/32372和2009年3月27日提交的公布为US20090286852的美国专利申请国家阶 段进入序号11/990,646中；Curevac GMBH于德国专利申请序号2001年6月5日提交的 DElO 2001 027 283. 9、2001 年 12 月 19 日提交的 DElO 2001 062 480. 8 以及 2006 年 10 月31日提交的DE 20 2006 051 516(都已放弃）、欧洲专利号2005年3月30日授权的 EP1392341和2008年1月2日授权的EP1458410、PCT申请号2002年6月5日提交的公布 为 TO2002098443 的 PCT/EP2002/06180、2002 年 12 月 19 日提交的公布为 W02003051401 的 PCT/EP2002/14577、2007 年 12 月 31 日提交的公布为 TO2008052770 的 PCT/EP2007/09469、 2008 年4 月 16 日提交的公布为 TO2009127230 的 PCT/EP2008/03033、2005 年 5 月 19 日提交的公布为W02006122828的PCT/EP2006/004784、2007年1月9日提交的公布为 W02008083949的PCT/EP2008/00081、以及美国专利申请序号2003年12月5日提交的公 布为旧20050032730的10/729,830、2004年6月18日提交的公布为旧20050059624的 10/870, 110、2008 年 7 月 7 日提交的公布为 US20080267873 的 11/914, 945、2009 年 10 月 27日提交的公布为旧2010047261(现已放弃）的12/446,912、2010年1月4日提交的公 布为 US20100189729 的 12/522, 214、2010 年 5 月 26 日提交的公布为 US20110077287 的 12/787, 566、2010 年 5 月 26 日提交的公布为 US20100239608 的 12/787, 755、2011 年 7 月 18日提交的公布为US20110269950的13/185, 119以及2011年5月12日提交的公布为 US20110311472的13/106, 548中，所述专利都以引用的方式整体并入本文。
[0013] 尽管存在被限制于包括假尿苷和5-甲基-胞嘧啶的化学修饰的选择的这些报道， 但本领域中仍然需要用于解决围绕细胞内翻译的有效调节和编码多肽或其片段的核酸的 加工的大量障碍的治疗方式。
[0014] 为此，本发明人已证实某些修饰mRNA序列具有作为益处超过仅逃避、避免或减弱 免疫应答的治疗剂的潜力。这类研究详细描述于公布的共同未决申请国际申请2011年8 月 5 日提交的 PCT/US2011/046861 和 2011 年 10 月 3 日提交的 PCT/US2011/054636、2011 年10月3日提交的国际申请号PCT/US2011/054617中，所述申请的内容以引用的方式整体 并入本文。
[0015] 本发明通过提供基于核酸的化合物或多核苷酸来解决这种需要，所述多核苷酸编 码目标多肽（例如，修饰mRNA或mmRNA)并且具有避免本领域中的一个或多个问题的结构 和/或化学特征，例如适用于优化基于核酸的治疗剂的配制和递送且同时保持结构和功能 完整性、克服表达的阈值、改进表达速率、半衰期和/或蛋白质浓度、优化蛋白质定位并且 避免有害生物应答如免疫应答和/或降解途径的特征。
[0016] 发明概述
[0017] 本文描述用于设计、制备、制造和/或配制修饰mRNA(_RNA)分子的组合物、方法、 过程、试剂盒以及装置。
[0018] 本发明的各种实施方案的细节在以下描述中阐述。本发明的其他特征、目的和优 点将是从本发明的描述和附图以及权利要求清楚的。
[0019] 附图简述
[0020] 前述和其它目的、特征以及优点将是从如在附图中示出的本发明的具体实施方案 的以下描述清楚的，在附图中相同参考符号贯穿不同视图指代相同部分。附图未必按比例 绘制，而是将重点放在示出本发明的各种实施方案的原理上。
[0021] 图1是本发明的初级构建体的示意图。
[0022] 图2示出现有技术中适用于本发明的脂质结构。示出98N12-5(TETA5-LAP)、 DLin-DMA、DLin-K-DMA(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧杂环戊烷）、 DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA 以及 C12-200 的结构。
[0023] 图3是适用于本文教导的IVT反应中的代表性脂质体。脂质体包含由本发明人设 计的插入物64818。
[0024] 图4是封装于PLGA微球中的修饰mRNA的凝胶概况。
[0025] 图5是IX因子蛋白质产生PLGA制剂IX因子修饰mRNA的直方图。
[0026] 图6是示出在一系列剂量的修饰mRNA转染之后人角质形成细胞中的VEGF蛋白质 产量的直方图。图6A示出在包含天然核苷三磷酸（NTP)的修饰mRNA转染之后的蛋白质产 量。图6B示出在用假尿苷（假-U)和5-甲基胞嘧啶（5mC)完全修饰的修饰mRNA转染之 后的蛋白质产量。图6C示出在用Nl-甲基-假尿苷（NI-甲基-假-U)和5-甲基胞嘧啶 (5mC)完全修饰的修饰mRNA转染之后的蛋白质产量。
[0027] 图7是HEK293细胞中的VEGF蛋白质产量的直方图。
[0028] 图8是在外周血单核细胞（PBMC)中VEGF修饰mRNA转染之后的VEGF表达和 IFN-α诱导的直方图。图8A示出VEGF表达。图8B示出IFN-α诱导。
[0029] 图9是Hela细胞中来自VEGF修饰mRNA的VEGF蛋白质产量的直方图。
[0030] 图10是小鼠中来自脂质复合（Iipoplexed)VEGF修饰mRNA的VEGF蛋白质产量的 直方图。
[0031] 图11是Hela细胞中来自G-CSF修饰mRNA的G-CSF蛋白质产量的直方图。
[0032] 图12是小鼠中来自脂质复合G-CSF修饰mRNA的G-CSF蛋白质产量的直方图。
[0033] 图13是Hela细胞上清液中来自IX因子修饰mRNA的IX因子蛋白质产量的直方 图。
[0034] 图14是Hela细胞中来自APOAl野生型修饰mRNA、APOAlMiIano修饰mRNA或 APOAlParis修饰mRNA的APOAl蛋白质产量的直方图。
[0035] 图15是来自APOAl野生型修饰mRNA的APOAl蛋白质的凝胶概况。
[0036] 图16是来自APOAlParis修饰mRNA的APOAl蛋白质的凝胶概况。
[0037] 图17是来自APOAlMilano修饰mRNA的APOAl蛋白质的凝胶概况。
[0038] 图18是来自FGA修饰mRNA的纤维蛋白原a (FGA)蛋白质的凝胶概况。
[0039] 图19是Hela细胞上清液中来自纤溶酶原修饰mRNA的纤溶酶原蛋白质产量的直 方图。
[0040] 图20是来自纤溶酶原修饰mRNA的纤溶酶原蛋白质的凝胶概况。
[0041] 图21是来自GALT修饰mRNA的半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（GALT)蛋白质的凝 胶概况。
[0042] 图22是来自ASL修饰mRNA的精氨基琥珀酸裂解酶（ASL)蛋白质的凝胶概况。
[0043] 图23是来自TAT修饰mRNA的酪氨酸氨基转移酶（TAT)蛋白质的凝胶概况。
[0044] 图24是来自GBEl修饰mRNA的葡聚糖（1，4- α -)分支酶I (GBEl)蛋白质的凝胶 概况。
[0045] 图25是Hela细胞上清液中来自凝血酶原修饰mRNA的凝血酶原蛋白质产量的直 方图。
[0046] 图26是Hela细胞上清液中来自凝血酶原修饰mRNA的凝血酶原蛋白质产量的直 方图。
[0047] 图27是来自CP修饰mRNA的血浆铜蓝蛋白（CP或CLP)蛋白质的凝胶概况。
[0048] 图28是Hela细胞上清液中来自TGF- M修饰mRNA的转化生长因子β I (TGF- β 1) 蛋白质产量的直方图。
[0049] 图29是来自OTC修饰mRNA的鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OTC)蛋白质的凝胶概况。
[0050] 图30是低密度脂蛋白受体（LDLR)修饰mRNA的流式细胞术曲线图。
[0051] 图31是来自UGTlAl修饰mRNA的UDP葡萄糖醛酸基转移酶1家族多肽Al (UGTlAl) 蛋白质的凝胶概况。
[0052] 图32是HEK293细胞中的XI因子蛋白质产量的直方图。
[0053] 图33是来自水通道蛋白-5修饰mRNA的水通道蛋白-5蛋白质的凝胶概况。
[0054] 图34是Hela细胞中来自VII因子修饰mRNA的VII因子蛋白质产量的直方图。
[0055] 图35是Hela细胞中来自甘精胰岛素修饰mRNA的甘精胰岛素蛋白质产量的直方 图。
[0056] 图36是Hela细胞中来自组织因子修饰mRNA的组织因子蛋白质产量的直方图。
[0057] 图37是Hela细胞中来自XI因子修饰mRNA的XI因子蛋白质产量的直方图。
[0058] 图38是Hela细胞上清液中来自XI因子修饰mRNA的XI因子蛋白质产量的直方 图。
[0059] 图39是Hela细胞中来自门冬胰岛素修饰mRNA的门冬胰岛素蛋白质产量的直方 图。
[0060] 图40是Hela细胞中来自赖脯胰岛素修饰mRNA的赖脯胰岛素蛋白质产量的直方 图。
[0061] 图41是HeLa细胞中来自谷赖胰岛素修饰mRNA的谷赖胰岛素蛋白质产量的直方 图。
[0062] 图42是HeLa细胞中来自人生长激素修饰mRNA的人生长激素蛋白质产量的直方 图。
[0063] 图43是来自p53修饰mRNA的肿瘤蛋白53 (p53)蛋白质的凝胶概况。图43A示出 P53的预期大小。图43B示出p53的预期大小。
[0064] 图44是来自TUFTl修饰mRNA的釉丛蛋白（tuftelin) (TUFTl)蛋白质的凝胶概况。
[0065] 图45是来自GALKl修饰mRNA的半乳糖激酶I (GALKl)蛋白质的凝胶概况。图45A 示出GALKl的预期大小。图45B示出GALKl的预期大小。
[0066] 图46是来自DEFB103A修饰mRNA的防御素β 103A(DEFB103A)蛋白质的凝胶概况。
[0067] 图47是LDLR修饰mRNA的流式细胞术曲线图。
[0068] 图48是Hela中血管内皮生长因子表达的直方图。
[0069] 图49是用血管内皮生长因子mRNA转染的Hela细胞的细胞活力的直方图。
[0070] 图50是门冬胰岛素蛋白质表达的直方图。
[0071] 图51是甘精膜岛素蛋白质表达的直方图。
[0072] 图52是谷赖胰岛素蛋白质表达的直方图。
[0073] 图53是白细胞介素7 (IL-7)蛋白质表达的直方图。
[0074] 图54是促红细胞生成素（EPO)蛋白质表达的直方图。
[0075] 图55是来自溶酶体酸性脂肪酶修饰mRNA的溶酶体酸性脂肪酶蛋白质的凝胶概 况。
[0076] 图56是来自葡糖脑苷脂酶修饰mRNA的葡糖脑苷脂酶蛋白质的凝胶概况。
[0077] 图57是来自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶修饰mRNA的艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶蛋白质 的凝胶概况。
[0078] 图58是来自荧光素酶修饰mRNA的荧光素酶蛋白质的凝胶概况。
[0079] 图59是哺乳动物中在施用配制的赫赛汀修饰mRNA之后IgG浓度的直方图。
[0080] 图60是在用赫赛汀修饰mRNA转染之后IgG浓度（以ng/ml计）的直方图。
[0081] 图61是来自赫赛汀修饰mRNA的赫赛汀蛋白质的凝胶概况。
[0082] 图62是葡糖脑苷脂酶酶活性的直方图。
[0083] 图63是溶酶体酸性脂肪酶酶活性的直方图。
[0084] 图64是VIII因子蛋白质表达的直方图。
[0085] 图65是VIII因子显色活性的直方图。
[0086] 图66是LDLR表达的图表。图66A示出与添加LDLR mRNA相比，细胞的LDL受体 表达。图66B示出转染后细胞的LDL受体表达。图66C示出BODIPY?标记的LRL的饱 和度。图66D示出B0DIPY-LDL与细胞的结合亲和力。
[0087] 图67是示出针对UGTlAl表达的阳性细胞百分比的图表。
[0088] 图68是示出UGTlAl蛋白质累积的图表。
[0089] 图69是来自UGTlAl或OTC修饰mRNA的UGTlAl蛋白质和OTC的凝胶概况。
[0090] 图70是用PAh或UGTlAl转染的HEK293细胞的流式细胞术曲线图。
[0091] 图71是来自UGTlAl修饰mRNA的UGTlAl蛋白质的凝胶概况。
[0092] 图72是用含有UGTlAl的LNP处理的小鼠的微粒体提取物的凝胶概况。
[0093] 详述
[0094] 在治疗学、诊断学、试剂领域并且对于生物测定来说，能够将核酸（例如，核糖核 酸（RNA))递送至细胞内部（无论体外、体内、原位或离体）例如以便引起核酸的细胞内翻 译和所编码的目标多肽的产生具有重要意义。特别重要的是非整合多核苷酸的递送和功 能。
[0095] 本文描述用于设计、制备、制造和/或配制编码一种或多种目标多肽的多核苷酸 的组合物（包括药物组合物）和方法。还提供用于选择、设计和/或使用编码本文所描述 的目标多肽的多核苷酸的系统、过程、装置和试剂盒。
[0096] 根据本发明，这些多核苷酸优选地进行修饰以便避免本领域的其它多肽编码分子 的缺陷。因此，这些多核苷酸被称为修饰mRNA或mmRNA。
[0097] 本发明人已经探索了修饰多核苷酸在抗体、病毒、兽医学应用领域以及多种体内 环境中的用途并且这些研究公开于，例如共同未决的和共同拥有的美国临时专利申请序 号2011年3月31日提交的61/470, 451，其教导mmRNA的体内应用；2011年4月26日提 交的61/517, 784,其教导用于产生抗体多肽的工程化的核酸；2011年5月17日提交的 61/519, 158,其教导mmRNA技术的兽医学应用；2011年9月12日提交的61/533, 537,其教导 mmRNA技术的抗微生物应用；2011年9月12日提交的61/533, 554,其教导mmRNA技术的病 毒应用；2011年10月3日提交的61/542, 533,其教导用于在mmRNA技术中使用的各种化学 修饰；2011年12月14日提交的61/570, 690,其教导用于在制作或使用mmRNA技术中使用 的可移动装置；2011年12月14日提交的61/570, 708,其教导mmRNA在急症护理状况中的 用途；2011年12月16日提交的61/576, 651，其教导mmRNA的末端修饰构造；2011年12月 16日提交的61/576, 705,其教导使用mmRNA的脂质体的递送方法；2011年12月21日提交 的61/578, 271，其教导使用mmRNA来增加器官或组织的存活力的方法；2011年12月29日提 交的61/581，322,其教导编码细胞穿透肽的mmRNA ;2011年12月29日提交的61/581，352， 其教导中细胞毒性核苷的并入以及2012年1月10日提交的61/631，729,其教导使用mmRNA 用于穿过血脑屏障的方法；所述专利申请都以引用的方式整体并入本文。
[0098] 本文部分地提供编码目标多肽的多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA，所述多核苷 酸、初级构建体和/或mmRNA已经被设计成改进以下中的一项或多项：在组织中的稳定性和 /或清除率、受体摄取和/或动力学、组合物的细胞通路、与翻译机器的接合、mRNA半衰期、 翻译效率、免疫逃避、蛋白质产生能力、分泌效率（适用时）、循环的可及性、蛋白质半衰期 和/或细胞状态、功能和/或活性的调节。
[0099] I.本发明的鉬合物（mmRNA)
[0100] 本发明提供编码一种或多种目标多肽的核酸分子，具体地说多核苷酸、初级构建 体和/或mmRNA。术语"核酸"在其广义上包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。 这些聚合物经常被称为多核苷酸。本发明的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于，核糖核 酸（RNA)、脱氧核糖核酸（DNA)、苏糖核酸（TNA)、乙二醇核酸（GNA)、肽核酸（PNA)、锁核酸 (LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的a-LNA(LNA的非对映体）、具 有2'-氨基官能化的2'-氨基-LNA以及具有2'-氨基官能化的2'-氨基-a-LNA) 或其杂合体。
[0101] 在优选实施方案中，核酸分子是信使RNA(mRNA)。如本文所用，术语"信使 RNA"（mRNA)是指编码目标多肽并且能够被翻译以在体外、体内、原位或离体产生编码的目 标多肽的任何多核苷酸。
[0102] 传统上，mRNA分子的基本组分至少包括编码区、5' UTR、3' UTR、5'帽以及 poly-A尾。基于这种野生型模块结构，本发明通过提供多核苷酸或初级RNA构建体扩展了 传统mRNA分子的功能性的范围，所述多核苷酸或初级RNA构建体维持模块组织但包含一种 或多种结构和/或化学修饰或改变，所述修饰或改变赋予所述多核苷酸有用的特性，在一 些实施方案中所述特性包括被引入多核苷酸的细胞的先天性免疫应答的实质性诱导的缺 乏。如此，本发明的修饰mRNA分子被称为"mmRNA"。如本文所用，"结构"特征或修饰是其 中两个或更多个连接核苷酸在多核苷酸、初级构建体或mmRNA中插入、缺失、复制、反转或 随机化而无对所述核苷酸本身的显著化学修饰的特征或修饰。因为要实现结构修饰就必须 使化学键断裂并重新形成，所以结构修饰具有化学性质并因此是化学修饰。然而，结构修饰 将产生不同的核苷酸序列。例如，多核苷酸"ATCG"可化学修饰成"AT-5meC-G"。同一多核 苷酸可从"ATCG"结构修饰成"ATCCCG"。在此，已插入二核苷酸"CC"，从而产生对多核苷酸 的结构修饰。
[0103] mmRNA构浩
[0104] 本发明的mmRNA在其功能和/或结构设计特征上不同于野生型mRNA，所述功能和 /或结构特征如本文所证明用于克服使用基于核酸的治疗剂的有效多肽产生的现有问题。
