专利名称：一种蛋白质赖氨酸巴豆酰化修饰的检测及亲和试剂开发的方法
技术领域：
本发明是关于检测蛋白巴豆酰化的试剂和方法的发明。更具体来说，是与衍生自组蛋白或组蛋白片段中，含巴豆酰化位点的多肽相关，并应用这些多肽开发检测蛋白巴豆酰化的试剂和方法。
背景技术：
调控细胞过程和疾病进展的翻译后修饰(PTM)分子解剖学是后基因组生物学研究的主要目标之一。迄今为止，已发现300多种翻译后修饰。这是使蛋白基本结构甚至功能发生改变的有效方式。赖氨酸侧链上的修饰证明了分子网络的巨大复杂性。赖氨酸是由15个核糖体编码并已知可被修饰的氨基酸残基。赖氨酸侧链具有两种特性:电荷丰富和亲核性，适合翻译后修饰与不同的亲电底物以共价键结合。赖氨酸上可发生很多种翻译后修饰，如甲基化，乙酰化，生物素化，泛素化和sumo化修饰，这些修饰在细胞生理和病理中有重要作用。匕匕如,组蛋白 已知可被一系列的PTM修饰，如甲基化，乙酰化，泛素化，sumo化和核糖体化。组蛋白上的一系列PTM组合称作“组蛋白编码”，左右了蛋白在基因表达和染色体动态学方面的作用。生物化学(Jenuwein等,2001)和质谱学(Garcia等,2007 ;Boyne等，2006 ；Medzihradszky 等,2004)都在研究组蛋白 PTM。组蛋白上的赖氨酸可被乙酰化修饰。赖氨酸乙酰化是一种丰度高，可逆的，并高度调控的PTM。通常与基因活性高度相关。虽然开始是在组蛋白中发现的，但随后发现在非组蛋白的蛋白中如P53也存在赖氨酸乙酰化。最近，蛋白质组学筛选发现乙酰化赖氨酸不仅丰度高，存在于多种细胞器的底物中，而且具有不同的功能。有趣的是，这种修饰富集在线粒体蛋白和代谢酶中，意味着这种修饰在微调细胞器的功能和能量代谢方面发挥功能。赖氨酸乙酰化在各种细胞过程，如凋亡、代谢、转录和应激反应中发挥重要作用。除了在基础生物学方面的作用，赖氨酸乙酰化及其调控酶(乙酰化转移酶和去乙酰化酶)与衰老和几种主要的疾病如癌症，神经变性疾病和心血管疾病也紧密相关。开发组蛋白和非组蛋白中与不同疾病相关的翻译后修饰的检测试剂和方法有广大市场需求。
发明内容
本发明是应用衍生自组蛋白并含巴豆酰化修饰位点的多肽，开发蛋白巴豆酰化的检测试剂与方法，尤其是巴豆酰化位点特异性的试剂和方法。本发明提供了衍生自组蛋白或其片段并包含巴豆酰化修饰位点的多肽，通常包含6-14个氨基酸。其巴豆酰化位点可能巴豆酰化也可能未巴豆酰化。组蛋白可从人、小鼠、果蝇、线虫和酵母等真核细胞中获得。最好是从人、灵长类、小鼠、大鼠、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、狗和猫等哺乳细胞中分离。巴豆酰化位点可能选自人源 Hl.2K33, H1.2K63, H1.2K84, H1.2K89, H1.2K96,H1.2KI58, H1.2K167, H2AK36, H2AK118, H2AK119, H2AK125, H2BK5, H2BK11，H2BK12,H2BKI5, H2BK16, H2BK20, H2BK23, H2BK34, H3K4, H3K9, H3K18, H3K23, H3K27, H3K56,H4K5, H4K8, H4K12 和 H4K16 位点。组蛋白可以是人源H1.2组蛋白，其编号为SEQ ID:1。巴豆酰化位点可选自H1.2K33, H1.2K63, H1.2K84, H1.2K89, H1.2K96, H1.2K158 和 H1.2K167 位点。组蛋白可以是人源H2A组蛋白，其编号为SEQ ID:2。巴豆酰化位点可选自H2AK36, H2AK118, H2AK119 和 H2AK125 位点。组蛋白可以是人源H2B组蛋白，其编号为SEQ ID:3。巴豆酰化位点可选自H2BK5, H2BK11，H2BK12, H2BK15, H2BK16, H2BK20, H2BK23 和 H2BK34 位点。组蛋白可以是人源H3组蛋白，其编号为SEQ ID:4。巴豆酰化位点可选自H3K4, H3K9, H3K18, H3K23, H3K27 和 H3K56 位点。组蛋白可以是人源H4组蛋白，其编号为SEQ ID:5。巴豆酰化位点可选自H4K5，15H4K8, H4K12 和 H4K16 位点。巴豆酰化位点可选自小鼠 Hl.2Κ33，Η1.2K63, H1.2Κ84, H1.2Κ158, H1.2Κ167,Η2ΑΚ36, Η2ΑΚ118, Η2ΒΚ5, Η2ΒΚ11，Η2ΒΚ12, Η2ΒΚ15, Η2ΒΚ16, Η2ΒΚ20, Η2ΒΚ23, Η2ΒΚ34,Η3Κ4, Η3Κ9, Η3Κ18, Η3Κ23, Η3Κ27, Η3Κ56, Η4Κ5, Η4Κ8 和 Η4Κ16 位点。组蛋白可以是小鼠Hl.2组蛋白，其编号为SEQ ID:6。巴豆酰化位点可选自小鼠H1.2K33, H1.2K63, H1.2K84, H1.2K158 和 H1.2K167 位点。组蛋白可以是小鼠H2A组蛋白，其编号为SEQ ID:7。