乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质的分离的制作方法
【专利摘要】本发明涉及将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的方法。具体来说，本发明涉及使用多模式色谱将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的方法。在先前技术中，使用多模式色谱分离抗体。本发明发现多模式色谱可用于乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质的所述分离。
【专利说明】乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质的分离
【技术领域】
[0001]本发明涉及将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的工艺。具体来说，本发明涉及使用多模式色谱将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的工艺。
【背景技术】
[0002]蛋白质的修饰将可能分子结构的范围延伸超出由20个编码氨基酸施加的限值，且(如果可逆)产生控制和信号传导的方式。乙酰化作为蛋白质的共转译和转译后修饰发生。至少对于真核蛋白质来说，乙酰化是已报告的200种以上类型中的最常见共价修饰。蛋白质的乙酰化是由多种乙酰基转移酶催化，所述乙酰基转移酶在不同位置处将乙酰基从乙酰基-辅酶A转移到氨基末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。氨基末端乙酰化在乙酰化真核蛋白质的主体上以共转译方式发生，且在原核核糖体蛋白质上和经处理真核调节肽上以转译后方式发生。此外，ε -赖氨酸乙酰化在组蛋白、高迁移率族(HMG)蛋白质、转录因子、核受体和α-微管蛋白上以转译后方式发生。乙酰化影响许多蛋白质功能(包括酶活性、稳定性、DNA结合、蛋白质-蛋白质相互作用和肽-受体识别)，且在多种不同蛋白质上发生。因此，业内标的为纯化乙酰化蛋白质。
[0003]另一方面，产生重组蛋白的方法已为业内所熟知。报告已显示源自埃希氏大肠杆菌(E.coli)的重组蛋白因转译后修饰给予不同形式的混合物。举例来说，本田进(SusumuHonda)等人报告具有Cys_Tyr_Cys的源自埃希氏大肠杆菌的人类干扰素-Y在N末端处经部分乙酰化且表明rIFN-7的N末端部分是异源的(本田进等人，生物化学与生物物理文献(Archives ofBiochemistry and Biophysics),第 269 卷，第 2 期，3 月，第 612-622 页，1989) ο伊洛蒂.沙尔博(Elodie Charbaut)等人通过基质辅助的激光解吸/离子化飞行时间质谱和nanoES1-Q-TOF串列质谱表征5种在埃希氏大肠杆菌中表达的哺乳动物司他斯敏(stathmin)样亚结构域,且证实异位重组蛋白可在埃希氏大肠杆菌中广泛地NK-乙酰化，且管控NK-乙酰化的规则较复杂且涉及如真核生物中的N末端区域。(伊洛蒂.沙尔博等人FEBS快报(FEBS Letters) 529 (2002) 341-345)。重组蛋白的同型异构体包括二聚体、含N-甲硫氨酸形式(美国专利第5，196，323号)、还原形式、二硫桥同型异构体(美国专利第4，765，903号)和电荷同型异构体(克莱因ML (Klein ML)等人，生物化学与生物物理文献(Arch.Biochem.Biophys.), 276 (2): 531-7,1990)。因此，正确修饰的同型异构体的分离并不简单，这是因为这些组成和构象变体的性质与天然分子的性质极为类似。
[0004]安德雷亚斯0.黑尔比希(Andreas 0.Helbig)等人报告通过使用基于质谱的专用蛋白质组学技术可以半综合方式阐明N末端处理方法。所报告多蛋白酶方法可鉴别HEK293细胞中的1391乙酰化人类蛋白质N末端且揭示倒数第二个位置对甲硫氨酸氨基肽酶的裂解效率的作用从埃希氏大肠杆菌到人类基本上保守(安德雷亚斯0.黑尔比希等人，分子与细胞蛋白质组学(Molecular&Cellular Proteomics)9: 928-939,2010)。此外，已使用且组合多种不同色谱方法以分离乙酰化蛋白质。最常见蛋白质分离方法是根据待纯化蛋白质与污染物之间的大小、电荷和溶解性差异来预测。基于这些参数的方案包括亲和色谱、离子交换色谱、尺寸排除色谱和疏水性相互作用色谱。爱沃特杨-丝倪克萨(Evert-JanSneekesa)等人揭示，使用毛细管聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)单片柱差异性分离乙酰化完整頂9蛋白质同型异构体，且表明乙酰化的数量和于蛋白质上的乙酰化位置二者都对保留具有显著效应(爱沃特杨-丝悅克萨等人，色谱期刊(Journal of Chromatography) A,1194(2008) 199-204)。US6，620，918提供使用离子交换色谱将多肽单体与二聚体和/或其它多聚体分离的工艺。US6，005，075证实纯化干扰素- a -2a的工艺；简单说来，已证实于