[0105] 图1示出本发明的代表性多核苷酸初级构建体100。如本文所用，术语"初级构建 体"或"初级mRNA构建体"是指编码一种或多种目标多肽并且保留足够结构和/或化学特 征以允许翻译其中编码的目标多肽的多核苷酸转录物。初级构建体可以是本发明的多核苷 酸。当结构上或化学上修饰时，初级构建体可被称为mmRNA。
[0106] 参见图1，初级构建体100在此包含连接核苷酸的第一区102,所述第一区102由 第一侧翼区104和第二侧翼区106侧接。如本文所用，"第一区"可被称为"编码区"或"编 码……的区"或简单地"第一区"。这个第一区可包括但不限于编码的目标多肽。目标多肽 可在其5'末端包含由信号序列区103编码的一个或多个信号序列。侧翼区104可包含连 接核苷酸的包含一个或多个完整或不完整5' UTR序列的区。侧翼区104还可包含5'末 端帽108。第二侧翼区106可包含连接核苷酸的包含一个或多个完整或不完整3' UTR的 区。侧翼区106还可包含3'加尾序列110。
[0107] 第一操作区105使第一区102的5'端与第一侧翼区104桥接。传统上这个操作 区包含起始密码子。操作区或者可包含含有起始密码子的任何翻译起始序列或信号。
[0108] 第二操作区107使第一区102的3'端与第二侧翼区106桥接。传统上这个操作 区包含终止密码子。操作区或者可包含含有终止密码子的任何翻译起始序列或信号。根据 本发明，还可使用多个连续终止密码子。
[0109] -般来说，本发明的初级构建体的第一区的最短长度可以是足以编码二肽、三肽、 四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽的核酸序列的长度。在另一个实施方案中，所述长 度可足以编码2至30个氨基酸，例如5至30、10至30、2至25、5至25、10至25或10至20 个氨基酸的肽。所述长度可足以编码至少11、12、13、14、15、17、20、25或30个氨基酸的肽， 或不超过40个氨基酸，例如不超过35、30、25、20、17、15、14、13、12、11或10个氨基酸的肽。 多核苷酸序列可编码的二肽的实例包括但不限于肌肽和鹅肌肽（anserine)。
[0110] 通常，编码本发明的目标多肽的第一区的长度大于约30个核苷酸（例如，至少或 大于约 35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、 500、600、700、800、900、1，000、1，100、1，200、1，300、1，400、1，500、1，600、1，700、1，800、 1，900、2, 000、2, 500、和 3, 000、4, 000、5, 000、6, 000、7, 000、8, 000、9, 000、10, 000、20, 000、 30, 000、40, 000、50, 000、60, 000、70, 000、80, 000、90, 000 或多达并包括 100, 000 个核苷 酸）。如本文所用，"第一区"可被称为"编码区"或"编码……的区"或简单地"第一区"。
[0111] 在一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA包括约30至约100, 000个核 苷酸（例如，30 至 50、30 至 100、30 至 250、30 至 500、30 至 1，000、30 至 1，500、30 至 3, 000、 30 至 5, 000、30 至 7, 000、30 至 10, 000、30 至 25, 000、30 至 50, 000、30 至 70, 000、100 至 250、100 至 500、100 至 1，000、100 至 1，500、100 至 3, 000、100 至 5, 000、100 至 7, 000、100 至 10, 000、100 至 25, 000、100 至 50, 000、100 至 70, 000、100 至 100, 000、500 至 1，000、500 至 1，500、500 至 2, 000、500 至 3, 000、500 至 5, 000、500 至 7, 000、500 至 10, 000、500 至 25, 000、 500 至 50, 000、500 至 70, 000、500 至 100, 000、1，000 至 1，500、1，000 至 2, 000、1，000 至 3, 000、1，000 至 5, 000、1，000 至 7, 000、1，000 至 10, 000、1，000 至 25, 000、1，000 至 50, 000、 1，000 至 70, 000、1，000 至 100, 000、1，500 至 3, 000、1，500 至 5, 000、1，500 至 7, 000、1，500 至 10, 000、1，500 至 25, 000、1，500 至 50, 000、1，500 至 70, 000、1，500 至 100, 000、2, 000 至 3, 000、2, 000 至 5, 000、2, 000 至 7, 000、2, 000 至 10, 000、2, 000 至 25, 000、2, 000 至 50, 000、 2, 000 至 70, 000、以及 2, 000 至 100, 000)。
[0112] 根据本发明，第一侧翼区和第二侧翼区的长度可独立地在15至1，000个核苷酸 范围内（例如，大于 30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、 350、400、450、500、600、700、800 和 900 个核苷酸，或至少 30、40、45、50、55、60、70、80、90、 100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 和 1，000 个核苷 酸）。
[0113] 根据本发明，加尾序列的长度可在不存在至500个核苷酸范围内（例如，至少60、 70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450 或 500 个核苷酸）。在加尾区是 polyA尾的情况下，所述长度可以polyA结合蛋白结合的单位或作为polyA结合蛋白结合的 函数来确定。在这个实施方案中，PolyA尾足够长以结合polyA结合蛋白的至少4个单体。 polyA结合蛋白单体结合大约38个核苷酸的段。如此，已观察到约80个核苷酸和160个核 苷酸的polyA尾是功能性的。
[0114] 根据本发明，加帽区可包含单个帽或形成帽的一系列核苷酸。在这个实施方案中， 加帽区的长度可以是1至10,例如2至9、3至8、4至7、1至5、5至10或至少2或10或更 少个核苷酸。在一些实施方案中，帽不存在。
[0115] 根据本发明，第一操作区和第二操作区可在3至40,例如5至30、10至20、15或至 少4或30或更少个核苷酸的长度范围内，并且可另外包含起始和/或终止密码子、一个或 多个信号序列和/或限制序列。
[0116]环状 mmRNA
[0117] 根据本发明，可使初级构建体或mmRNA环化或连环化（concatemerized)，以产生 有翻译能力的分子来帮助聚-A结合蛋白与5'端结合蛋白之间的相互作用。环化或连环 化的机制可通过至少3种不同的途径发生：1)化学，2)酶，以及3)核酶催化。新形成的 5' -/3'-键联可以是分子内或分子间的。
[0118] 在第一途径中，核酸的5'端和3'端包含当靠近时在分子的5'端与3'端之间 形成新的共价键联的化学反应性基团。5'端可包含NHS-酯反应性基团并且3'端可包含 3'-氨基封端的核苷酸，以使得在有机溶剂中合成mRNA分子的：V端上的：V -氨基封端 的核苷酸将经历5' -NHS-酯部分上的亲核攻击，从而形成新的5' -/3'-酰胺键。
[0119] 在第二途径中，T4RNA连接酶可用于将5'-磷酸化的核酸分子酶连接至核酸的 3'-羟基端，从而形成新的磷酸二酯键联。在示例反应中，根据制造商的方案将Iyg核酸 分子与 1 至 10 单位的 T4RNA 连接酶（New England Biolabs, Ipswich, MA)在 37°C下孵育 1 小时。连接反应可在存在能够与并列的5'-和3'-区两者碱基配对以帮助酶连接反应 的分离寡核苷酸的情况下发生。
[0120] 在第三途径中，cDNA模板的5'-或3'-端编码连接酶核酶序列，以使得在体外 转录过程中，所得核酸分子可包含能够将核酸分子的5'端连接至核酸分子的3'端的活 性核酶序列。连接酶核酶可源自I组内含子、I组内含子、丁型肝炎病毒、发夹状核酶或可 通过SELEX(指数富集的配体系统进化技术）选择。核酶连接酶反应可在0°C与37°C之间 的温度下进行1至24小时。
[0121] mmRNA 多聚体
[0122] 根据本发明，多种不同的多核苷酸、初级构建体*_RNA可使用在:V端修饰的核 苷酸通过3'端连接在一起。化学缀合可用于控制递送至细胞中的化学计量学。例如，可将 乙醛酸循环酶，即异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶以1:1比例供应至H印G2细胞中以改变细 胞脂肪酸代谢。这一比例可通过使用一个多核苷酸、初级构建体或mmRNA物种上的3'-叠 氮基封端的核苷酸和相对的多核苷酸、初级构建体或mmRNA物种上的含有C5-乙炔基或炔 基的核苷酸化学连接多核苷酸、初级构建体或mmRNA进行控制。根据制造商的方案使用末 端转移酶（New England Biolabs, Ipswich, MA)在转录后添加修饰核苷酸。在添加：V -修 饰核苷酸之后，两个多核苷酸、初级构建体或mmRNA物种可在存在或不存在铜的情况下组 合在水溶液中，以便经由如文献中所描述的点击化学机制形成新的共价键联。
[0123] 在另一个实例中，可使用官能化的接头分子将多于两个多核苷酸连接在一起。例 如，官能化的糖分子可被化学修饰成包含多个化学反应性基团（SH-、NH 2-、N3等）以便与 3'-官能化的mRNA分子上的同源部分（即3'-马来酰亚胺酯、3' -NHS-酯、炔基）反 应。所修饰的糖上的反应性基团的数目可以化学计量方式进行控制，以便直接控制缀合的 多核苷酸、初级构建体或mmRNA的化学计量比例。
[0124] mmRNA缀合物和组合
[0125] 为了进一步增强蛋白质产生，本发明的初级构建体或mmRNA可被设计成与以下 各项缀合：其它多核苷酸、染料、嵌入剂（intercalating agent)(例如吖陡）、交联剂（例 如补骨脂素（psoralene)、丝裂霉素C)、卩卜啉类（TPPC4、德克萨卩卜啉（texaphyrin)、噻啉 (Sapphyrin))、多环芳香烃（例如吩嗪、二氢吩嗪）、人工内切核酸酶（例如EDTA)、烷化剂、 磷酸酯、氨基、巯基、PEG (例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG] 2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性 标记的标志物、酶、半抗原（例如生物素）、转运/吸收促进剂（例如阿司匹林、维生素E、叶 酸）、合成核糖核酸酶、蛋白质（例如糖蛋白）或肽（例如具有针对共配体的特异性亲和力 的分子）或抗体（例如结合指定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞的抗体）、激素和激 素受体，非肽物种如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅助因子或药物。
[0126] 缀合可产生增加的稳定性和/或半衰期并且可特别适用于使多核苷酸、初级构建 体或_RNA靶向细胞、组织或器官中的特定位点。
[0127] 根据本发明，mmRNA或初级构建体可与以下中的一种或多种一起施用或进一步编 码以下中的一种或多个：RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、miRNA结合位点、反义RNA、核酶、催 化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体或载体等。
[0128]双功能mmRNA
[0129] 在本发明的一个实施方案中，是双功能多核苷酸（例如，双功能初级构建体或双 功能mmRNA)。顾名思义，双功能多核苷酸是具有或能够有至少两种功能的那些多核苷酸。 这些分子还可根据惯例被称为多功能的。
[0130] 双功能多核苷酸的多重功能性可由RNA编码（所述功能可能直到编码的产物被翻 译才显现）或可以是多核苷酸本身的特性。它可以是结构的或化学的。双功能修饰多核苷 酸可包含与多核苷酸共价或静电缔合的功能。此外，两种功能可在_RNA与另一种分子的 复合物的背景下提供。
[0131] 双功能多核苷酸可编码抗增殖性的肽。这些肽可以是线性的、环状的、约束的或无 规卷曲的。它们可充当适体、信号传导分子、配体或其模拟物或拟态物。抗增殖肽在翻译时 长度可以是3至50个氨基酸。它们可以是5至40、10至30或大约15个氨基酸长。它们 可以是单链、多链或支链的并且一旦被翻译可形成复合物、聚集体或任何多单位结构。
[0132] 非编码多核苷酸和初级构建体
[0133] 如本文所描述，提供具有为部分可翻译或大体上不可翻译的序列，例如具有非编 码区的多核苷酸和初级构建体。这种非编码区可以是初级构建体的"第一区"。或者，非 编码区可以是不同于所述第一区的区。这类分子通常不被翻译，但能够通过结合和螯合 一种或多种翻译机器组分（如核糖体蛋白或转移RNA(tRNA))中的一种或多种对蛋白质 产生发挥作用，从而有效地减少细胞中的蛋白质表达或调节细胞中的一种或多种途径或 级联，这进而改变蛋白质水平。多核苷酸或初级构建体可包含或编码一种或多种长的非 编码RNAdncRNA或IincRNA)或其部分、小核仁RNA (sno-RNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰 RNA(siRNA)或 Piwi-相互作用 RNA(piRNA)。
[0134] 目标多狀
[0135] 根据本发明，初级构建体被设计成编码一种或多种目标多肽或其片段。目标多肽 可包括但不限于全多肽、多种多肽或多肽的片段，其独立地可由一种或多种核酸、多种核 酸、核酸的片段或任何上述的变体编码。如本文所用，术语"目标多肽"是指被选择来在本发 明的初级构建体中编码的任何多肽。如本文所用，"多肽"意指最经常通过肽键连接在一起 的氨基酸残基（天然或不天然的）的聚合物。如本文所用，所述术语是指具有任何大小、结 构或功能的蛋白质、多肽和肽。在一些情况下，编码的多肽小于约50个氨基酸并且所述多 肽然后被称为肽。如果多肽是肽，那么它将是至少约2、3、4、或至少5个氨基酸残基长。因 此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直向同源物、横向同源物、前述 的片段和其它等效物、变体和类似物。多肽可以是单个分子或可以是多分子复合物如二聚 物、三聚物或四聚物。它们还可包含单链或多链多肽如抗体或胰岛素并且可以是缔合的或 连接的。最常见地，在多链多肽中发现二硫键。术语多肽还可应用于氨基酸聚合物，其中一 个或多个氨基酸残基是对应的天然存在氨基酸的人工化学类似物。
[0136] 术语"多肽变体"是指在其氨基酸序列方面与天然或参考序列不同的分子。与天 然或参考序列相比，氨基酸序列变体可具有在氨基酸序列内的某些位置处的取代、缺失和/ 或插入。通常，变体将与天然或参考序列具有至少约50%同一性（同源性），并且优选地它 们将与天然或参考序列至少约80%、更优选至少约90%相同（同源）。
[0137] 在一些实施方案中，提供"变体模拟物"。如本文所用，术语"变体模拟物"是包含 将模拟所激活的序列的一个或多个氨基酸的一种变体模拟物。例如，谷氨酸可用作磷-苏 氨酸和/或磷-丝氨酸的模拟物。或者，变体模拟物可引起去活或含有模拟物的灭活产物， 例如，苯丙氨酸可充当酪氨酸的灭活取代；或丙氨酸可充当丝氨酸的灭活取代。
[0138] "同源性"在其应用于氨基酸序列时被定义为在比对序列并在必要时引入空位以 实现最大百分比同源性之后，候选氨基酸序列中与第二序列的氨基酸序列中的残基相同的 残基百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。应理解同源性取决于百分比 同一性的计算，但由于引入计算中的空位和罚分可能得到不同的值。
[0139] "同源物"在其应用于多肽序列时意指与第二物种的第二序列具有实质同一性的 其它物种的对应序列。
[0140] "类似物"意欲包括因一个或多个氨基酸改变（例如，氨基酸残基的取代、添加或缺 失）而不同但仍维持亲本或起始多肽的一种或多种特性的多肽变体。
[0141] 本发明考虑为基于多肽的几种类型的组合物，包括变体和衍生物。这些包括取代、 插入、缺失和共价变体和衍生物。术语"衍生物"与术语"变体"同义地使用，但通常是指已 经相对于参考分子或起始分子以任何方式修饰和/或改变的分子。
[0142] 如此，编码相对于参考序列，具体地说本文所公开的多肽序列含有取代、插入和/ 或添加、缺失和共价修饰的多肽的mmRNA包括在本发明的范围内。例如，序列标签或氨基酸 (如一个或多个赖氨酸）可添加至本发明的肽序列（例如，在N末端或C末端处）。序列标 签可用于肽纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解度或允许生物素化。或者，位于肽或蛋 白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区处的氨基酸残基可任选地被缺失，从而提供截短序 列。某些氨基酸（例如，C末端或N末端残基）可替代地被缺失，这取决于序列的使用，例 如作为可溶或连接至固相支持物的较大序列的一部分的序列的表达。
[0143] 当提及多肽时"取代变体"是天然或起始序列中的至少一个氨基酸残基被去除并 且在其同一位置处的位置中插入不同的氨基酸的多肽。取代可以是单一的，其中分子中的 仅一个氨基酸已被取代；或取代可以是多重的，其中同一分子中的两个或更多个氨基酸已 被取代。
[0144] 如本文所用，术语"保守氨基酸取代"是指通常存在于序列中的氨基酸被具有类似 大小、电荷或极性的不同氨基酸取代。保守取代的实例包括非极性（疏水性）残基如异亮 氨酸、缬氨酸和亮氨酸取代另一种非极性残基。同样，保守取代的实例包括一种极性（亲水 性）残基取代另一种，如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间和甘氨酸与丝氨 酸之间。另外，碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代另一种碱性残基、或一种酸性残基 如天冬氨酸或谷氨酸取代另一种酸性残基是保守取代的另外实例。非保守取代的实例包括 非极性（疏水性）氨基酸残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、蛋氨酸取代极性（亲水 性）残基如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸，和/或极性残基取代非极性残基。