巴豆酰化位点可选自小鼠H2AK36 和 H2AK118 位点。组蛋白可以是小鼠H2B组蛋白，其编号为SEQ ID:8。巴豆酰化位点可选自小鼠H2BK5, H2BK11，H2BK12, H2BK15, H2BK16, H2BK20, H2BK23 和 H2BK34 位点。组蛋白可以是小鼠H3组蛋白，其编号为SEQ ID:9。巴豆酰化位点可选自小鼠H3K4, H3K9, H3K18, H3K23, H3K27 和 H3K56 位点。组蛋白可以是小鼠H4组蛋白，其编号为SEQ ID:10。巴豆酰化位点可选自小鼠H4K5, H4K8 和 H4K16 位点。多肽序列为CQLATKAA 或 CYQKSTELL。本发明提供了一种可与含巴豆酰化位点的组蛋白或组蛋白片段特异性结合的抗体制备方法。包括:(a)用制备此抗体的多肽免疫原免疫宿主动物；(b)收集宿主动物血清。多肽免疫原，衍生自组蛋白或其片段，包含巴豆酰化位点。方法中还包括从血清中纯化抗体和利用宿主动物脾脏细胞制备单克隆抗体的方法。在一些实施例中，抗体可与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白或其片段特异性结合，而不与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白或其片段结合。在另外一些实施例中，抗体可与巴豆酰化位点未发生巴豆酰化的组蛋白或其片段特异性结合，而不与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白或其片段结合。多肽免疫原可能是本发明分离的多肽。本发明提供了可与包含巴豆酰化位点的组蛋白或组蛋白片段特异性结合的抗体，最好是巴豆酰化位点特异性抗体。在一些实施例中，抗体可与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白或其片段特异性结合，而不与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白或其片段结合。在另外一些实施例中，抗体可与巴豆酰化位点未发生巴豆酰化的组蛋白或其片段特异性结合，而不与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白或其片段结合。抗体是应用本发明提供的抗体生产方法生产出来的。巴豆酰化位点可选自人 Hl.2K33, H1.2K63, H1.2K84, H1.2K89, H1.2K96,H1.2K158, H1.2K167, H2AK36, H2AK118, H2AK119, H2AK125, H2BK5, H2BK11，H2BKI2,H2BKI5, H2BKI6, H2BK20, H2BK23, H2BK34, H3K4, H3K9, H3K18, H3K23, H3K27, H3K56,H4K5, H4K8, H4K12 和 H4K16 位点。或小鼠 Hl.2K33, H1.2K63, H1.2K84, H1.2K158,H1.2K167, H2AK36, H2AK118, H2BK5, H2BK11，H2BKI2, H2BKI5, H2BKI6, H2BK20,H2BK23, H2BK34, H3K4, H3K9, H3K18, H3K23, H3K27, H3K56, H4K5, H4K8和H4K16位点。结合分离的抗体，组蛋白可能是编号为SEQ 10:1的人源!11.2组蛋白。巴豆酰化位点可选自人 Hl.2Κ33，Η1.2K63, H1.2Κ84, H1.2Κ89, H1.2Κ96, Η1.2Κ158 和 Η1.2Κ167位点。组蛋白可能是编号为SEQ ID:2的人源Η2Α组蛋白。巴豆酰化位点可选自人H2AK36,H2AK118, H2AK119和H2AK125位点。组蛋白可能是编号为SEQ ID:3的人源H2B组蛋白。巴豆酰化位点可选自人H2BK5，H2BK11，H2BK12, H2BK15, H2BK16, H2BK20, H2BK23和H2BK34位点。组蛋白可能是编号为SEQ ID:4的人源H3组蛋白。巴豆酰化位点可选自人H3K4，H3K9, H3K18, H3K23, H3K27和H3K56位点。组蛋白可能是编号为SEQ ID:5的人源H4组蛋白。巴豆酰化位点可选自人H4K5，15 H4K8, H4K12和H4K16位点。结合分离的抗体，组蛋白可能是编号为SEQ 10:6的小鼠!11.2组蛋白。巴豆酰化位点可选自小鼠HL 2K33，HL 2K63，H1.2K84, H1.2K158和H1.2K167位点。组蛋白可能是编号为SEQ ID: 7的小鼠H2A组蛋白。巴豆酰化位点可选自小鼠H2AK36和H2AK118位点。组蛋白可能是编号为SEQ ID:8的小鼠H2B组蛋白。巴豆酰化位点可选自小鼠H2BK5，H2BK11, H2BK12, H2BK15, H2BK16, H2BK20, H2BK23 和 H2BK34 位点。