[0145] 当提及多肽时"插入变体"是具有紧邻天然或起始序列中的特定位置处的氨基酸 插入的一个或多个氨基酸的那些变体。"紧邻"氨基酸意指连接至所述氨基酸的α-羧基或 氨基官能团。
[0146] 当提及多肽时"缺失变体"是天然或起始氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被去 除的那些变体。通常，缺失变体将使一个或多个氨基酸在分子的特定区中缺失。
[0147] 当提及多肽时"共价衍生物"包括用有机蛋白质或非蛋白质衍生化试剂修饰天然 或起始蛋白质，和/或翻译后修饰。传统上通过使蛋白质的靶标氨基酸残基与能够与选定 侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂反应，或通过利用在选定重组宿主细胞中起作用的 翻译后修饰的机制来引入共价修饰。所得共价衍生物适用于旨在鉴别对于生物活性、对于 免疫测定或对于制备用于重组糖蛋白的免疫亲和纯化的抗蛋白质抗体来说重要的残基的 程序中。这类修饰在本领域普通技术的范围内并且在无过度实验的情况下进行。
[0148] 某些翻译后修饰是重组宿主细胞对所表达多肽的作用的结果。谷氨酰胺酰基和天 冬酰胺酰基残基经常在翻译后脱去酰氨基成对应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。或者，这 些残基在温和酸性条件下脱去酰氨基。这些残基的任一形式可存在于根据本发明产生的多 肽中。
[0149] 其它翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基 的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α -氨基的甲基化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, ff. H. Freeman&Co. , San Francisco,第 79-86 页 (1983))。
[0150] 当提及多肽时"特征"被定义为分子的基于氨基酸序列的不同组分。由本发明的 mmRNA编码的多肽的特征包括表面表观、局部构象形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、 位点、末端或其任何组合。
[0151] 如本文所用当提及多肽时，术语"表面表观"是指蛋白质的出现在最外表面上的基 于多肽的组分。
[0152] 如本文所用，当提及多肽时术语"局部构象形状"是指蛋白质的位于其可限定空间 内的基于多肽的结构表观。
[0153] 如本文所用当提及多肽时，术语"折叠"是指在能量最低化时氨基酸序列的所得构 象。折叠可在折叠过程的二级或三级水平下发生。二级水平折叠的实例包括β折叠和α 螺旋。三级折叠的实例包括由于高能力的聚集或分离形成的结构域和区。以这种方式形成 的区包括疏水袋和亲水袋等。
[0154] 如本文所用，术语"转角"在其涉及蛋白质构象时意指使肽或多肽的主链方向改变 的弯曲并且可涉及一个、两个、三个或更多个氨基酸残基。
[0155] 如本文所用，当提及多肽时，术语"环"是指可用于使肽或多肽的主链方向反向的 多肽的结构特征。当环在多肽中存在并且仅改变主链的方向时，它可包含四个或更多个 氨基酸残基。Oliva等人已经鉴别了至少5类蛋白质环（J.Mol Biol 266(4):814-830; 1997)。环可以是开放的或闭合的。闭合的环或"环状"环可在桥接部分之间包含2、3、4、5、 6、7、8、9、10或更多个氨基酸。这类桥接部分可包含在具有二硫桥的多肽中典型的半胱氨 酸-半胱氨酸桥（Cys-Cys)，或可替代地桥接部分可以是基于非蛋白质的，如本文所使用的 dibromozylyl 试剂。
[0156] 如本文所用，当提及多肽时术语"半环"是指所鉴别的环的一部分，所述部分具有 其所衍生自的环的至少一半数目的氨基酸残基。应理解，环可能不总是包含偶数数目的氨 基酸残基。因此，在环包含或被鉴别为包含奇数数目的氨基酸的那些情况下，奇数数目的环 的半环将包含所述环的整数部分或下一个整数部分（所述环的氨基酸的数目/2+/-0. 5个 氨基酸）。例如，被鉴别为7个氨基酸环的环可产生3个氨基酸或4个氨基酸的半环（7/2 =3· 5+/-0. 5 为 3 或 4)。
[0157] 如本文所用，当提及多肽时术语"结构域"是指具有一种或多种可鉴别的结构或功 能特征或特性（例如，结合能力，用作蛋白质-蛋白质相互作用的位点）的多肽的基序。
[0158] 如本文所用，当提及多肽时术语"半结构域"意指鉴别的结构域的一部分，所述部 分具有其所衍生自的结构域的至少一半数目的氨基酸残基。应理解结构域可能不总是包含 偶数数目的氨基酸残基。因此，在结构域包含或被鉴别为包含奇数数目的氨基酸的那些情 况下，奇数数目的结构域的半结构域将包含所述结构域的整数部分或下一个整数部分（所 述结构域的氨基酸的数目/2+/-0. 5个氨基酸）。例如，被鉴别为7个氨基酸结构域的结构 域可产生3个氨基酸或4个氨基酸的半结构域（7/2 = 3. 5+/-0. 5为3或4)。还应理解，可 在结构域或半结构域内鉴别亚结构域，这些亚结构域拥有少于其所衍生自的结构域或半结 构域中鉴别出的所有结构或功能特性。还应理解，包含本文的任何结构域类型的氨基酸不 必是沿多肽的主链连续的（即，不相邻的氨基酸可在结构上折叠以产生结构域、半结构域 或亚结构域）。
[0159] 如本文所用，当提及多肽时术语"位点"在其涉及基于氨基酸的实施方案时与"氨 基酸残基"和"氨基酸侧链"同义地使用。位点表示肽或多肽内的可在本发明的基于多肽的 分子内修饰、操纵、改变、衍生化或变化的位置。
[0160] 如本文所用，术语"末端（termini) "或"末端（terminus) "当提及多肽时是指肽 或多肽的末尾。这种末尾不仅仅限于肽或多肽的第一或最后位点，而且可包括末端区中的 另外氨基酸。本发明的基于多肽的分子可被表征为具有N末端（由具有自由氨基（NH2)的 氨基酸封端）和C末端（由具有自由羧基（COOH)的氨基酸封端）两者。本发明的蛋白质 在一些情况下由通过二硫键或通过非共价力（多聚体、低聚物）集合在一起的多个多肽链 组成。这些种类的蛋白质将具有多个N末端和C末端。或者，多肽的末端可进行修饰以使 得它们根据情况以基于非多肽的部分（如有机缀合物）开始或结束。
[0161] 一旦任何特征已被鉴别或定义为待由本发明的初级构建体或mmRNA编码的多肽 的所需组分，便可通过移动、交换、反转、缺失、随机化或复制来进行这些特征的若干操纵和 /或修饰中的任何一种。此外，应理解特征的操纵可产生与对本发明分子的修饰相同的结 果。例如，涉及使结构域缺失的操纵将产生正如修饰核酸以编码小于全长分子将产生的那 样的分子长度的改变。
[0162] 修饰和操纵可通过本领域已知的方法来实现，例如但不限于定点诱变。然后可使 用体外或体内测定（如本文所描述的那些）或本领域已知的任何其它合适的筛选测定来测 试所得到的修饰分子的活性。
[0163] 根据本发明，多肽可包含通过多轮实验发现的共有序列。如本文所用，"共有"序列 是表示允许一个或多个位点处的变异性的序列集合群体的单个序列。
[0164] 如本领域技术人员所认识到，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也 被认为在本发明的目标多肽的范围内。例如，本文提供长度为10、20、30、40、50、60、70、80、 90、100或大于100个氨基酸的参考蛋白质的任何蛋白质片段（意指比参考多肽序列短至少 一个氨基酸残基但在其它方面相同的多肽序列）。在另一个实例中，可根据本发明使用包含 与本文所描述的任何序列为约40 %、约50 %、约60 %、约70 %、约80 %、约90 %、约95 %或 约100%相同的具有约20、约30、约40、约50或约100个氨基酸的段的任何蛋白质。在某 些实施方案中，待根据本发明使用的多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变，如本文 所提供或提及的任何序列中所示。
[0165] 编码的多狀
[0166] 本发明的初级构建体或_RNA可被设计成编码选自若干靶标类别中的任何一种 的目标多肽，所述靶标类别包括但不限于生物制剂、抗体、疫苗、治疗性蛋白质或肽、细胞穿 透肽、分泌性蛋白、质膜蛋白、细胞质或细胞骨架蛋白、细胞内膜结合蛋白、核蛋白、与人类 疾病相关的蛋白质、靶向部分或由人基因组编码的那些蛋白质，针对所述蛋白质还未鉴别 出治疗适应症但所述蛋白质仍然在研究和发现领域中具有效用。
[0167] 在一个实施方案中，初级构建体或mmRNA可编码与参考多肽序列具有一定同一·生 的变体多肽。如本文所用，"参考多肽序列"是指起始多肽序列。参考序列可以是野生型序列 或在设计另一序列中所参考的任何序列。"参考多肽序列"可以是例如如本文所公开的SEQ ID N0:769至1392中的任何一个，例如SEQ ID NO 769、770、771、772、773、774、775、776、 777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、 796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、 815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、 834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、 853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、 872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、 891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、 910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、 929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、 948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、 967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、 986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、 1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、 1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、 1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、 1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、 1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、 1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、 1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、 1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、 1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、 1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、 1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、 1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、 1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、 1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1208、1209、1210、1211、1212、1213、 1214、1215、1216、1217、1218、1219、1220、1221、1222、1223、1224、1225、1226、1227、1228、 1229、1230、1231、1232、1233、1234、1235、1236、1237、1238、1239、1240、1241、1242、1243、 1244、1245、1246、1247、1248、1249、1250、1251、1252、1253、1254、1255、1256、1257、1258、 1259、1260、1261、1262、1263、1264、1265、1266、1267、1268、1269、1270、1271、1272、1273、 1274、1275、1276、1277、1278、1279、1280、1281、1282、1283、1284、1285、1286、1287、1288、 1289、1290、1291、1292、1293、1294、1295、1296、1297、1298、1299、1300、1301、1302、1303、 1304、1305、1306、1307、1308、1309、1310、1311、1312、1313、1314、1315、1316、1317、1318、 1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、 1334、1335、1336、1337、1338、1339、1340、1341、1342、1343、1344、1345、1346、1347、1348、 1349、1350、1351、1352、1353、1354、1355、1356、1357、1358、1359、1360、1361、1362、1363、 1364、1365、1366、1367、1368、1369、1370、1371、1372、1373、1374、1375、1376、1377、1378、 1379、1380、1381、1382、1383、1384、1385、1386、1387、1388、1389、1390、1391、1392 中的任何 一个。
[0168] 如本领域已知的术语"同一性"是指如通过比较序列确定的两个或更多个肽的序 列之间的关系。在本领域中，同一性还意指如通过具有两个或更多个氨基酸残基的串之间 的匹配数目确定的肽之间的序列相关性程度。同一性测度通过特定数学模型或计算机程序 (即"算法"）解决的具有空位比对（如果存在）的两个或更多个序列之间较小者的相同匹 配的百分比。相关肽的同一性可通过已知方法容易地计算。这类方法包括但不限于以下 中描述的那些〖Computational Molecular Biology, Lesk, Α·Μ·编辑，Oxford University Press,New York, 1988 ；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith, D. ff.编辑，Academic Press, New York, 1993 !Computer Analysis of Sequence Data,第 I 部分，Griffin, A. M.和 Griffin, H. G.编辑，Humana Press, New Jersey, 1994 !Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987 !Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和 Devereux, J.编辑，M. Stockton Press, New York, 1991 ; 和 Carillo 等人，SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)。
[0169] 在一些实施方案中，多肽变体可具有与参考多肽相同或类似的活性。或者，变体可 相对于参考多肽具有改变的活性（例如，增加的或减少的）。通常，本发明的特定多核苷酸 或多肽的变体将与所述特定参考多核苷酸或多肽具有至少约40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 但 小于100 %的序列同一性，如通过本文所描述的和本领域技术人员已知的序列比对程序和 参数确定的。用于比对的这类工具包括BLAST套件的那些（St印hen F. Altschul，Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller,和 David J. Lipman (1997)，''Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402·)。其它工具在本文、具体地在"同 一性"的定义中进行描述。
[0170] BLAST算法中的缺省参数包括例如，预期阈值10、字长28、匹配/错配得分1、-2， 空位损失线性。可应用任何滤波器以及选择物种特异性重复序列，例如智人。
[0171] 生物制剂
[0172] 本文所公开的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可编码一种或多种生物制剂。如本 文所用，"生物制剂"是通过本文所提供的方法产生的并且可用于治疗、治愈、减轻、预防或 诊断严重的或威胁生命的疾病或医学病状的基因多肽的分子。根据本发明生物制剂包括但 不限于，过敏原提取物（例如用于过敏疫苗注射（allergy shot)和测试）、血液组分、基因 疗法产物、移植中使用的人组织或细胞产物、疫苗、单克隆抗体、细胞因子、生长因子、酶、溶 血栓剂和免疫调节剂等。
[0173] 根据本发明，当前市售或处于研发中的一种或多种生物制剂可由本发明的多核苷 酸、初级构建体或mmRNA编码。虽然不希望受理论束缚，但据信将已知生物制剂的编码多肽 并入到本发明的初级构建体或_RNA中将产生改善的治疗功效，这种改善的治疗功效至少 部分地归因于构建体设计的特异性、纯度和/或选择性。
[0174] 抗体
[0175] 本文所公开的初级构建体或mmRNA可编码一种或多种抗体或其片段。术语"抗体" 包括单克隆抗体（包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体）、具有多表位特异性的抗体组合 物、多特异性抗体（例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子）以及抗体片段。术语"免疫球 蛋白"（Ig)在本文可与"抗体"互换使用。如本文所用，术语"单克隆抗体"是指从大体上同 质抗体的群体获得的抗体，即构成所述群体的单独抗体是相同的，除了可能以微量存在的 可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰（例如，异构化，酰胺化）。单克隆抗体是高度特 异性的，从而针对单一抗原位点。
[0176] 本文的单克隆抗体具体地包括"嵌合"抗体（免疫球蛋白），其中重链和/或轻链 的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而 所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这类抗体的片 段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性。本文的目标嵌合抗体包括 但不限于包含源自非人灵长类动物（例如，旧世界猴、猿等）的可变结构域抗原结合序列和 人恒定区序列的"灵长类化"抗体。
[0177] "抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选地所述完整抗体的抗原结合区和/或可 变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv片段；双抗体；线性抗体；纳米抗体 (nanobodies);从抗体片段形成的单链抗体分子和多特异性抗体。
[0178] 五类免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中的任何一种可由本发明的mmRNA编 码，包括分别指定为α、δ、ε、λ和μ的重链。还包括编码亚类γ和μ的多核苷酸序列。 因此抗体亚类中的任何一种可被部分或整体地编码并且包括以下亚类：IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgAl 和 IgA2。
[0179] 根据本发明，当前市售或处于研发中的一种或多种抗体或片段可由本发明的多核 苷酸、初级构建体或mmRNA编码。虽然不希望受理论束缚，但据信并入到本发明的初级构 建体中将产生改善的治疗功效，这种改善的治疗功效至少部分地归因于_RNA设计的特异 性、纯度和选择性。
[0180] 在本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA中编码的抗体可用于治疗许多治疗领 域中的病状或疾病，所述治疗领域例如但不限于血液、心血管、CNS、中毒（包括抗蛇毒素）、 皮肤病学、内分泌学、胃肠、医学成像、肌肉骨骼、肿瘤学、免疫学、呼吸系统、感觉系统以及 抗感染的治疗领域。
[0181] 在一个实施方案中，本文所公开的初级构建体或mmRNA可编码单克隆抗体和/或 其变体。抗体的变体还可包括但不限于，取代变体、保守氨基酸取代、插入变体、缺失变体和 /或共价变体。在一个实施方案中，本文所公开的初级构建体和/或mmRNA可编码免疫球 蛋白Fc区。在另一个实施方案中，初级构建体和/或mmRNA可编码变体免疫球蛋白Fc区。 作为非限制性实例，初级构建体和/或_RNA可编码具有变体免疫球蛋白Fc区的抗体，如 描述于以引用的方式整体并入本文的美国专利号8, 217, 147中。
[0182] 疫苗
[0183] 本文所公开的初级构建体或_RNA可编码一种或多种疫苗。如本文所用，"疫苗" 是改善对特定疾病或传染原的免疫性的生物制剂。根据本发明，当前市售或处于研发中的 一种或多种疫苗可由本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA编码。虽然不希望受理论束 缚，但据信并入到本发明的初级构建体或mmRNA中将产生改善的治疗功效，这种改善的治 疗功效至少部分地归因于构建体设计的特异性、纯度和选择性。
[0184] 在本发明的多核苷酸、初级构建体*_RNA中编码的疫苗可用于治疗许多治疗领 域中的病状或疾病，所述治疗领域例如但不限于心血管、CNS、皮肤病学、内分泌学、肿瘤学、 免疫学、呼吸系统以及抗感染的治疗领域。
[0185] 治疗性蛋白质或肽
[0186] 本文所公开的初级构建体或mmRNA可编码一种或多种经验证的或"处于测试中 的"治疗性蛋白质或肽。
[0187] 根据本发明，当前市售或处于研发中的一种或多种治疗性蛋白质或肽可由本发明 的多核苷酸、初级构建体或mmRNA编码。虽然不希望受理论束缚，但据信并入到本发明的初 级构建体或_RNA中将产生改善的治疗功效，这种改善的治疗功效至少部分地归因于构建 体设计的特异性、纯度和选择性。
[0188] 在本发明的多核苷酸、初级构建体*_RNA中编码的治疗性蛋白质和肽可用于治 疗许多治疗领域中的病状或疾病，所述治疗领域例如但不限于血液、心血管、CNS、中毒（包 括抗蛇毒素）、皮肤病学、内分泌学、遗传学、泌尿生殖、胃肠、肌肉骨骼、肿瘤学和免疫学、呼 吸系统、感觉系统以及抗感染的治疗领域。
[0189] 细胞穿透多肽
[0190] 本文所公开的初级构建体或mmRNA可编码一种或多种细胞穿透多肽。如本文所 用，"细胞穿透多肽"或CPP是指可有助于分子的细胞摄取的多肽。本发明的细胞穿透多肽 可包含一种或多种可检测标记。所述多肽可被部分地标记或全部完全地标记。所述多核苷 酸、初级构建体或_1?嫩可完全、部分编码或完全不编码可检测标记。细胞穿透肽还可包括 信号序列。如本文所用，"信号序列"是指在蛋白质翻译过程中结合在新生蛋白质的氨基末 端处的氨基酸残基的序列。信号序列可用于信号传导细胞穿透肽的分泌。
[0191] 在一个实施方案中，所述多核苷酸、初级构建体*_RNA还可编码融合蛋白。融合 蛋白可通过将带电荷的蛋白质可操作地连接至治疗性蛋白质来形成。如本文所用，"可操作 地连接"是指当引入至细胞中时治疗性蛋白质和带电荷的蛋白质以允许表达复合物的这样 一种方式连接。如本文所用，"带电荷的蛋白质"是指携带正、负或总体中性的电荷的蛋白 质。优选地，在融合蛋白的形成中治疗性蛋白质可共价地连接至带电荷的蛋白质。表面电 荷与总或表面氨基酸的比可以是大约〇. l、〇. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8或0. 9。
[0192] 由多核苷酸、初级构建体或mmRNA编码的细胞穿透多肽可在被翻译之后形成复合 物。所述复合物可包含连接（例如共价连接）至细胞穿透多肽的带电荷的蛋白质。"治疗 性蛋白质"是指当施用至细胞时具有治疗、诊断和/或预防性作用和/或引出所需的生物和 /或药理学作用的蛋白质。
[0193] 在一个实施方案中，细胞穿透多肽可包含第一结构域和第二结构域。第一结构域 可包含超电荷的多肽。第二结构域可包含蛋白质结合配偶体。如本文所用，"蛋白质结合配 偶体"包括但不限于抗体及其功能性片段、支架蛋白或肽。细胞穿透多肽可进一步包含蛋白 质结合配偶体的细胞内结合配偶体。细胞穿透多肽可能够从可引入多核苷酸、初级构建体 或_1?嫩的细胞分泌。细胞穿透多肽还可能够穿透第一细胞。
[0194] 在另一实施方案中，细胞穿透多肽能够穿透第二细胞。第二细胞可来自与第一细 胞相同的区域，或它可来自不同的区域。所述区域可包括但不限于组织和器官。第二细胞 还可位于第一细胞的近端或远端。
[0195] 在一个实施方案中，所述多核苷酸、初级构建体或mmRNA可编码可包含蛋白质结 合配偶体的细胞穿透多肽。蛋白质结合配偶体可包括但不限于抗体、超电荷的抗体或功能 性片段。所述多核苷酸、初级构建体*_RNA可引入至被引入了包含蛋白质结合配偶体的 细胞穿透多肽的细胞中。
[0196] 分泌性蛋白
[0197] 人和其它真核细胞被膜再分成许多功能不同的隔室。每个膜界定的隔室或细胞器 包含对于细胞器的功能来说必要的不同蛋白质。细胞使用"分选信号"（所述分选信号是位 于蛋白质内的氣基酸基序）来使蛋白质革巴向特定细胞器。
[0198] 被称为信号序列、信号肽或前导序列的一种类型的分选信号将一类蛋白质引导至 被称为内质网（ER)的细胞器。
[0199] 通过信号序列靶向ER的蛋白质可作为分泌性蛋白被释放至细胞外空间中。类似 地，停留在细胞膜上的蛋白质也可通过将蛋白质固持至膜的"接头"的蛋白水解裂解而分泌 至细胞外空间中。虽然不希望受理论束缚，但本发明的分子可用于采用以上所描述的细胞 运输。如此，在本发明的一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA被提供来表达分 泌性蛋白。分泌性蛋白可从本文所描述的那些或美国专利公布20100255574中的那些分 泌，所述专利公布的内容以引用的方式整体并入本文。
[0200] 在一个实施方案中，这些可用于制造大量有价值的人基因产物。
[0201] 质膜蛋白
[0202] 在本发明的一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA被提供来表达质膜 的蛋白质。
[0203] 细胞质或细胞骨架蛋白
[0204] 在本发明的一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA被提供来表达细胞 质或细胞骨架蛋白。
[0205] 细胞内膜结合蛋白
[0206] 在本发明的一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA被提供来表达细胞 内膜结合蛋白。
[0207] 核蛋白
[0208] 在本发明的一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA被提供来表达核蛋 白。
[0209] 与人类疾病相关的蛋白质
[0210] 在本发明的一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA被提供来表达与人 类疾病相关的蛋白质。
[0211] 其它蛋白质
[0212] 在本发明的一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA被提供来表达具有 目前未知的治疗功能的蛋白质。
[0213] 靶向部分
[0214] 在本发明的一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA被提供来表达靶向 部分。这些包括蛋白质结合配偶体或细胞表面上的受体，其用于使细胞在体内或体外靶向 特定组织空间或与特定部分相互作用。合适的蛋白质结合配偶体包括但不限于抗体及其功 能性片段、支架蛋白或肽。另外，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可用于指导脂质、碳水化合 物或其它生物部分或生物分子的合成和细胞外定位。
[0215] 多肽文库
[0216] 在一个实施方案中，所述多核苷酸、初级构建体或_1?嫩可用于产生多肽文库。这 些文库可由多核苷酸、初级构建体或mmRNA的群体的产生而产生，各自含有不同的结构或 化学修饰设计。在这个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA的群体可包含多种编码 的多肽，包括但不限于抗体或抗体片段、蛋白质结合配偶体、支架蛋白以及本文所教导或本 领域已知的其它多肽。在优选实施方案中，多核苷酸是本发明的初级构建体，包括可适用于 直接引入至靶细胞或培养物中的_RNA，所述靶细胞或培养物进而可合成编码的多肽。
[0217] 在某些实施方案中，可产生各自具有不同的氨基酸修饰的蛋白质的多种变体，并 且对其进行测试以便确定就药物代谢动力学、稳定性、生物相容性和/或生物活性或生物 物理学特性如表达水平而言最佳的变体。这种文库可包含10、1〇 2、1〇3、1〇4、1〇5、1〇6、1〇 7、1〇8、 IO9或超过IO9个可能的变体（包括但不限于，一个或多个残基的取代、缺失和一个或多个 残基的插入）。
[0218] 抗微生物多肽和抗病毒多肽
[0219] 本发明的多核苷酸、初级构建体和_1?嫩可设计成编码一种或多种抗微生物肽 (AMP)或抗病毒肽（AVP)。已经从广泛范围的动物例如但不限于微生物、无脊椎动物、植 物、两栖动物、鸟、鱼以及哺乳动物分离并且描述了 AMP和AVP(Wang等人，Nucleic Acids Res. 2009 ;37 (Database issue) :D933_7)。例如，抗微生物多肽描述于以下各项中：抗微生 物肤数据库（http://aps. unmc. edu/AP/main. php ;Wang 等人，Nucleic Acids Res. 2009 ; 37 (Database issue):D933-7) >CAMP ：Collection of Anti-Microbial Peptides(http:// www. bicnirrh. res. in/an timicrobial/) ；Thomas 等人,Nucleic Acids Res. 2010 ； 38(Database issue) :D774-80)、US 5221732、US 5447914、US 5519115、US 5607914、US 5714577、US 5734015、US 5798336、US 5821224、US 5849490、US 5856127、US 5905187、US 5994308、US 5998374、US 6107460、US 6191254、US 6211148、US 6300489、US 6329504、US 6399370、US 6476189、US 6478825、US 6492328、US 6514701、US 6573361、US 6573361、US 6576755、US 6605698、US 6624140、US 6638531、US 6642203、US 6653280、US 6696238、 US6727066、US 6730659、US 6743598、US 6743769、US 6747007、US 6790833、US 6794490、 US 6818407,US 6835536,US 6835713,US 6838435,US 6872705,US 6875907,US 6884776, US 6887847,US 6906035,US 6911524,US 6936432, US 7001924, US7071293,US 7078380, US 7091185、US 7094759、US 7166769、US 7244710、US 7314858 以及 US 7582301，所述文 献的内容以引用的方式整体并入本文。
[0220] 本文所描述的抗微生物多肽可通过一种或多种包膜病毒（例如HIV，HCV)来阻断 细胞融合和/或病毒进入。例如，抗微生物多肽可包含合成肽或由其组成，所述合成肽对 应于病毒包膜蛋白（例如HIV-lgpl20或gp41)的跨膜亚基的一个区，例如为至少约5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸的连续序列。HIV-lgpl20或gp41的氨基酸 和核苷酸序列描述于例如 Kuiken 等人，（2008). "HIVSequence Compendium, "Los Alamos National Laboratory 中。
[0221] 在一些实施方案中，抗微生物多肽可与对应病毒蛋白质序列具有至少约75%、 80 %、85 %、90 %、95 %、100 %的序列同源性。在一些实施方案中，抗微生物多肽可与对应病 毒蛋白质序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%或100%的序列同源性。
[0222] 在其它实施方案中，抗微生物多肽可包含合成肽或由其组成，所述合成肽对应于 衣壳结合蛋白的结合结构域的一个区，例如为至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 或60个氨基酸的连续序列。在一些实施方案中，抗微生物多肽可与衣壳结合蛋白的对应序 列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%或100%的序列同源性。
[0223]本文所描述的抗微生物多肽可阻断蛋白酶二聚作用并且抑制病毒前蛋白（例如， HIV Gag-pol加工）裂解成功能性蛋白质，从而防止一种或多种包膜病毒（例如，HIV，HCV) 的释放。在一些实施方案中，抗微生物多肽可与对应病毒蛋白质序列具有至少约75%、 80%、85%、90%、95%、100%的序列同源性。
[0224]在其它实施方案中，抗微生物多肽可包含合成肽或由其组成，所述合成肽对应于 蛋白酶结合蛋白的结合结构域的一个区，例如为至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55或60个氨基酸的连续序列。在一些实施方案中，抗微生物多肽可与蛋白酶结合蛋白的对 应序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%或100%的序列同源性。
[0225]本文所描述的抗微生物多肽可包括针对病毒病原体的体外进化的多肽。
[0226]抗微生物多肽
[0227] 抗微生物多肽（AMP)是具有可变长度、序列和结构的小肽，所述小肽具有针对包 括但不限于细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒和肿瘤/癌细胞的广泛范围微生物 的广谱活性。（参见，例如Zaiou，J Mol Med，2007;85:317;以引用的方式整体并入本文）。 已显示AMP具有广谱的快速起效的杀伤活性，连同潜在低水平的诱导抗性和伴随的广泛抗 炎作用。
[0228]在一些实施方案中，抗微生物多肽（例如，抗细菌多肽）可少于IOkDa,例如少于 81^&、61^)&、41^&、21^ &或11^&。在一些实施方案中，抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）由 约6至约100个氨基酸，例如约6至约75个氨基酸、约6至约50个氨基酸、约6至约25个 氨基酸、约25至约100个氨基酸、约50至约100个氨基酸、或约75至约100个氨基酸组 成。在某些实施方案中，抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）可由约15至约45个氨基酸组 成。在一些实施方案中，抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）是大体上阳离子性的。