组蛋白可能是编号为SEQ ID:9的小鼠H3组蛋白。巴豆酰化位点可选自小鼠H3K4，H3K9, H3K18, H3K23,H3K27和H3K56位点。组蛋白可能是编号为SEQ ID: 10的小鼠H4组蛋白。巴豆酰化位点可选自小鼠H4K5，H4K8和H4K16位点。抗体可能是抗 原结合部分或单链抗体；可能是多克隆或单克隆抗体。单克隆抗体可能是通过噬菌体文库，合成蛋白文库或酵母文库筛选制备的。本发明提供了一株可分泌单克隆抗体的永生细胞株。本发明提供了样品中蛋白巴豆酰化的检测方法。包括:(a)样品与抗体结合形成结合复合物；(b)检测结合复合物。当包含巴豆酰化位点的组蛋白或其片段巴豆酰化时，抗体与之特异性结合。若检测到结合复合物，表示样品中含蛋白巴豆酰化。抗体与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白或其片段特异性结合更好。蛋白巴豆酰化可能是组蛋白巴豆酰化。巴豆酰化位点可能选自人Hl.2K33, H1.2K63, H1.2K84, H1.2K89, H1.2K96,H1.2K158, H1.2K167, H2AK36, H2AK118, H2AK119, H2AK125, H2BK5, H2BK11，H2BKI2,H2BKI5, H2BKI6, H2BK20, H2BK23, H2BK34, H3K4, H3K9, H3K18, H3K23, H3K27, H3K56,H4K5, H4K8, H4K12 和 H4K16 位点；以及小鼠 Hl.2K33, H1.2K63, H1.2K84, H1.2K158,H1.2K167, H2AK36, H2AK118, H2BK5, H2BK11，H2BKI2, H2BKI5, H2BKI6, H2BK20,H2BK23, H2BK34, H3K4, H3K9, H3K18, H3K23, H3K27, H3K56, H4K5, H4K8 和 H4K16 蛋白。本发明分离的抗体可应用于这种检测方法。检测样品为取自实验对象的生物学样品。本发明提供了检测样品中蛋白巴豆酰化的试剂盒。试剂盒包括当组蛋白或片段巴豆酰化时，与包含巴豆酰化位点的组蛋白或片段可特异性结合，而当组蛋白或片段未巴豆酰化时，与包含巴豆酰化位点的组蛋白或片段不能结合的抗体。与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白或其片段可特异性结合，而与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白或其片段不能结合的抗体更好。抗体是本发明分离纯化的抗体。蛋白巴豆酰化是组蛋白巴豆酰化。本发明提供了一种融合指示蛋白。融合指示蛋白的核心一侧为荧光供体部分，一侧为荧光受体部分，由(a)含巴豆酰化位点的组蛋白多肽和(b)巴豆酰化结合域组成。在一些实施例中，组蛋白多肽的巴豆酰化位点未巴豆酰化，而巴豆酰化结合域可与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白多肽特异性结合，不与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白多肽结合。在另外一些实施例中，组蛋白多肽的巴豆酰化位点巴豆酰化，巴豆酰化结合域可与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白多肽结合，不与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白多肽结合。组蛋白多肽衍生自包含巴豆酰化位点的组蛋白或其片段，可能为本发明分离的多肽。巴豆酰化位点可位于组蛋白的N端，C端和核心区域。组蛋白选自人和小鼠的Hl.2，H2A, H2B, H3,和H4组蛋白。融合指示蛋白可能还包括一个或多个巴豆酰化结合域。巴豆酰化结合域可能衍生自本发明分离纯化的抗体。在融合指示蛋白中，组蛋白多肽可能通过交联分子与巴豆酰化结合域相偶联。供体荧光部分可能选自从青荧光蛋白(CFP)，增强型青荧光蛋白(ECFP)或A206K突变体。受体荧光部分可能选自黄荧光蛋白(YFP)，增强型黄荧光蛋白(EYFP) ,Citrine，Venus和A206K突变体。融合指示蛋白还可能包括某种导向多肽。导向多肽可选自受体配体，核定位序列(NLS)，核输出信号(NES)，质膜导向信号，组蛋白结合蛋白和核蛋白。本发明提供了如何确定样品中蛋白巴豆酰化含量的方法。方法包括(a)样品与融合指示蛋白反应；(b)比较与样品反应前后荧光供体和荧光受体间荧光共振能量转移(FRET)的水平。组蛋白多 肽的巴豆酰化位点未巴豆酰化，而巴豆酰化结合域可与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白多肽特异性结合，不与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白多肽结合。