[0229]在一些实施方案中，抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）可以是大体上两亲性的。在 某些实施方案中，抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）可以是大体上阳离子性的和两亲性的。 在一些实施方案中，抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）可以是针对革兰氏阳性细菌为细胞 生长抑制性的。在一些实施方案中，抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）可以是针对革兰氏 阳性细菌为细胞毒性的。在一些实施方案中，抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）可以是针 对革兰氏阳性细菌为细胞生长抑制性的和细胞毒性的。在一些实施方案中，抗微生物多肽 (例如抗细菌多肽）可以是针对革兰氏阴性细菌为细胞生长抑制性的。在一些实施方案中， 抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）可以是针对革兰氏阴性细菌为细胞毒性的。在一些实施 方案中，抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）可以是针对革兰氏阳性细菌为细胞生长抑制性 的和细胞毒性的。在一些实施方案中，抗微生物多肽可以是针对病毒、真菌、原生动物、寄生 虫、朊病毒或其组合为细胞生长抑制性的。在一些实施方案中，抗微生物多肽可以是针对病 毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合为细胞毒性的。在某些实施方案中，抗微生物 多肽可以是针对病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合为细胞生长抑制性的和细 胞毒性的。在一些实施方案中，抗微生物多肽可以是针对肿瘤或癌细胞（例如人肿瘤和/或 癌细胞）为细胞毒性的。在一些实施方案中，抗微生物多肽可以是针对肿瘤或癌细胞（例 如人肿瘤和/或癌细胞）为细胞生长抑制性的。在某些实施方案中，抗微生物多肽可以是 针对肿瘤或癌细胞（例如人肿瘤或癌细胞）为细胞毒性的和细胞生长抑制性的。在一些实 施方案中，抗微生物多肽（例如抗细菌多肽）可以是分泌性多肽。
[0230] 在一些实施方案中，抗微生物多肽包含防御素或由其组成。示例性防御素包括但 不限于α-防御素（例如，中性粒细胞防御素1、防御素α 1、中性粒细胞防御素3、中性粒细 胞防御素4、防御素5、防御素6)、β -防御素（例如，β -防御素1、β -防御素2、β -防御 素103、β -防御素107、β -防御素110、β -防御素136)和Θ -防御素。在其它实施方案 中，抗微生物多肽包含凯萨林菌素（cathelicidin)(例如，hCAP18)或由其组成。
[0231] 抗病毒多肽
[0232] 抗病毒多肽（AVP)是具有可变长度、序列和结构的小肽，所述小肽具有针对广泛 范围的病毒的广谱活性。参见，例如Zaiou，J Mol Med, 2007 ;85:317。已显示AVP具有广 谱的快速起效的杀伤活性，连同潜在低水平的诱导抗性和伴随的广泛抗炎作用。在一些实 施方案中，抗病毒多肤少于IOkDa,例如少于8kDa、6kDa、4kDa、2kDa或lkDa。在一些实施方 案中，抗病毒多肽包含约6至约100个氨基酸，例如约6至约75个氨基酸、约6至约50个 氨基酸、约6至约25个氨基酸、约25至约100个氨基酸、约50至约100个氨基酸、或约75 至约100个氨基酸或由其组成。在某些实施方案中，抗病毒多肽包含约15至约45个氨基 酸或由其组成。在一些实施方案中，抗病毒多肽是大体上阳离子性的。在一些实施方案中， 抗病毒多肽是大体上两亲性的。在某些实施方案中，抗病毒多肽是大体上阳离子性的和两 亲性的。在一些实施方案中，抗病毒多肽是针对病毒为细胞生长抑制性的。在一些实施方 案中，抗病毒多肽是针对病毒为细胞毒性的。在一些实施方案中，抗病毒多肽是针对病毒为 细胞生长抑制性的和细胞毒性的。在一些实施方案中，抗病毒多肽是针对细菌、真菌、原生 动物、寄生虫、朊病毒或其组合为细胞生长抑制性的。在一些实施方案中，抗病毒多肽是针 对细菌、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合为细胞毒性的。在某些实施方案中，抗病 毒多肽是针对细菌、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合为细胞生长抑制性的和细胞 毒性的。在一些实施方案中，抗病毒多肽是针对肿瘤或癌细胞（例如人癌细胞）为细胞毒 性的。在一些实施方案中，抗病毒多肽是针对肿瘤或癌细胞（例如人癌细胞）为细胞生长 抑制性的。在某些实施方案中，抗病毒多肽是针对肿瘤或癌细胞（例如人癌细胞）为细胞 毒性的和细胞生长抑制性的。在一些实施方案中，抗病毒多肽是分泌性多肽。
[0233] 细胞毒性核苷
[0234] 在一个实施方案中，本发明的多核苷酸、初级构建体*_RNA可结合一种或多种 细胞毒性核苷。例如，细胞毒性核苷可并入至多核苷酸、初级构建体或mmRNA如双功能修饰 的RNA或mRNA中。细胞毒性核苷抗癌剂包括但不限于阿糖腺苷、阿糖胞苷（cytarabine)、 阿糖胞苷（cytosine arabinoside)、5_氟尿啼陡、氟达拉滨、氟尿苷、FTORAfH^ (替加氟（tegafur)与尿嘧啶的组合）、替加氟（(RS) -5-氟-1-(四氢呋喃-2-基）嘧 啶-2, 4 (1H，3H)-二酮）以及6-巯基嘌呤。
[0235] 大量细胞毒性核苷类似物作为抗癌剂处于临床使用中或一直是临床试验的主 题。这类类似物的实例包括但不限于，阿糖胞苷、吉西他滨、曲沙他滨、地西他滨、替扎他滨、 2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷（DMDC)、克拉屈滨、氯法拉滨、5-氮杂胞苷、4'-硫代-阿糖胞 苷（4' -thio-aracytidine)、环戊烯基胞啼陡和I-(2-C-氰基-2-脱氧-β -D-阿拉伯-呋 喃戊糖基）_胞嘧啶。这种化合物的另一个实例是磷酸氟达拉滨。这些化合物可系统地施 用并且可具有细胞毒性剂的典型副作用，例如但不限于相对于增殖性正常细胞对肿瘤细胞 很少或没有特异性。
[0236] 本领域还报道了细胞毒性核苷类似物的许多前药。实例包括但不限于M-山嵛 酰氧基-1- β -D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、M-十八烷基-1- β -D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、 M-棕榈酰基-I- (2-C-氰基-2-脱氧-β -D-阿拉伯-呋喃戊糖基）胞嘧啶以及Ρ-4055 (阿 糖胞苷5' -反油酸酯）。一般来说，这些前药可主要在肝和系统循环中转化成活性药物并且 展示很少或不展示活性药物在肿瘤组织中的选择性释放。例如，5'-脱氧-5-氟胞苷（并且 最终是5-氟尿嘧啶）的一种前药，卡培他滨，在肝和肿瘤组织两者中代谢。一系列含有"在 生理条件下容易水解的基团"的卡培他滨类似物已由Fujiu等人（美国专利号4, 966, 891) 要求保护并且以引用的方式并入本文。由Fujiu描述的系列包括5' -脱氧-5-氟胞苷的M 氨基甲酸烷基酯和氨基甲酸芳烷基酯和以下暗示：这些化合物将在正常生理条件下通过水 解而激活以提供5' -脱氧-5-氟胞苷。
[0237] 一系列阿糖胞苷M-氨基甲酸酯已由Fadl等人（Pharmazie. 1995,50,382-7， 以引用的方式并入本文）报道，其中化合物被设计成在肝和血浆中转化成阿糖胞苷。以 引用的方式并入本文的WO 2004/041203公开了吉西他滨的前药，其中一些前药是M-氨 基甲酸酯。这些化合物被设计成克服吉西他滨的胃肠毒性并且意图在从胃肠道吸收完 整前药之后通过在肝和血楽中水解释放来提供吉西他滨。Nomura等人（Bioorg Med. Chem. 2003, 11,2453-61，以引用的方式并入本文）描述了 l-(3-C-乙炔基-β-D-核糖-呋 喃戊糖基）胞嘧啶的缩醛衍生物，所述缩醛衍生物在生物还原时产生需要在酸性条件下进 一步水解以产生细胞毒性核苷化合物的中间体。
[0238] 可作为化学治疗剂的细胞毒性核苷还包括但不限于，吡唑并[3, 4-D]-嘧啶、别嘌 呤醇、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿昔洛韦、阿糖腺 苷（ara-adenosine)、病毒唑、7-脱氮-腺苷、7-脱氮-鸟苷、6-氮杂-尿嘧啶、6-氮杂-胞 苷、胸苷核糖核苷酸、5-溴脱氧尿苷、2-氯-嘌呤以及肌苷或其组合。
[0239] 侧翼区：非翻译区（UTR)
[0240] 基因的非翻译区（UTR)被转录但不被翻译。5' UTR开始于转录起始位点并且继续 至起始密码子但不包括起始密码子；而3' UTR紧随终止密码子开始并且继续直到转录终 止信号。关于就核酸分子和翻译的稳定性而言UTR所起的调控作用存在越来越多的证据。 UTR的调控特征可并入本发明的多核苷酸、初级构建体和/或_RNA中以增强分子的稳定 性。在转录物被错误引导至所不希望的器官部位的情况下还可并入所述特定特征以确保转 录物的受控下调。
[0241] 5' UTR和翻译起始
[0242] 天然Y UTR携带在翻译起始中起作用的特征。它们拥有像Kozak序列的签名序 列，所述Kozak序列通常已知在核糖体起始许多基因的翻译的过程中有所涉及。Kozak序列 具有共有CCR(A/G)CCAUGG，其中R是在起始密码子（AUG)的上游三个碱基处的嘌呤（腺嘌 呤或鸟嘌呤），其之后是另一个"G"。还已知5' UTR形成在延伸因子结合中所涉及的二级 结构。
[0243] 通过工程化通常在特定靶器官的丰富表达的基因中发现的特征，可增强本发明的 多核苷酸、初级构建体或mmRNA的稳定性和蛋白质产生。例如，引入肝表达的mRNA(如白蛋 白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII) 的5' UTR可用于增强核酸分子（如_RNA)在肝细胞系或肝中的表达。同样，使用来自其 它组织特异性mRNA的5' UTR来改进所述组织中的表达对于以下各项来说是可能的：肌 肉（MyoD、肌球蛋白、肌红蛋白、肌细胞生成素（Myogenin)、力蛋白（Herculin))、内皮细胞 (Tie-1、CD36)、骨髓细胞（C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CDllb、MSR、Fr-1、i-NOS)、白细胞 (〇>45、〇)18)、脂肪组织（〇)36、61^43〇^30、脂联素）以及肺上皮细胞映4/%/(：/1))。
[0244] 其它非UTR序列可并入5'(或3' UTR)UTR中。例如，内含子或内含子序列的部 分可并入本发明的多核苷酸、初级构建体*_RNA的侧翼区中。并入内含子序列可增加蛋 白质产生以及mRNA水平。
[0245] 3 ^ UTR和富含AU的元件
[0246] 已知3' UTR具有嵌入它们之中的腺苷（Adenosine)和尿苷Qridine)段。这些 富含AU的签名序列在具有高更新率的基因中是特别普遍的。基于其序列特征和功能特性， 富含AU的元件（ARE)可分成三类（Chen等人，1995) :1类ARE在富含U的区内包含AUUUA 基序的几个分散的拷贝。C-Myc和MyoD包含I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠 的UUAUUUA(U/A) (U/A)九聚物。含有这种类型的ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III类 ARE的定义不太明确。这些富含U的区不包含AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是这种 类别的两个被充分研究的实例。已知大多数结合ARE的蛋白质使信使不稳定，而ELAV家族 的成员（最显著的是HuR)已被证明增加mRNA的稳定性。HuR结合所有三类的ARE。将HuR 特异性结合位点工程化至核酸分子的3' UTR中将导致HuR结合，并因此导致体内信使的稳 定化。
[0247] 3' UTR富含AU的元件的引入、去除或修饰可用于调节本发明的多核苷酸、初级构 建体或_RNA的稳定性。当工程化特定多核苷酸、初级构建体或_RNA时，可引入ARE的一 个或多个拷贝来使本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA不那么稳定并由此缩减翻译和 减少所得蛋白质的产生。同样，ARE可被鉴别和去除或突变以便增加细胞内稳定性并因此增 加翻译和所得蛋白质的产生。可使用本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA在相关细胞 系中进行转染实验，并且可在转染后的不同时间点测定蛋白质产生。例如，可用不同的ARE 工程化分子转染细胞，并且使用针对相关蛋白质的ELISA试剂盒测定转染后第6小时、第12 小时、第24小时、第48小时以及7天产生的蛋白质。
[0248] 并入微小RNA结合位点
[0249] 微小RNA (或miRNA)是19至25个核苷酸长的非编码RNA，所述非编码RNA结合 核酸分子的3' UTR并且通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。本发 明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可包含一个或多个微小RNA靶序列、微小RNA序列或微 小RNA种子。这类序列可对应于任何已知的微小RNA如美国公布US2005/0261218和美国 公布US2005/0059005中所教导的那些，所述公布的内容以引用的方式整体并入本文。
[0250] 微小RNA序列包含"种子"区，即成熟微小RNA的位置2至8的区中的序列，所述序 列与miRNA靶序列具有完美的沃森-克里克（Watson-Crick)互补性。微小RNA种子可包含 成熟微小RNA的位置2至8或2至7。在一些实施方案中，微小RNA种子可包含7个核苷酸 (例如成熟微小RNA的核苷酸2至8)，其中对应miRNA靶标中的种子互补位点由与微小RNA 位置1相反的腺嘌呤（A)侧接。在一些实施方案中，微小RNA种子可包含6个核苷酸（例如 成熟微小RNA的核苷酸2至7)，其中对应miRNA靶标中的种子互补位点由与微小RNA位置 1 相反的腺噪呤（A)侧接。参见例如，Grimson A、Farh KK、Johnston WK、Garrett-Engele P、Lim LP、Bartel DP ;Mol Cell. 2007 7 月 6 日；27(1):91-105;所述文献各自以引用的 方式整体并入本文。微小RNA种子的碱基与靶序列具有完全互补性。通过将微小RNA靶 序列工程化至本发明的多核苷酸、初级构建体或_1?嫩的3' UTR中，可靶向用于降解或 减少翻译的分子，条件是所讨论的微小RNA是可获得的。这种方法将减少核酸分子递送 时的脱靶效应的危害。已报道了微小RNA、微小RNA靶区及其表达模式和在生物学中的作 用的鉴别（Bonauer 等人，Curr Drug Targets 2010 11:943-949 ;Anand 和 Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176 ;Contreras 和 Rao Leukemia 2012 26:404-413(2011年 12 月 20 日.doi:10.1038/leu. 2011. 356) ;Bartel Cell 2009 136:215-233 ;Landgraf等 人，Cell, 2007 129:1401-1414 ;所述文献各自以引用的方式整体并入本文）。
[0251] 例如，如果核酸分子是mRNA并且不意图被递送至肝但最终被递送至肝，那么在 miR-122(在肝中丰富的一种微小RNA)的一个或多个靶位点被工程化至多核苷酸、初级构 建体或_RNA的3' UTR中的情况下，miR-122可抑制目标基因的表达。可工程化不同微小 RNA的一个或多个结合位点的引入以便进一步减少多核苷酸、初级构建体或mmRNA的寿命、 稳定性和蛋白质翻译。
[0252] 如本文所用，术语"微小RNA位点"是指微小RNA靶位点或微小RNA识别位点或微 小RNA所结合或缔合的任何核苷酸序列。应理解"结合"可遵循传统沃森-克里克杂交规 则或可反映微小RNA与靶序列在或邻近微小RNA位点处的任何稳定的缔合。
[0253] 相反地，出于本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的目的，可将微小RNA结合 位点从它们天然存在的序列中工程化出来（即，去除）以便增加特定组织中的蛋白质表达。 例如，可将miR-122结合位点去除以便改进肝中的蛋白质表达。多种组织中的表达的调控 可通过引入或去除一个或若干微小RNA结合位点来实现。
[0254] 已知微小RNA在其中调控mRNA并因此调控蛋白质表达的组织的实例包括但不限 于，肝〇1^1?-122)、肌肉（11^1?-133、11^1?-206、11^1?-208)、内皮细胞（11^1?-17-92、11^1?-126)、骨 髓细胞（miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织 (let-7、miR-30c)、心脏（miR-ld、miR-149)、肾（miR-192、miR-194、miR-204)以及肺上皮 细胞（let-7、miR-133、miR-126)。微小RNA还可调控复杂生物过程如血管生成（miR-132) (Anand 和 Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176;以引用的方式整体并入本文）。 在本发明的多核苷酸、初级构建体或_RNA中，可去除或引入在这类过程中所涉及的微小 RNA结合位点，以便针对生物上相关的细胞类型或针对相关生物过程的背景定制多核苷酸、 初级构建体或_RNA表达。微小RNA、miR序列和miR结合位点的列表在以下各项中列出： 2013年1月17日提交的美国临时申请号61/753, 661的表9、2013年1月18日提交的美国 临时申请号61/754, 159的表9以及2013年1月31日提交的美国临时申请号61/758, 921 的表7，所述申请各自以引用的方式整体并入本文。