FRET的水平表示样品中蛋白巴豆酰化的水平。反应后，FRET水平可能增加，也可能降低。检测样品中还可能需要添加某种试剂。这种试剂可调控蛋白巴豆酰化。蛋白巴豆酰化可能是组蛋白巴豆酰化。蛋白巴豆酰化含量确定方法中的样品可能是某种生物样品，如细胞，活检组织和临床流液。生物学样品可来自某个健康的、曾患或易患组蛋白巴豆酰化相关疾病的实验对象。组蛋白巴豆酰化相关疾病包括癌症，神经退行性疾病，衰老，代谢疾病和发育不全疾病。此方法还包括测试样品与对照样品中FRET水平间的比较。对照样品来自未曾或不易患组蛋白巴豆酰化相关疾病的实验对象。样品中的FRET水平可高于也可低于对照样品中的FRET水平。本发明提供了如何确定样品中蛋白去巴豆酰化含量的方法。方法包括(a)样品与融合指示蛋白反应；(b)比较与样品反应前后荧光供体和荧光受体间荧光共振能量转移(FRET)的水平。组蛋白多肽的巴豆酰化位点未巴豆酰化，而巴豆酰化结合域可与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白多肽特异性结合，不与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白多肽结合。FRET的水平表示样品中蛋白去巴豆酰化的水平。反应后，FRET侧水平可能增加，也可能降低。检测样品中还可能需要添加某种试剂。这种试剂可调控蛋白去巴豆酰化。蛋白去巴豆酰化可能是组蛋白去巴豆酰化。蛋白去巴豆酰化含量确定方法中的样品可能是某种生物样品，如细胞，活检组织和临床流液。生物学样品可来自某个健康的、曾患或易患组蛋白去巴豆酰化相关疾病的实验对象。组蛋白去巴豆酰化相关疾病包括癌症，神经退行性疾病，衰老，代谢疾病和发育不全疾病。检测方法还包括测试样品与对照样品中FRET水平间的比较。对照样品来自未曾或不容易患组蛋白去巴豆酰化相关疾病的实验对象。样品中的FRET水平可高于也可低于对照样品中的FRET水平。本发明提供了如何筛选调控蛋白巴豆酰化物质的方法。方法包括(a)候选物质与融合指示蛋白反应；(b)比较与样品反应前后荧光供体和荧光受体间荧光共振能量转移(FRET)的水平。组蛋白多肽的巴豆酰化位点未巴豆酰化，而巴豆酰化结合域可与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白多肽特异性结合，不与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白多肽结合。FRET的水平提高表示候选物质可促进蛋白巴豆酰化，降低则表示候选物质抑制蛋白巴豆酰化。候选物质可能是某种化合物或某种生物分子。蛋白巴豆酰化可能是组蛋白巴豆酰化。本发明提供了如何筛选调控蛋白去巴豆酰化物质的方法。方法包括(a)候选物质与融合指示蛋白反应；(b)比较与样品反应前后荧光供体和荧光受体间荧光共振能量转移(FRET)的水平。组蛋白多肽的巴豆酰化位点未巴豆酰化，而巴豆酰化结合域可与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白多肽特异性结合，不与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白多肽结合。FRET的水平提高表示候选物质可促进蛋白去巴豆酰化，降低则表示候选物质抑制蛋白去巴豆酰化。候选物质可能是某种化合物或某种生物分子。蛋白去巴豆酰化可能是组蛋白去巴豆酰化。本发明提供了如何治疗或防止实验对象的蛋白巴豆酰化相关疾病的方法。给实验对象服用一定有效剂量的含可调控蛋白巴豆酰化物质的成分。可调控蛋白巴豆酰化的物质可以用本发明提供的方法鉴定。蛋白`巴豆酰化可能是组蛋白巴豆酰化。本发明提供了如何治疗或防止实验对象的蛋白去巴豆酰化相关疾病的方法。给实验对象服用一定有效剂量的含可调控蛋白去巴豆酰化物质的成分。可调控蛋白去巴豆酰化的物质可以用本发明提供的方法鉴定。蛋白去巴豆酰化可能是组蛋白去巴豆酰化。
图1: (A)利用I，II，III和IV4种方法大量筛选HeLa细胞中的连接组蛋白和核心组蛋白中PTM位点的实验设计示意图。(B)方法I，II，III和IV4种方法筛选HeLa细胞中连接和核心组蛋白的多肽序列范围。(C)已鉴定PTM位点一览表。缩写:Kme，lysinemonomethylation,赖氨酸单甲基化；Kme2, lysine dimethylation,赖氨酸二甲基化；Kfo, lysine formylation,赖氨酸甲酰化；Kac, lysine acetylation,赖氨酸乙酰化；Rme, arginine monomethylation,精氨酸单甲基化；Yoh, tyrosine hydroxylation,赖氨酸轻基化；Kcr, lysine crotonylation,赖氨酸巴豆酰化。(D)除赖氨酸巴豆酰化(Kcr)夕卜，其他已鉴定组蛋白PTMs示意图。氨基酸的个数标记在序列下面。灰色的和黑色的方块分别表示N端和球形核心区域。(E)人HeLa细胞和小鼠MEF细胞中组蛋白赖氨酸巴豆酰化位点示意图。所有的赖氨酸巴豆酰化位点用下划线标示，并显示在序列的上方；已报道的赖氨酸乙酰化位点显示在序列的下方。图2:短链赖氨酸酰基化转化成巴豆酰化和乙酰化赖氨酸示意图。(A)以乙酰辅酶A为辅助因子,赖氨酸转移酶(KATs)将赖氨酸转化成乙酰化赖氨酸的酶反应过程示意图；以及参考赖氨酸乙酰化酶反应，用巴豆酰化辅酶A为辅助因子，将赖氨酸转化成巴豆酰化赖氨酸的假设过程示意图。(B)巴豆酰基团与乙酰基团的球棒模型。巴豆酰基团的4个碳原子和一个氧原子比较牢固并位于同一平面(左图)。巴豆酰基团中烯基的两个碳原子用实心球标示。相反的，乙酰基团中甲基为可旋转的四面体结构(右图)，与巴豆酰集团的结构相差很大。(C)乙烯基乙酰化赖氨酸(but-3-enoyllysine)，甲基丙烯酰化赖氨酸和环氧丙烷羧基赖氨酸的化学结构式。(D)巴豆辅酶A代谢途径。丁酰辅酶A或戊二酰辅酶A经过几步氧化成乙酰辅酶A，最终得到巴豆酰辅酶A。图3:鉴定和验证Kcr多肽PEPAKcrSAPAPK的质谱图，“Kcr ”代表巴豆酰化赖氨酸(A-C)0胞内组蛋白H2B胰酶多肽PEPAKSAPAPK的高分辨率质谱图，其第五位赖氨酸分子量偏移+68.0230 Da(A)。对应胰酶Kcr多肽的合成多肽的质谱图(B)，胞内胰酶多肽与对应的合成多肽混合物的质谱图(C)。胞内和合成多肽在HPLC/MS分析中共洗脱图(D)。图4:组蛋白中的赖氨酸巴豆酰化。(A)用抗泛Kcr抗体检测5种多肽库的Dot-spot结果。5种 多肽库点样量如图示。每种多肽含13个氨基酸CXXXXXKXXXXXX，这里的X代表除半胱氨酸以外的其他19种氨基酸，C为半胱氨基酸，第七位氨基酸固定为赖氨酸。5种多肽分别为未修饰的赖氨酸(K)，Kac，丙酰化赖氨酸(Kpr)，丁酰化赖氨酸(Kbu)和Kcr0 (B)使用抗泛Kcr抗体，应用免疫印迹(上)和考马斯亮蓝染色(下)两种方法检测BSA，乙烯基乙酰化赖氨酸、甲基丙烯酰化赖氨酸和巴豆酰化赖氨酸修饰BSA。(C)使用抗泛Kcr抗体，应用免疫印迹(上图)和考马斯亮蓝染色(下图)方法检测核心组蛋白H2A，H2B，H3，H4和连接组蛋白H1。用未修饰赖氨酸，甲基丙烯酰化赖氨酸和巴豆酰化赖氨酸竞争。(D)用抗泛Kcr抗体，应用免疫印迹(上)和考马斯亮蓝染色(下)方法检测核心组蛋白H2A，H2B, H3，H4和连接组蛋白Hl中巴豆酰化赖氨酸信号，分别用未修饰多肽，Kac, Kpr，Kbu和Kcr多肽竞争。图5图示D4-巴豆酸盐同位素胞内标记蛋白中的巴豆酰化(Kcr)赖氨酸。(A)巴豆酸盐诱导组蛋白中Kcr的动态变化。人前列腺癌细胞Dul45分别用0，50和100 mM巴豆酸盐诱导24小时后，提取组蛋白，用抗泛Kcr抗体，应用免疫印迹法检测。(B)从D4-巴豆酸盐标记样品中鉴别出的PEPAKD4-crSAPAPK的质谱图。D4，D3和D2巴豆酰基团的混合物用于鉴别D4-巴豆酰多肽。图6图示不同细胞中的组蛋白巴豆酰化。免疫印迹法检测//(HeLa), Mmusculus (MEF), C.elegans, D.melanogaster (S2)和 S.cereFisiae 细胞核心组蛋白中的Kcr信号,分别用赖氨酸(左)和巴豆酰化赖氨酸(右)竞争。图7用抗泛Kcr抗体，应用免疫印迹(左)和考马斯亮蓝染色(右)方法检测Hela细胞裂解液中巴豆酰化蛋白。图8用抗H3K56(上)和H3K23 (中)序列特异性抗体，应用免疫印迹和考马斯亮蓝染色(下)方法检测Hela细胞裂解液中的巴豆酰化组蛋白。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。本发明是基于在组蛋白中发现新的赖氨酸巴豆酰化位点的基础上。详细说来，即利用衍生自组蛋白或其片段、包含巴豆酰化位点的多肽，开发检测巴豆酰化蛋白的试剂，尤其是开发检测巴豆酰化位点特异性蛋白的试剂。本发明所指的“肽”是指两个以上氨基酸以肽键结合的线性氨基酸链。一个多肽可包括 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，40，50，100，200 个
氨基酸，甚至更多。多肽中的氨基酸可以修饰，删除，增加或替代。多肽可以用常规技术合成。如，多肽可通过人工合成或通过天然和重组蛋白酶切得到。本发明所指的“多肽”指含4个及以上氨基酸的多肽，20个左右氨基酸最好，不管是否含翻译后修饰。“蛋白质”是指包含一个及以上多肽的生物分子，不管是否含翻译后修饰。蛋白中的每一个多肽都是一个 亚单元。多肽和蛋白可能以天然或修饰的状态存在，并具有生物学功能和性质。这里的蛋白质指的是单独的多肽，“蛋白质”和“多肽”在这里可以互换。多肽或蛋白质片段指的是多肽或蛋白质的一部分序列，其氨基酸序列与多肽或蛋白质中的部分序列相同。具有同多肽或蛋白相似的生物学功能和性质更好。“来源于”在这里是指获得生物分子的原始来源，包括天然的、重组的、纯化的和未纯化的分子。