[0255] 最后，通过理解微小RNA在不同细胞类型中的表达模式，多核苷酸、初级构建体或 _RNA可针对特定细胞类型中或仅在特定生物条件下更强靶向性的表达进行工程化。通过 引入组织特异性微小RNA结合位点，可设计将对于组织中或生物条件的背景中的蛋白质表 达来说最优的多核苷酸、初级构建体或mmRNA。列出了微小RNA用于驱动组织或疾病特异性 基因表达的用途的实例（Getner 和 Naldini, Tissue Antigens. 2012, 80:393-403 ;以引用 的方式整体并入本文）。此外，微小RNA种子位点可并入至mRNA中以减少某些细胞中的表 达，这引起生物改进。这种的实例是将miR-142位点并入至表达UGTlAl的慢病毒载体中。 miR-142种子位点的存在减少造血细胞中的表达，并因此减少抗原呈递细胞中的表达，从而 导致不存在针对病毒表达的UGTlAl的免疫应答（Schmitt等人，Gastroenterology 2010 ; 139:999-1007 ;Gonzalez_Asequinolaza 等人 Gastroenterology 2010, 139:726-729 ;两者 均以引用的方式整体并入本文）。将miR-142位点并入修饰mRNA中不仅可降低造血细胞中 编码的蛋白质的表达，而且可减少或消除对mRNA编码的蛋白质的免疫应答。将miR-142种 子位点（一个或多个）并入至mRNA中在治疗具有完全蛋白质缺陷（UGT1A1I型、LDLR-缺 陷的患者、CRIM-阴性庞佩氏（Pompe)患者等）的患者的情况下将是重要的。
[0256] 可使用工程化的多核苷酸、初级构建体或mmRNA在相关细胞系中进行转染实验， 并且可在转染后的不同时间点测定蛋白质产生。例如，可用不同的微小RNA结合位点工程 化的多核苷酸、初级构建体或mmRNA转染细胞，并且使用针对相关蛋白质的ELISA试剂盒测 定转染后第6小时、第12小时、第24小时、第48小时、第72小时以及7天产生的蛋白质。 还可使用微小RNA结合位点工程化的分子进行体内实验，以便检测所配制的多核苷酸、初 级构建体或mmRNA的组织特异性表达的变化。
[0257] 5，加帽
[0258] mRNA的Y帽结构涉及核输出，从而增加mRNA稳定性，并且结合mRNA帽结合蛋白 (CBP)，所述mRNA帽结合蛋白通过CBP与聚㈧结合蛋白缔合以形成成熟的环状mRNA物种 来负责细胞中的mRNA稳定性和翻译能力。所述帽在mRNA剪接过程中进一步帮助去除5' 近端内含子。
[0259] 内源性mRNA分子可以是5 '端加帽的，从而在末端鸟苷帽残基与mRNA分子的 5'末端转录的有义核苷酸之间产生5' -ppp-5'-三磷酸酯键联。这种5'-鸟苷酸 帽然后可被甲基化以便产生N7-甲基-鸟苷酸残基。mRNA的5'端的末端和/或前末端 (anteterminal)转录的核苷酸的核糖还可任选地是W -0-甲基化的。通过鸟苷酸帽结构 的水解和裂解的5'-脱帽可靶向用于降解的核酸分子，如mRNA分子。
[0260] 对本发明的多核苷酸、初级构建体和_RNA的修饰可产生不可水解的帽结 构，从而防止脱帽并因此增加mRNA半衰期。因为帽结构水解要求5' -ppp-5'磷酸 二酯键联的裂解，所以可在加帽反应过程中使用修饰核苷酸。例如，来自New England Biolabs(Ipswich，MA)的牛痘加帽酶可根据制造商的说明书与α-硫代-鸟苷核苷酸一 起使用以便在5' -ρρρ-5'帽中形成硫代磷酸酯键联。可使用另外修饰的鸟苷核苷酸，如 α-甲基-膦酸酯和硒代-磷酸酯核苷酸。
[0261] 另外的修饰包括但不限于mRNA(如上述）在糖环的2'-羟基上的5'-末端和 /或5'-前末端核苷酸的核糖的2' -0-甲基化。多种不同的5'帽结构可用于产生核酸 分子如mRNA分子的5'帽。
[0262] 帽类似物，在本文还被称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或结构或功能帽 类似物，在其化学结构上与天然（即内源性、野生型或生理的）5'帽不同，同时保留帽功 能。帽类似物可以是化学（即非酶）或酶合成的和/或连接至核酸分子。
[0263] 例如，抗-反向帽类似物（ARCA)帽包含通过5' -5'-三磷酸酯基团连接的两 个鸟嘌呤，其中一个鸟嘌呤包含N7甲基以及:T -0-甲基（即N7, 3' -0-二甲基-鸟 苷-5'-三磷酸酯-5'-鸟苷（m7G-3' mppp-G;其可等效地指定为3' 0-Me-m7G(5'） PPP(5'）G)。另一未修饰的鸟嘌呤的3' -0原子变成连接至加帽的核酸分子（例如mRNA 或mmRNA)的5'末端核苷酸。N7-和3' -0-甲基化的鸟嘌呤提供加帽的核酸分子（例如 mRNA或mmRNA)的末端部分。
[0264] 另一种示例性帽是mCAP，其与ARCA类似但在鸟苷上具有f -0-甲基（即 N7, 2' -0-二甲基-鸟苷-5，-三磷酸酯-5，-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
[0265] 虽然帽类似物允许核酸分子在体外转录反应中的伴随加帽，但高达20 %的转录物 可仍保持未加帽。这种情况以及帽类似物与通过内源性细胞转录机器产生的核酸的内源性 5'帽结构的结构差异可导致降低的翻译能力和降低的细胞稳定性。
[0266] 本发明的多核苷酸、初级构建体和_1?^还可在转录后使用酶加帽，以产生更真 实的5'帽结构。如本文所用，短语"更真实的"是指在结构或功能上接近地反映或模拟内源 性或野生型特征的特征。也就是说，"更真实的"特征是与现有技术的合成特征或类似物等 相比，内源性、野生型、天然或生理细胞功能和/或结构的更好表示，或在一个或多个方面 胜过对应的内源性、野生型、天然或生理特征的特征。本发明的更真实的5'帽结构的非限 制性实例是与本领域已知的合成Y帽结构（或与野生型、天然或生理Y帽结构）相比， 除其他事项之外具有帽结合蛋白的增强的结合、增加的半衰期、对5'内切核酸酶减少的敏 感性和/或减少的5'脱帽的那些实例。例如，重组牛痘病毒加帽酶和重组2' -0-甲基转 移酶可在mRNA的5'末端核苷酸与鸟嘌呤帽核苷酸之间形成规范的5' -5'-三磷酸酯键 联，其中所述帽鸟嘌呤包含N7甲基化并且mRNA的5'末端核苷酸包含2' -0-甲基。这种结 构被称为帽1结构。这种帽导致与例如本领域已知的其它Y帽类似物结构相比更高的翻 译能力和细胞稳定性以及减少的细胞促炎细胞因子的激活。帽结构包括但不限于，7mG(5'） ppp (5,）N，pN2p (帽 0)、7mG (5,）ppp (5,）NlmpNp (帽 1)以及 7mG (5,）-ppp (5,）NlmpN2mp (帽 2)。
[0267] 因为多核苷酸、初级构建体*_RNA可在转录后加帽，并且因为这种方法是更有 效的，所以接近100%的多核苷酸、初级构建体*_RNA可被加帽。这与在体外转录反应过 程中帽类似物被连接至mRNA时的约80 %形成对比。
[0268] 根据本发明，5'末端帽可包括内源性帽或帽类似物。根据本发明，5'末端帽可包 含鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括但不限于，肌苷、Nl-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、 脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷以及2-叠氮基-鸟苷。
[0269] 病毒序列
[0270] 另外的病毒序列，例如但不限于大麦黄矮病毒（BYDV-PAV)、绵羊肺腺瘤病反转 录病毒（JSRV)和/或地方性鼻内肿瘤病毒的翻译增强子序列（参见例如，国际公布号 W02012129648 ;以引用的方式整体并入本文），可被工程化并且插入本发明的多核苷酸、初 级构建体或mmRNA的：V UTR中，并且可在体外和体内刺激构建体的翻译。可在相关细胞系 中进行转染实验并且可在转染后第12小时、第24小时、第48小时、第72小时和第7天通 过ELISA测定蛋白质产生。
[0271] IRES 序列
[0272] 此外，提供可包含内部核糖体进入位点（IRES)的多核苷酸、初级构建体或mmRNA。 首先被鉴别为特征细小核糖核酸病毒RNA，IRES在不存在Y帽结构的情况下在蛋白质合 成的起始中起重要作用。IRES可用作唯一核糖体结合位点或可用作mRNA的多个核糖体结 合位点之一。含有多于一个功能性核糖体结合位点的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可编 码独立地通过核糖体翻译的几种肽或多肽（"多顺反子核酸分子"）。当多核苷酸、初级构 建体或mmRNA具有IRES时，进一步任选地提供第二可翻译区。可根据本发明使用的IRES 序列的实例包括但不限于来自以下病毒的那些：细小核糖核酸病毒（例如FMDV)、昆虫病 毒（CFFV)、脊髓灰质炎病毒（PV)、脑心肌炎病毒（ECMV)、口蹄疫病毒（FMDV)、丙型肝炎病毒 (HCV)、典型猪瘟病毒（CSFV)、鼠白血病病毒（MLV)、猿猴免疫缺陷病毒（SIV)或蟋蟀麻痹病 毒（CrPV)。
[0273] poly-A 尾
[0274] 在RNA加工过程中，可将长链腺嘌呤核苷酸（poly-A尾）添加至多核苷酸如mRNA 分子以便增加稳定性。紧随转录之后，转录物的3'端可被裂解以释放3'羟基。然后聚-A 聚合酶将腺嘌呤核苷酸链添加至RNA。被称为聚腺苷酸化的过程添加可在例如大约100与 250个之间残基长的poly-A尾。
[0275] 已发现独特的poly-A尾长度对本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA提供某些 优点。
[0276] -般来说，本发明的poly-A尾的长度大于30个核苷酸长。在另一个实施方案中， poly-A尾在长度上大于35个核苷酸（例如，至少或大于约35、40、45、50、55、60、70、80、90、 100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1，000、1，100、 1，200、1，300、1，400、1，500、1，600、1，700、1，800、1，900、2, 000、2, 500 以及 3, 000 个核苷 酸）。在一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA包括约30至约3, 000个核苷酸 (例如，30 至 50、30 至 100、30 至 250、30 至 500、30 至 750、30 至 1，000、30 至 1，500、30 至 2, 000、30 至 2, 500、50 至 100、50 至 250、50 至 500、50 至 750、50 至 1，000、50 至 1，500、50 至 2, 000、50 至 2, 500、50 至 3, 000、100 至 500、100 至 750、100 至 1，000、100 至 1，500、100 至 2, 000、100 至 2, 500、100 至 3, 000、500 至 750、500 至 1，000、500 至 1，500、500 至 2, 000、 500 至 2, 500、500 至 3, 000、1，000 至 1，500、1，000 至 2, 000、1，000 至 2, 500、1，000 至 3, 000、 1，500 至 2, 000、1，500 至 2, 500、1，500 至 3, 000、2, 000 至 3, 000、2, 000 至 2, 500 以及 2, 500 至 3, 000)。
[0277] 在一个实施方案中，相对于总体多核苷酸、初级构建体或mmRNA的长度来设计 poly-A尾。这种设计可以是基于编码区的长度、特定特征或区（如第一区或侧翼区）的长 度或基于从多核苷酸、初级构建体或mmRNA表达的最终产物的长度。
[0278] 在这种背景下，poly-A尾可在长度上大于多核苷酸、初级构建体或mmRNA或其特 征的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。？〇17-六尾还可被设计为 它所属的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的一部分。在这种背景下，poly-A尾可以是构建 体的总长度或构建体减去poly-A尾的总长度的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80 %或90 %或更多。此外，多核苷酸、初级构建体或mmRNA针对聚-A结合蛋白质的工程化 的结合位点和缀合可增强表达。
[0279] 另外，多个不同的核苷酸、初级构建体*_RNA可使用poly-A尾的：V末端处的修 饰核苷酸通过3'末端一起连接至PABP(聚-A结合蛋白）。可在相关细胞系中进行转染实 验并且可在转染后第12小时、第24小时、第48小时、第72小时和第7天通过ELISA测定 蛋白质广生。
[0280] 在一个实施方案中，本发明的多核苷酸初级构建体被设计成包括polyA-G四联 体。G四联体是可通过DNA和RNA两者中的富含G的序列形成的四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢 键合阵列。在这个实施方案中，G四联体并入在poly-A尾的末端。在不同时间点针对稳定 性、蛋白质产生和包括半衰期的其它参数来对所得mmRNA构建体进行测定。已发现polyA-G 四联体使得蛋白质产生等效于单独使用120个核苷酸的poly-A尾所观察到的蛋白质产生 的至少75%。
[0281] 量化
[0282] 在一个实施方案中，可在源自一种或多种体液的外来体中量化本发明的多核苷 酸、初级构建体或mmRNA。如本文所用，"体液"包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓 液（CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、 考珀液（cowper' s fluid)或预射精液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包 液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、 水样粪便、胰液、来自鼻窦腔的洗出液、支气管肺吸出物、胚泡腔液以及脐带血。或者，可从 选自由以下组成的组的器官撷取外来体：肺、心脏、胰脏、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、精巢、皮肤、 结肠、乳房、前列腺、脑、食道、肝以及胎盘。
[0283] 在量化方法中，从受试者获得不超过2mL的样品并且通过尺寸排阻色谱法、密度 梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附剂捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合来分离 外来体。在分析中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA的水平或浓度可以是所施用的构建体 的表达水平、存在、不存在、截短或改变。有利的是，使所述水平与一种或多种临床表型或 与用于人类疾病生物标志物的测定相关。所述测定可使用构建体特异性探针、细胞计数、 qRT-PCR、实时PCR、PCR、流式细胞术、电泳、质谱法或其组合进行，同时可使用免疫组织化学 方法如酶联免疫吸附测定（ELISA)方法分离外来体。还可通过尺寸排阻色谱法、密度梯度 离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附剂捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合来分离外来 体。
[0284] 这些方法给予研究者实时监测剩余的或所递送的多核苷酸、初级构建体或mmRNA 的水平的能力。这是可能的，因为本发明的多核苷酸、初级构建体*_RNA由于结构修饰或 化学修饰而不同于内源形式。
[0285] TT.mmRNA的贫^十和!合成
[0286] 用于根据本发明使用的多核苷酸、初级构建体*_RNA可根据任何可供使用的技 术进行制备，所述技术包括但不限于化学合成、酶合成，其通常被称为较长前体的体外转 录（IVT)或酶或化学裂解。合成RNA的方法是本领域已知的（参见例如，Gait, M.J.(编 辑）Oligonucleotide synthesis:a practical approach, Oxford[Oxfordshire], Washing ton, DC: IRL Press, 1984 ;和 Herdewi jn, P.(编辑）Oligonucleotide synthesis:methods and applications, Methods in Molecular Biology,第288卷（Clifton, N. J. )Totowa, N. J. :Humana Press, 2005 ;两者均以引用的方式并入本文）。
[0287] 设计和合成本发明的初级构建体的方法包括基因构建、mRNA产生（有或无修饰） 和纯化的步骤。在酶合成方法中，首先选择编码目标多肽的靶多核苷酸序列以用于并入载 体中，所述载体将进行扩增以产生cDNA模板。任选地，靶多核苷酸序列和/或任何侧翼序 列可进行密码子优化。然后使用cDNA模板通过体外转录（IVT)产生mRNA。产生之后，mRNA 可经历纯化和净化过程。所述步骤在下文更详细地提供。
[0288] 某闵构律
[0289] 基因构建的步骤可包括但不限于基因合成、载体扩增、质粒纯化、质粒线性化和净 化以及cDNA模板合成和净化。
[0290] 基因合成
[0291] 一旦目标多肽或靶标被选择用于产生，就设计初级构建体。在初级构建体内，编 码目标多肽的连接核苷的第一区可使用选定核酸（DNA或RNA)转录物的开放阅读框（ORF) 进行构建。ORF可包含野生型0RF、其同工型、变体或片段。如本文所用，"开放阅读框"或 "0RF"意思是指能够编码目标多肽的核酸序列（DNA或RNA)。ORF经常开始于起始密码子 ATG并且结束于无义或终止密码子或信号。