某生物分子如多肽(多肽或蛋白)可能衍生自某原始分子，其序列与原始分子或原始分子的某个片段。举个实施例，衍生自原始多肽的多肽，其氨基酸序列与其原始的多肽序列一致，并至少有一个氨基酸可修饰、删除、插入和替代。一条衍生的多肽至少与其原始的多肽序列有 5%，10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%和 100%相同，至少50%比较好，80%更好，90%是最好的，不管是否有翻译后修饰。衍生的生物分子(例如多肽)与原始的生物分子具有相同或相似的生物功能或性质更好。这里指的“抗体”包括全序列抗体、抗原结合片段(或抗原结合部分)和单链抗体。全序列抗体通常是指具有两条重链和两条轻链，并含有抗原结合部分的糖基化蛋白。抗体的“抗原结合部分”是指一个或多个能与抗原特异性结合的抗体片段。“单链抗体”是指抗体重链和轻链的可变区通过一较短的连接多肽(如20-25氨基酸)连接而成的融合蛋白，并保留与抗原特异性结合的功能。本发明提供了分离多肽。分离多肽衍生自组蛋白或其片段，具有巴豆酰化位点。多肽的巴豆酰化位点巴豆酰化或未巴豆酰化。本发明提供的多肽至少包含3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150 或 200 个氨基酸。多肽可包含3-25个氨基酸，5-20个氨基酸更好，6-14个最好。这里说的“巴豆酰”是指巴豆酰基团替代某分子(如赖氨酸)中的一个氢原子。如，赖氨酸巴豆酰化后变成巴豆酰化赖氨酸。组蛋白可从如酵母(如S.cerevisiae), C.elegans, Drosophila (如D.melanogaster (S2)),小鼠(如M.musculus (MEF))和人等真核细胞中获得。从人,灵长类，小鼠，大鼠，马，牛，猪，绵羊，山羊，鸡，狗和猫等哺乳动物细胞中获得更好。最好是从人的细胞中获得。组蛋白可以是连接组蛋白和核心组蛋白。连接组蛋白可从Hl家族成员中选择,包括 HlF 亚家族(如 H1F0, H1FNT, H1F00,和 H1FX)和 HlHl 亚家族(如 HIST1H1A, HIST1H1B,HIST1H1 C，HISTmiD, HIST1H1E 和 HIST1H1 T)。核心组蛋白可以是 H2A, H2B, H3 和H4家族中的任一成员。H2A家族中的任一核心组蛋白可能是H2AF亚家族(如H2AFB1，H2AFB2, H2AFB3, H2AFJ, H2AFV, H2AFX, H2AFY, H2AFY2,和 H2AFZ)，H2A1 亚家族(如HIST1H2AA, HIST1H2AB, HIST1H2AC, HIST1H2AD, HIST1H2AE, HIST1H2AG, HIST1H2AI,HIST1H2AJ, HIST1H2AK, HIST1H2AL,及 HIST1H2AM)或 H2A2 家族(如 HIST2H2AA3和HIST2H2AC)中的一个。H2B家族中的任一核心组蛋白可能是H2BF亚家族(e.g.，H2BFM, H2BF0, H2BFS,和 H2BFWT)，H2B1 subfamily (e.g., HIST1H2BA, HIST1H2BB,HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BE, HIST1H2BF, HIST1H2BG, HIST1H2BH, HIST1H2BI,HIST1H2BJ, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST1H2BM, HIST1H2BN, 和 HIST1H2B0), 或H2B2亚家族(e.g.，HIST2H2BE).H3家族中的任一核心组蛋白可能是H3A1亚家族(e.g., HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G,HIST1H3H，HIST1H3I 和 HIST1H3J), H3A2 亚家族(如 HIST2H3C)，或 H3A2 亚家族(如HIST3H3).H4家族中的任一核心组蛋白可能是H41亚家族(如，HIST1H4A，HIST1H4B,HIST1H4C, HIST1H4D, HIST1H4E, HIST1H4F, HIST1H4G, HIST1H4H, HIST1H4I, HIST1H4J,HIST1H4K,和 HIST1H4L),或 H44 亚家族(如 HIST4H4)。不同种属组蛋白的氨基酸和基因序列目前都已知。人Hl.2，H2A, H2B, H3和H4组蛋白的氨基酸序列可分别在GenBank数据库中通过入口 P16403 (H12_HUMAN) SEQ IDNO:1 ， P04908 (H2A1B_HUMAN) SEQ ID NO: 2 ， P33778 (H2B1B_HUMAN) having SEQ IDNO: 3 , P84243 (H33_HUMAN) SEQ ID NO: 4 和 P62805 (H4_HUMAN) SEQ ID NO: 5 查询至IJ。老鼠组蛋白H1.2，H2A, H2B, H3和H4的全长氨基酸序列可分别在GenBank数据库中通过入口 Accession Nos.P15864 (H12_M0USE) SEQ ID NO: 6 ,P22752 (H2A1_M0USE)SEQ ID NO: 7 ， Q64475 (H2BIB_M0USE) SEQ ID NO: 8 ， P84244 (H33_M0USE)SEQ ID NO:9和P62806 (H4_M0USE) SEQ ID NO: 10查询到。以上各氨基酸序列具体见表I。表I
权利要求
1.一种从人、灵长类动物，小鼠、大鼠、马、母牛、猪、绵羊、山羊、鸡、狗和猫等哺乳动物细胞中提取的组蛋白或其片段中的具有6-14个氨基酸且含赖氨酸巴豆酰化修饰位点的分离多肽。
2.根据权利要求1所述的分离多肽，所提到的巴豆酰化位点是选自人组蛋白Hl.2 (序列编号为 SEQ ID N0:1)，修饰位点为 H1.2K33, H1.2K63, H1.2K84, H1.2K89, H1.2K96,H1.2K158, H1.2K167;人组蛋白H2A (序列编号为SEQ ID NO:2)，修饰位点为H2AK36,H2AK118,H2AK119, H2AK125 ；人组蛋白H2B (序列编号为SEQ ID N0:3)，修饰位点为H2BK5, H2BK11，H2BKI2, H2BKI5, H2BKI6, H2BK20, H2BK23, H2BK34 ;人组蛋白 H3 (序列编号为 SEQ ID N0:4)，修饰位点为 H3K4, H3K9, H3K18, H3K23, H3K27, H3K56 ；人组蛋白H4 (序列编号为SEQ ID勵:5)，修饰位点为！141(5，H4K8, H4K12和H4K16。
3.根权利要求1所述的分离多肽，所提到的巴豆酰化位点是选自小鼠组蛋白Hl.2(序列编号为 SEQ ID N0:6)，修饰位点为的 H1.2K33, H1.2K63, H1.2K84, H1.2K158,H1.2K167;小鼠组蛋白H2A (序列编号为SEQ ID N0:7)，修饰位点为H2AK36, H2AK118 ;小鼠组蛋白H2B (序列编号为SEQ ID NO:8)，修饰位点为H2BK5, H2BK11，H2BKI2, H2BKI5,H2BKI6, H2BK20, H2BK23, H2BK34 ;小鼠组蛋白 H3 (序列编号为 SEQ ID N0:9)，修饰位点为 H3K4, H3K9, H3K18, H3K23, H3K27, H3K56 ;小鼠组蛋白 H3 (序列编号为 SEQ IDNO: 10)，修饰位点为 H4K5, H4K8 和 H4K16。
4.一种制备可与组蛋白或组蛋白片段上的巴豆酰化位点特异性结合的抗体方法，该方法包括:(a)用多肽免疫原免疫宿主动物；免疫原多肽衍生自组蛋白或其片段，含巴豆酰化位点(b)收集宿主动物血清；(C)从血清中将抗体纯化出来；(d)利用宿主动物脾脏制备的单克隆抗体或通过筛选噬菌体库，合成多肽库和酵母库制备。
5.根据权利要求1或2或3中所述的任何一种分离多肽，采用权利要求4所制备的组蛋白赖氨酸巴豆酰化位点特异性多克隆或单克隆抗体可与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白或其片段特异性结合，而与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白或其片段不能结合；或可与巴豆酰化位点未发生巴豆酰化的组蛋白或其片段特异性结合，而与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白或其片段不能结合。
6.一种根据权利要求5所述的分离多肽所制备的抗体，这里的巴豆酰化位点是选自人 HL 2K33, H1.2K63, H1.2K84, H1.2K89, H1.2K96, H1.2K158, H1.2K167, H2AK36,H2AK118,H2AK119, H2AK125, H2BK5, H2BK11 ， H2BKI2, H2BKI5, H2BKI6, H2BK20,H2BK23, H2BK34, H3K4, H3K9, H3K18, H3K23, H3K27, H3K56, H4K5, H4K8, H4K12 和H4K16 。
7.一种根据权利要求5所述的分离多肽所制备的抗体，这里的巴豆酰化位点是选自小鼠Hl.2Κ33，Η1.2K63, H1.2Κ84, H1.2Κ158, H1.2Κ167, Η2ΑΚ36, Η2ΑΚ118, Η2ΒΚ5, Η2ΒΚ11，Η2ΒΚ12,Η2ΒΚ15, Η2ΒΚ16, Η2ΒΚ20, Η2ΒΚ23, Η2ΒΚ34, Η3Κ4, Η3Κ9, Η3Κ18, Η3Κ23,Η3Κ27, Η3Κ56, Η4Κ5, Η4Κ8 和 Η4Κ16 位点。