[0292] 此外，第一区的核苷酸序列可进行密码子优化。密码子优化方法是本领域已知的 并且可适用于实现几个目标中的一个或多个的工作中。这些目标包括匹配靶标和宿主生物 体中的密码子频率以确保正确折叠；偏置GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；最 小化可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运行，定制转录和翻译控制区域， 插入或去除蛋白质运输序列，在编码的蛋白质中去除/添加翻译后修饰位点（例如糖基化 位点），添加、去除或改组蛋白质结构域，插入或缺失限制性位点，修饰核糖体结合位点和 mRNA降解位点，以便调整翻译速率从而允许蛋白质的不同结构域正确地折叠，或以便减少 或消除mRNA内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域已知的，非限制性 实例包括来自 GeneArt (Life Technologies)的服务、DNA2.0 (Menlo Park CA)和 / 或专有 方法。在一个实施方案中，使用优化算法优化ORF序列。用于每种氨基酸的密码子选择在 表1中给出。
[0293] 表1.密码子选择
[0294]
【权利要求】
1. 一种分离的多核苷酸，其包括： (a) 连接核苷的第一区，所述第一区编码目标多肽，所述目标多肽选自由SEQIDNO 769-1392组成的组； (b) 位于所述第一区的5'末端的第一侧翼区，其包括： (i) 选自由以下组成的组的连接核苷的序列：编码SEQIDN0769-1392、SEQIDN0:l-4 以及其功能变体中的任一个的任何核酸的天然5'UTR;以及 (ii) 至少一个5'末端帽； (c) 位于所述第一区的3'末端的第二侧翼区，其包括： (i'）选自由以下组成的组的连接核苷的序列：编码SEQIDN0769-1392、SEQIDNO5-21以及其功能变体中的任一个的任何核酸的天然3'UTR;以及 (ii'）连接核苷的3'加尾序列。
2. 根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中连接核苷的所述第一区至少包括核 酸序列的开放阅读框，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQIDNO: 1393-21423、 21435-21438、21442-21443、21449、2145卜21473、2152卜21542、21639-2 1642、 21671-21679、21681、21682、21684、21686、21687、21724-21726、21728 以及 21730-21738。
3. 根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中连接核苷的所述3'加尾序列选自由 以下组成的组：具有大约160个核苷酸的poly-A尾和polyA-G四聚体。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸是经过纯化的。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述至少一个5'末端帽 选自由以下组成的组刃&口0、0 &口1、4此4、肌苷、附-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟 苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷以及2-叠氮基-鸟苷。
6. 根据任何前述权利要求所述的分离的多核苷酸，其中当与A、G、U或C核糖核苷酸的 化学结构比较时，所述连接核苷中的至少一个包含至少一个修饰。
7. 根据权利要求6所述的分离的多核苷酸，其中至少一个所述修饰位于核苷碱基和/ 或糖部分中。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述第一区包括n数目个 具有式（la)的连接核苷：
(la)，或其药学上可接受的盐或立体异构体， 其中 U为0、S、N(Ru)nu或C(Ru)nu，其中nu为0至2的整数，并且每个Ru独立地为H、卤代基 或任选取代的烧基； #为单键或双键； ---为单键或不存在； 尺1'、1^、1?1"、1?2"、1? 3、1?4和1?5各自独立地为11、卤代基、羟基、硫醇基、任选取代的烷基、任 选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的氨基烷氧基、任选取 代的烧氧基烧氧基、任选取代的轻基烧氧基、任选取代的氣基、置氣基、任选取代的芳基、任 选取代的氨基烷基，或不存在；其中R3与，、，'、，、妒"或^中的一个或多个的组合可以连 接在一起，形成任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基，并且连同与其相连的碳一起提 供任选取代的杂环基；其中R5与R1'、#"、#或R2"中的一个或多个的组合可以连接在一起， 形成任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基，并且连同与其相连的碳一起提供任选取代 的杂环基；并且其中R4与R1'、!?1"、!^、!?2"、!? 3或R5中的一个或多个的组合可以连接在一起， 形成任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基，并且连同与其相连的碳一起提供任选取代 的杂环基； Y\Y2和Y3各自独立地为0、S、-NRN1-、任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基，其中RN1为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基，或不存在； 每个Y4独立地为H、羟基、硫醇基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、 任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的硫代烷氧基、任选 取代的烧氧基烧氧基或任选取代的氣基； 每个Y5独立地为0、S、任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基；n为1至100,000的整数；并且 B为核碱基，其中B和R1'的组合、B和f的组合、B和R1"的组合或B和R2"的组合可连 同与其相连的碳一起任选形成双环基团，或其中B、R1"和R3的组合或B、R2"和R3的组合可 任选形成三环或四环基团。
9. 根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中B不是假尿苷（V)或5-甲基-胞苷 (m5C)。
10. 根据权利要求8-9中任一项所述的分离的多核苷酸，其中 U为0或C(Ru)nu，其中nu为1至2的整数，并且每个Ru独立地为H、卤代基或任选取代 的烧基； R1、R1'、R1"、R2、f和R2"如果存在，各自独立地为H、卤代基、羟基、任选取代的烷基、任 选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的氨基烷氧基、任选取 代的烧氧基烧氧基、任选取代的氣基、置氣基、任选取代的芳基或任选取代的氣基烧基； R3和R4各自独立地为H、齒代基、羟基、任选取代的烷基或任选取代的烷氧基烷氧基；Y\Y2和Y3各自独立地为0、S、-NRN1-、任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基，其中 RN1为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基； 每个Y4独立地为H、羟基、硫醇基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、 任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的硫代烷氧基或任选 取代的氨基； 每个Y5独立地为0或任选取代的亚烷基；并且n为10至10,000的整数。
11. 根据权利要求10所述的分离的多核苷酸，其中R1、#'和R1"如果存在，各自为H。
12. 根据权利要求11所述的分离的多核苷酸，其中R2、#和R2"如果存在，各自独立地 为H、齒代基、轻基、任选取代的烧氧基或任选取代的烧氧基烧氧基。
13. 根据权利要求10所述的分离的多核苷酸，其中R2、#和R2"如果存在，各自为H。
14. 根据权利要求13所述的分离的多核苷酸，其中R1、!^和R1"如果存在，各自独立地 为H、齒代基、轻基、任选取代的烧氧基或任选取代的烧氧基烧氧基。
15. 根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述第一区包括n数目个具有式 (Ila)的连接核苷：
(Ila)，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
16. 根据权利要求15所述的分离的多肽，其中所述第一区包括n数目个具有式（lib) 或（lie)的连接核苷，或其药学上可接受的盐。
17. 根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述第一区包括n数目个具有式 (lid)的连接核苷：
(lid)，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
18. 根据权利要求17所述的分离的多肽，其中所述第一区包括n数目个具有式（lie) 或（Ilf)的连接核苷，或其药学上可接受的盐。
19. 根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述第一区包括n数目个连接核苷， 每个所述连接核苷独立地具有式（Ilg)-(IIj)中的一个：
或其药学上可接受的盐或
立体异构体。
20. 根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述第一区包括n数目个具有式 (llk) 的连接核苷：
(llk)，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
21. 根据权利要求20所述的分离的多核苷酸，其中所述第一区包括n数目个具有式 (lll) 的连接核苷：
(lll) ，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
22. 根据权利要求20所述的分离的多核苷酸，其中所述第一区包括n数目个具有式 (llm) 的连接核苷：
(Ilm)，或其药学上可接受的盐或立体异构体， 其中 R1'、R1"、#和R2"各自独立地为H、卤代基、羟基、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、 任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的氨基烷氧基、任选取代的烷氧基烷氧 基，或不存在；并且其中#和R3的组合或R2"和R3的组合可一起形成任选取代的亚烷基或 任选取代的杂亚烷基。
23. 根据权利要求11-22中任一项所述的分离的多核苷酸，其中 U为0或C(Ru)nu，其中nu为1至2的整数，并且每个Ru独立地为H、卤代基或任选取代 的烧基； R1和R2各自独立地为H、齒代基、羟基、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代 的稀氧基、任选取代的块氧基、任选取代的氣基烧氧基、任选取代的烧氧基烧氧基、任选取 代的氨基、叠氮基、任选取代的芳基或任选取代的氨基烷基； R3和R4各自独立地为H或任选取代的烷基； Y\Y2和Y3各自独立地为0、S、-NRN1-、任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基，其中RN1为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基； 每个Y4独立地为H、羟基、硫醇基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、 任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的硫代烷氧基或任选 取代的氨基； 每个Y5独立地为0或任选取代的亚烷基；并且 n为10至10,000的整数。
24. 根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述第一区包括n数目个具有式 (Iln)的连接核苷：
(Iln)，或其药学上可接受的盐或立体异构体， 其中 U为0或C(Ru)nu，其中nu为1至2的整数，并且每个Ru独立地为H、卤代基或任选取代 的烧基； R1和R4各自独立地为H、齒代基、羟基、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代 的稀氧基、任选取代的块氧基、任选取代的氣基烧氧基、任选取代的烧氧基烧氧基、任选取 代的氨基、叠氮基、任选取代的芳基或任选取代的氨基烷基； #为0、S或-NRN1-，其中RN1为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基 或任选取代的芳基； R3"为任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基； Y\Y2和Y3各自独立地为0、S、-NRN1-、任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基，其中RN1为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基； 每个Y4独立地为H、羟基、硫醇基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、 任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的硫代烷氧基或任选 取代的氣基； 每个Y5独立地为0、S、任选取代的亚烷基（例如亚甲基）或任选取代的杂亚烷基；并且 n为10至10,000的整数。
25. 根据权利要求8-24中任一项所述的分离的多核苷酸，其中在所述n数目个B中，每 个B独立地具有选自式（bl)-(b5)的式：

或其药学上可接受的盐或立体异构体， I' 其中 在式（bl)中连接V1和V2的、为单键或双键； T1'、!'1"、，和T2"各自独立地为H、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基或任选取代的硫 代烷氧基，或T1'和T1"的组合或俨和T2"的组合连接在一起形成0 (氧代基）、S(硫代基） 或Se(硒代基）； V1和V2各自独立地为0、S、N(Rvb)nv或C(Rvb)nv，其中nv为0至2的整数，并且每个Rvb 独立地为H、齒代基、任选取代的氨基酸、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔 基、任选取代的烧氧基、任选取代的稀氧基或任选取代的块氧基； R1CI为H、齒代基、任选取代的氨基酸、羟基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取 代的块基、任选取代的氣基烧基、任选取代的烧氧基、任选取代的烧氧基撰基烧基、任选取 代的烷氧基羰基烷氧基、任选取代的羧基烷氧基、任选取代的羧基烷基或任选取代的氨基 甲酰基烷基； R11为H或任选取代的烷基； R12a为H、任选取代的烷基或任选取代的氨基烷基；并且 R12c；为H、齒代基、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的硫代烷氧基、任选取 代的氨基或任选取代的氨基烷基。
26. 根据权利要求8-25中任一项所述的分离的多核苷酸，其中n数目个B具有式 (b6)-(b9)：

或其药学上可接受的盐或立体异构体， 其中 '、为单键或双键； T1'、!'1"、，和T2"各自独立地为H、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基或任选取代的硫 代烷氧基，或T1'和T1"的组合或俨和T2"的组合连接在一起形成0 (氧代基）、S(硫代基） 或Se(硒代基）； W1和W2各自独立地为N(RWa)nw或C(RWa)nw，其中nw为0至2的整数，并且每个RWa独立 地为H、任选取代的烷基或任选取代的烷氧基； 每个V3独立地为0、S、N(RVa)nv或C(RVa)nv，其中nv为0至2的整数，并且每个RVa独立 地为H、齒代基、任选取代的氨基酸、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任 选取代的杂环基、任选取代的烷杂环基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基或任选取代 的炔氧基，并且其中RVa和R12c；连同与其相连的碳原子一起可形成任选取代的环烷基、任选 取代的芳基或任选取代的杂环基； R12a为H、任选取代的烷基、任选取代的氨基烷基，或不存在； R12b为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的烷芳基、任选 取代的杂环基、任选取代的烷杂环基或任选取代的氨基酸，其中R12b和T1'的组合或R12b和 R12c；的组合可连接在一起，形成任选取代的杂环基；并且 R12c；为H、齒代基、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的硫代烷氧基、任选取 代的氨基或任选取代的氨基烷基。
27. 根据权利要求26所述的分离的多核苷酸，其中R12a、R12b、R12c;或RVa被-(CH2) s2(0CH2CH2)s1(CH2)s30R'取代，其中si为1至10的整数，s2和s3各自独立地为0至10的整 数，并且R' 为H或(V2(l 烷基；或被-NRN1 (CH2) s2 (CH2CH20)sl (CH2)s3NRn1 取代，其中si为 1 至 10的整数，s2和s3各自独立地为0至10的整数，并且每个RN1独立地为氢或任选取代的 C卜6烧基。
28. 根据权利要求8-27中任一项所述的分离的多核苷酸，其中n数目个B具有式 (bl0)-(bl4)：

或其药学上可接受的盐或立体异构体， f和T3"各自独立地为H、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基或任选取代的硫代烷氧 基，或T3'和T3"的组合连接在一起，形成0 (氧代基）、S(硫代基）或Se(硒代基）； 每个V4独立地为0、S、N(RVe)nv或C(RVe)nv，其中nv为0至2的整数，并且每个Rv。独立 地为H、齒代基、任选取代的氨基酸、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任 选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基或任选取代的杂环基、任选取代的烷杂环基或任选取 代的炔氧基，其中R13b和RVc；的组合可一起形成任选取代的杂环基； R13a和R13b各自独立地为H、任选取代的酰基、任选取代的烷基或任选取代的烷氧基，其 中R13b和R14的组合可一起形成任选取代的杂环基； 每个R14独立地为H、齒代基、羟基、硫醇基、任选取代的酰基、任选取代的氨基酸、任选 取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的羟基烷基、任选取代的烷氧基、 任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的氨基烷氧基、任选取代的烷氧基烷氧 基、任选取代的氨基、叠氮基、任选取代的芳基、任选取代的杂环基、任选取代的烷杂环基或 任选取代的氣基烧基；并且 R15和R16各自独立地为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基。
29.根据权利要求7-27中任一项所述的分离的多核苷酸，其中n数目个B具有式 (bl5)-(bl7)：

或其药学上可接受的盐或立体异构体， ? 其中 T4'、T4"、T5\T5"、T6'和T6"各自独立地为H、任选取代的烷基或任选取代的烷氧基，并且 其中T4'和T4"的组合或f和T5"的组合或T6'和T6"的组合一起形成0、S或Se; V5和V6各自独立地为0、S、N(Rvd)nv或C(Rvd)nv，其中nv为0至2的整数，并且每个Rvd独 立地为H、齒代基、任选取代的氨基酸、氰基、脒基、任选取代的氨基烷基、任选取代的烷基、 任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基或任选取代的炔 氧基；并且 R17、R18、R19a、R19b、R21、R22、R23和R24各自独立地为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、 任选取代的炔基或任选取代的氨基酸。
30. 根据权利要求8-29中任一项所述的多核苷酸，其中n数目个B具有式 (bl8)-(b20)：

或其药学上可接受的盐或立体异构体， i 其中 每个V7独立地为0、S、N(RVe)nv或C(RVe)nv，其中nv为0至2的整数，并且每个RVe独立 地为H、齒代基、任选取代的氨基酸、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任 选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基或任选取代的炔氧基； 每个R25独立地为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基； R26a和R26b各自独立地为H、任选取代的酰基、任选取代的氨基酸、任选取代的氨基甲酰 基烧基、任选取代的烧基、任选取代的稀基、任选取代的块基、任选取代的轻基烧基、任选取 代的羟基烯基或任选取代的烷氧基； 每个R27独立地为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的 烷氧基或任选取代的氨基； 每个R28独立地为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基；并且 每个R29独立地为H、任选取代的酰基、任选取代的氨基酸、任选取代的氨基甲酰基烷 基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的羟基烷基、任选取代的 羟基烯基、任选取代的烷氧基或任选取代的氨基。
31. 根据权利要求30所述的分离的多核苷酸，其中R26a、R26b或R29被-(CH2) s2 (0CH2CH2) sl (CH2)s30R'取代，其中si为1至10的整数，s2和s3各自独立地为0至10的整数，并且R' 为H或 烷基；或被-NRN1 (CH2) s2 (CH2CH20)sl (CH2)s3NRn1 取代，其中si为 1 至 10 的整数， s2和s3各自独立地为0至10的整数，并且每个RN1独立地为氢或任选取代的Ck烧基。
32. 根据权利要求8-31中任一项所述的分离的多核苷酸，其中n数目个B具有式 (b21)：
(b21)，或其药学上可接受的盐或立体异构体， 其中X12独立地为0、S、任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基；xa为0至3的整数；R12a为H、任选取代的烷基、任选取代的氨基烷基，或不存在；并且T2为0、S或Se。
33. 根据权利要求8-32中任一项所述的分离的多核苷酸，其中n数目个B具有式 (b22)：
(b22)，或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中R1(l'独立地 为任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂环 基、任选取代的氣基烧基、任选取代的烧氧基，任选取代的烧氧基撰基烧基、任选取代的烧 氧基羰基烷氧基、任选取代的羧基烷氧基、任选取代的羧基烷基或任选取代的氨基甲酰基 烷基；R11为H或任选取代的烷基；R12a为H、任选取代的烷基、任选取代的氨基烷基，或不存 在；并且T1和T2各自独立地为0、S或Se。
34. 根据权利要求8-33中任一项所述的分离的多核苷酸，其中n数目个B具有式 (b23)：
(b23)，其中R1(l为任选取代的杂环基或任选取代的芳基；R11为H或任 选取代的烷基；R12a为H、任选取代的烷基、任选取代的氨基烷基，或不存在；并且T1和T2各 自独立地为〇、S或Se。
35. 根据权利要求8-34中任一项所述的分离的多核苷酸，其中n数目个B具有式 (b24)：
(b24)，其中 T3 为 0、S或Se; R13a和R13b各自独立地为H、任选取代的酰基、任选取代的烷基或任选取代的烷氧基，其 中R13b和R14的组合可一起形成任选取代的杂环基； R14'独立地为任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、任 选取代的杂环基、任选取代的烷杂环基、任选取代的烷芳基、任选取代的氨基烷基、任选取 代的烧氧基、任选取代的烧氧基撰基烧基、任选取代的烧氧基撰基烧氧基、任选取代的竣基 烷氧基、任选取代的羧基烷基或任选取代的氨基甲酰基烷基；并且 每个R15独立地为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基。
36. 根据权利要求1-35中任一项所述的分离的多核苷酸，其进一步包括祀向部分，其 中所述靶向部分共价结合至所述多核苷酸。
37. 根据权利要求36所述的分离的多核苷酸，其中所述靶向部分为抗体、促甲状腺 素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、 N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价 半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶 酸盐、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物或适体。
38. -种包含如权利要求1-37中任一项所述的分离的多核苷酸的药物组合物。
39. -种包含如权利要求1-37中任一项所述的分离的多核苷酸和药学上可接受的赋 形剂的药物组合物。
40. 根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述赋形剂选自：溶剂、水性溶剂、非水 性溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防 腐剂、脂质、类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、聚合物、脂质复合肽、蛋白质、 细胞、透明质酸酶以及其混合物。
41. 根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含脂质，并且其中 所述脂质选自DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、 DODMA、DSDMA、DLenDMA、reLNP、PLGA和PEG化脂质以及其混合物。
42. -种在哺乳动物细胞、组织或生物体中产生目标多肽的方法，其包括向所述细胞、 组织或生物体施用如权利要求1-37中任一项所述的分离的多核苷酸或如权利要求38-41 中任一项所述的药物组合物。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中所述分离的多核苷酸是经过配制的。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述制剂包括脂质，所述脂质选自DLin-DMA、 DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DODMA、DSDMA、DLenDMA、 reLNP、PLGA、PEG化脂质以及其混合物或组合中的一者。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述分离的多核苷酸以在lug与150ug之间的 总每日剂量施用。
46. 根据权利要求45所述的方法，其中通过注射进行施用。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中施用为皮内或皮下或肌内或玻璃体内的。
48. 根据权利要求45所述的方法，其中在施用后至少两小时，所述哺乳动物的血清中 所述目标多肽的水平为至少50pg/mL。
49. 根据权利要求45所述的方法，其中在施用后，所述哺乳动物的血清中所述目标多 肽的所述水平保持高于50pg/mL持续至少72小时。
50. 根据权利要求49所述的方法，其中在施用后，所述哺乳动物的血清中所述目标多 肽的所述水平保持高于60pg/mL持续至少72小时。
51. 根据权利要求44所述的方法，其中所得的多核苷酸制剂具有80nm-160nm的平均粒 度、在0. 02与0. 20之间的以及在10至20之间的脂质与多核苷酸比（wt/wt)。
52. -种用于在哺乳动物细胞、组织或生物体中产生增加水平的选自由SEQIDNO 769-1392组成的组的目标多肽的方法，其包括以两次或更多次相等或不相等的分剂量向所 述细胞、组织或生物体施用总每日剂量的如权利要求4-37中任一项所述的分离的多核苷 酸或如权利要求38-41中任一项所述的药物组合物。
53. 根据权利要求52所述的方法，其中响应于所述施用而产生的所述多肽的所述水平 高于通过施用作为单次施用的相同的总每日剂量的所述分离的多核苷酸或药物组合物所 产生的所述水平。
54. 根据权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物生物体为需要增加水平的所述目 标多肽的人类患者。
55. 根据权利要求54所述的方法，其中所述增加水平的所述目标多肽在所述患者的体 液中是可检测的。
56. 根据权利要求55所述的方法，其中所述体液选自由以下组成的组：外周血、血清、 血浆、腹水、尿液、脑脊液（CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺 泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜和腹膜 液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜 分泌物、水样粪便、胰液、来自鼻窦腔的洗出液、支气管肺吸出物、胚泡腔液以及脐带血。
57. 根据权利要求56所述的方法，其中所述体液为血清并且所述多肽/单位药物 (PUD)大于 1。
58. 根据权利要求57所述的方法，其中所述剂量分割因子（DSF)大于4。
59. 根据权利要求55所述的方法，其中施用是透皮的。
60. 根据权利要求59所述的方法，其中透皮施用包括利用选自由以下组成的组的一个 或多个成员：贴剂、霜剂、软膏剂、机械装置、针头、海绵、贮库和织物。
61. 根据权利要求59所述的方法，其中根据给药方案进行施用，所述给药方案历经数 小时、数天、数周、数月或数年的过程发生。
62. 根据权利要求52所述的方法，其中所述两个或更多个分剂量包括在时间T1施用的 第一剂量的所述多核苷酸或药物组合物，之后是在时间T2施用的第二剂量的所述多核苷 酸或药物组合物，其中所述时间T1和所述时间T2相隔不超过1分钟，并且其中所述第一剂 量和所述第二剂量以一定量施用，所述量在所述受试者中产生比在以单次单位剂量一起施 用所述量的多核苷酸或药物组合物时更高水平的所述目标多肽。
63. 根据权利要求62所述的方法，其进一步包括在时间Tn施用多次剂量的所述多核苷 酸或药物组合物Nx，其中x和n独立地选自3至约1000,并且其中Tn与Tn+1之间的时间 相隔不超过10秒的增量。
64. 根据权利要求63所述的方法，其中通过直接注射进行施用。
65. 根据权利要求64所述的方法，其中直接注射选自由以下组成的组：静脉内、皮内、 皮下、肌内和玻璃体内。
66. 根据权利要求64所述的方法，其中接近所述第二或多次剂量施用所述第一剂量。
67. 根据权利要求64所述的方法，其中远离所述第二或多次剂量施用所述第一剂量。
68. 根据权利要求64所述的方法，其中所述第一剂量的注射部位与任何第二或多次剂 量的注射部位之间的距离为约1mm至约l〇cm。
69. 根据权利要求64所述的方法，其中在0. 1mm至约lcm的深度处进行注射。
70. 根据权利要求65所述的方法，其中通过使用选自以下的一个或多个装置实现直接 注射：多针注射系统、导管或管腔系统，以及基于超声、电或放射的系统。
71. 根据权利要求63所述的方法，其中以任何剂量施用的多核苷酸或药物组合物的所 述量大体相等。
72. 根据权利要求63所述的方法，其中时间T1和时间T2相隔不超过30秒。
73. 根据权利要求63所述的方法，其中时间T1和时间T2相隔不超过10秒。
74. 根据权利要求63所述的方法，其中所述第一剂量、所述第二剂量以及多次剂量中 的任何一个在大体相同时间施用。
75. 根据权利要求63所述的方法，其中所述单次单位剂量在约10mg/kg与约500mg/kg 之间。
76. 根据权利要求63所述的方法，其中所述单次单位剂量在约1.0mg/kg与约10mg/kg 之间。
77. 根据权利要求63所述的方法，其中所述单次单位剂量在约0. 00lmg/kg与约 1.Omg/kg之间。
78. -种制备编码目标多肽的多核苷酸的脂质纳米颗粒制剂的方法，其包括将第一乙 醇溶液快速注射到第二水溶液中，其中 (a) 所述第一乙醇溶液包括脂质：DSPC:胆固醇：PEG-c-DOMG的混合物，以得到 50:10:38. 5:1. 5的摩尔比并且具有大约25mM的最终脂质浓度，并且 (b) 所述第二水溶液包括具有l_2mg/mL的浓度和大约3的pH的编码所述目标多肽的 所述多核苷酸的柠檬酸钠缓冲溶液， 其中所述快速注射产生具有33%乙醇和至少10:1的总脂质与多核苷酸重量比的混悬 液。
79. 根据权利要求78所述的方法，其中手动（MI)或借助于注射泵（SP)执行所述快速 注射。
80. 根据权利要求79所述的方法，其进一步包括对pH7. 4的磷酸盐缓冲盐水（PBS)透 析所得到的混悬液。
81. 根据权利要求80所述的方法，其中不止一次执行透析。
82. 根据权利要求81所述的方法，其进一步包括通过0. 2ym无菌过滤器过滤经透析的 混悬液。
83. 根据权利要求78-82中任一项所述的方法，其中所述脂质选自由以下组成的组： DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DODMA、DSDMA、 DLenDMA、reLNP、PLGA以及PEG化脂质。
84. 根据权利要求78-83中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸选自如权利要求 1-37中任一项所述的多核苷酸。
85. -种编码目标多肽的多核苷酸的脂质纳米颗粒制剂，其通过如权利要求78-84中 任一项所述的方法产生并且具有80nm-160nm的粒度、在0. 02与0. 20之间的PDI以及在10 至30之间的脂质与多核苷酸比（wt/wt)。
86. 根据权利要求85所述的脂质纳米颗粒制剂，其中所述多核苷酸选自如权利要求 1-37中任一项所述的多核苷酸。
87. -种多核苷酸的reLNP制剂，所述多核苷酸编码目标多肽。
88. 根据权利要求87所述的reLNP制剂，其中所述多核苷酸选自如权利要求1-36中任 一项所述的多核苷酸。
89. -种多核苷酸的持续释放制剂，所述多核苷酸编码目标多肽。
90. 根据权利要求89所述的持续释放制剂，其中所述多核苷酸选自如权利要求1-36中 任一项所述的多核苷酸。
91. 一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包括第一多肽和第二多肽。
92. 根据权利要求91所述的多核苷酸，其中所述第一多肽选自由以下组成的组：Fc受 体、Fab片段、Fab'片段、F(ab'）2片段、Fv片段、IgA结构域、IgD结构域、IgE结构域、IgD 结构域、IgM结构域、IgV结构域、IgCl结构域、IgC2结构域以及Igl结构域，并且所述第二 多肽为目标多肽。
【文档编号】C12N15/85GK104411338SQ201380028773
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年3月9日 优先权日:2012年4月2日
【发明者】斯蒂芬·邦塞尔, 提尔塔·柴可拉博提, 安东宁·德富热罗勒, S·M·伊巴希尔, 马蒂亚斯·约翰, 阿坦恩·洛依, 苏珊·沃利斯基, K·M·伍德, 保罗·哈塔拉, 杰森·P·斯洛姆, 凯内齐·伊杰贝, 杰夫·L·埃尔斯沃思, 贾斯汀·基尔德 申请人:现代治疗公司