8.一种样品中蛋白巴豆酰化(包括组蛋白巴豆酰化)检测方法包括: Ca)样品与抗体反应形成结合复合物，抗体可与巴豆酰化的组蛋白或其片段特异性结合，而与未巴豆酰化 的组蛋白或其片段不能结合； (b )检测结合复合物，若存在结合复合物表示样品中含有蛋白巴豆酰化(包括组蛋白巴豆酰化)。
9.一种包含有权利要求6或7所述抗体的样品蛋白巴豆酰化(包括组蛋白巴豆酰化)检测试剂盒，所述的抗体是指可与巴豆酰化的组蛋白或其片段特异性结合，而与未巴豆酰化的组蛋白或其片段不能结合。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，所述的抗体是指权利要求6或7中任一分离多肽所制备的多克隆或单克隆抗体。
11.根据权利要求9所述的试剂盒，其中包括一种融合指示蛋白，融合指示蛋白的核心一侧为荧光供体部分，一侧为荧光受体部分；这里所说的核心由含巴豆酰化位点的组蛋白多肽和巴豆酰化结合域组成；组蛋白多肽巴豆酰化位点未巴豆酰化，而巴豆酰化结合域可与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白多肽特异性结合，不与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白多肽结合；或组蛋白多肽巴豆酰化位点巴豆酰化，巴豆酰化结合域可与巴豆酰化位点未巴豆酰化的组蛋白多肽结合，不与巴豆酰化位点巴豆酰化的组蛋白多肽结合。
12.根据权利要求11所述的融合指示蛋白，巴豆酰化位点可位于组蛋白的N端，C端和核心区域；组蛋白选自人或小鼠Hl.2，H2A, H2B, H3和H4组蛋白；融合指示蛋白包括一个或多个巴豆酰化结合域，巴豆酰化结合域衍生自权利要求6或7所指的任一抗体，组蛋白多肽与巴豆酰化结合域通过连接分子连接在一起。
13.根据权利要求11所述的融合指示蛋白，这里的荧光供体选自青荧光蛋白(CFP)，增强型青荧光蛋白(ECFP)或A206K突变体；或选自黄荧光蛋白(YFP)，增强型黄荧光蛋白(EYFP), Citrine, Venus和A206K突变体；融合指示蛋白还包括选自受体配体，核定位序列(NLS)，核输出信号(NES)，质膜导向信号，组蛋白结合蛋白或核蛋白的导向多肽。
14.一种检测样品中蛋白质巴豆酰化修饰水平(包括组蛋白巴豆酰化修饰水平)的方法，该方法包括:(a)采用权利要求11所述的试剂盒中所指的融合指示蛋白与待检测样品中蛋白质相互接触；(b)比较接触前后供体荧光部分与荧光受体部分的荧光共振能量转移(FRET )的变化水平，变 化水平反映了样品中蛋白质巴豆酰化修饰水平。
15.根据权利要求14所述的一种检测样品中蛋白质巴豆酰化修饰水平(包括组蛋白巴豆酰化修饰水平)的方法，所述的检测样品包括细胞，活检组织和临床体液，取自健康的实验对象、或取自曾患或易患组蛋白巴豆酰化相关疾病的实验对象，包括癌症，神经退行性疾病，衰老，代谢疾病和发育不全疾病。
16.一种筛选调控蛋白质巴豆酰化修饰(包括组蛋白巴豆酰化修饰)的试剂的方法，该方法包括: Ca)候选试剂与权利要求12中所述的融合指示蛋白反应； (b)比较与样品反应前后荧光供体和荧光受体间荧光共振能量转移(FRET)的水平；反应后，FRET的水平提高表示候选试剂可促进蛋白巴豆酰化，降低则表示候选试剂抑制蛋白巴豆酰化。
17.一种筛选调控蛋白质去巴豆酰化修饰的试剂(包括组蛋白去巴豆酰化修饰)的方法，该方法包括: Ca)候选物质与权利要求12中所说的融合指示蛋白反应； (b)比较与样品反应前后荧光供体和荧光受体间荧光共振能量转移(FRET)的水平；反应后，FRET的水平提高表示候选物质可促进蛋白去巴豆酰化，降低则表示候选物质抑制蛋白去巴豆酰化。
18.一种治疗或防止实验对象患蛋白质巴豆酰化修饰(包括组蛋白巴豆酰化修饰)相关疾病的方法包括给实验对象服用一定有效剂量的、含可调控蛋白巴豆酰化修饰的试剂的成分，该试剂采用权利要求16中的方法鉴定。
19.一种治疗或防止实验对象的蛋白质去巴豆酰化(包括组蛋白去巴豆酰化修饰)相关疾病的方法包括给实验对象服用一定有效剂量的含可调控蛋白质去巴豆酰化修饰的试剂的成分，该试剂 可用权利要求17中的方法鉴定。
全文摘要
本发明提供一种可与含巴豆酰化位点的组蛋白或组蛋白片段特异性结合的抗体；利用只当含巴豆酰化位点的组蛋白或其片段巴豆酰化时(巴豆酰化位点巴豆酰化时更好)，可与之特异性结合的抗体来检测样品中蛋白巴豆酰化的方法。同时提供了一种融合指示蛋白。它的核心，一侧为荧光供体部分，一侧为荧光受体部分，由组蛋白多肽和巴豆酰化结合域组成。巴豆酰化结合域只有当组蛋白多肽巴豆酰化(巴豆酰化位点巴豆酰化时更好)时才与之特异性结合。利用融合指示蛋白来确定样品中蛋白巴豆酰化水平的方法。
文档编号C07K7/06GK103183725SQ20121021506
公开日2013年7月3日 申请日期2012年6月25日 优先权日2011年12月27日
发明者程仲毅, 赵英明 申请人:杭州景杰生物科技有限公司