0.6M胍溶液中再折叠且利用空气氧化后的色谱方案。
[0005]然而，尚未达成乙酰化蛋白质的分离。因此，业内仍需要研发以高回收率分离乙酰化蛋白质的工艺。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1显不IFN- a -2a的多模式色谱图。
[0007]图2显示用银染色IFN-a-2a的14% SDS-PAGE。所述分析是基于EP6.0专论-干扰素a -2a浓溶液执行。M:标记；泳道1:罗飞龙(Rofeixm)，I μ g ;泳道2:内部参照IFN- a -2a，0.05 μ g ;泳道 3:内部参照 IFN- a -2a, 0.25 μ g ;泳道 4:内部参照 IFN- a -2a,
1.25 μ g ;泳道 5:内部参照 IFN- a -2a, 6.25 μ g ;泳道6:内部参照 IFN- a -2a, 31.25 μ g ;泳道7:IFN- a -2a的纯化主体，5 μ g ;泳道8:1FN_ a -2a的纯化主体，25 μ g。
[0008]图3显示IFN- a -2b的多模式色谱图。
[0009]图4显示用银染色IFN- a -2b的14% SDS-PAGE。所述分析是基于EP6.0专论-干扰素ct -2b浓溶液执行。M:标记；泳道1:内部参照IFN- a -2b, 0.05 μ g ;泳道2:内部参照IFN-a -2b, 0.25 μ g ;泳道 3:内部参照 IFN-a-2b，1.25 μ g ;泳道 4:内部参照 IFN-a-2b，
6.25 μ g ;泳道5:内部参照IFN- a -2b, 31.25 μ g ;泳道6:IFN- a -2b的纯化主体，5 μ g ;泳道7:IFN- a -2b的纯化主体，25 μ g。
[0010]图5显示通过RP-HPLC获得的纯度和有关蛋白质。将试样用水稀释到Img / mL且将50 μ g注射到C18柱上。色谱条件是基于EP6.0专论-干扰素α -2浓溶液实施。
【具体实施方式】
[0011]本发明成功研发采用多模式色谱将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的简单且节省时间的工艺；举例来说，分离所需乙酰化蛋白质或去除微生物重组蛋白产生期间生成的乙酰化变体。
[0012]本文所提及的所有出版物和专利都以引用方式并入本文中，以达成阐述并揭示(例如)可结合本文所述本发明使用的出版物中所述的构筑体和方法的目的。本文所论述公开案仅因为其揭示内容先于本申请案的 申请日期:而提供。绝不能由于揭示内容为先前发明或任何其它原因而理解为承认本发明无权先于所述揭示内容。
[0013]除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有所属领域技术人员通常所了解的含义。所述术语的含义和范畴应明确；然而，本文所提供的定义即使有任何潜在歧义也优先于任何字典或非固有定义。
[0014]除非上下文另外明确指明，否则本文和在所附权利要求书中所使用单数形式“一(a、an) ”和“所述(the) ”都包括复数个指示物。[0015]本文所用术语“重组蛋白”定义如下蛋白质:希望以相对纯形式回收者且包括具有天然蛋白质和其类似物的氨基酸序列的蛋白质和具有经取代、删除、置换或以其它方式经修饰的序列的突变蛋白。
[0016]术语“重组表达载体”是指用于表达来自DNA(RNA)序列的蛋白质的质粒或噬菌体或病毒或载体。表达媒介可包含含有以下组装的转录单元:(I)在基因表达中具有调节作用的一种或一种以上遗传元件，例如启动子或增强子，(2)转录成mRNA且转译成蛋白质的结构或编码序列，和(3)适当转录起始和终止序列。
[0017]术语“转译后修饰”意指蛋白质在其转译后的化学修饰。
[0018]术语“共转译”意指通过重组DNA上生成的杂合mRNA分子的转译合成由共价连接到由所用有机体分泌的正常蛋白质的所需蛋白质产物组成的杂合分子。
[0019]术语“转化”意指将DNA引入有机体中以便能作为染色体外成份或通过染色体整合来复制所述DNA。术语“转染”是指不管实际上是否表达任何编码序列都由适宜宿主细胞占用表达载体。
[0020]本文所用术语“生物活性(biologicallyactivity 和 biological activities)”是指活系统中(例如)与天然或非天然存在的分子类似或相同的结构、调节、生物化学或其它生物功能。
[0021]术语“多模式色谱载体”是指能够提供至少两个与待结合化合物相互作用的不同但合作位点者。举例来说，这些位点中的一者在配体与目标物质之间产生有吸引力类型的电荷-电荷相互作用。另一位点可产生电子受体-供体相互作用和/或疏水性和/或亲水性相互作用。电子供体-受体相互作用包括诸如氢键结、.p1.-.P1.、阳离子-.P1.、电荷转移、双极-双极、诱发的双极等相互作用。“多模式色谱载体”也称作“混合模型”分离基质。US7，714，112涉及从液体试样中的另一或其它化合物分离抗体的方法，其中使包含所述试样的移动相与多模式分离基质接触以吸附非所需化合物，同时抗体保持游离于液体中，其中多模式分离基质包含能够与靶化合物的带负电位点相互作用的第一基团和能够与所述靶化合物进行至少一种除电荷-电荷相互作用以外的相互作用的第二基团。此先前技术参考文献并入本文中用于参照。
[0022]术语“色谱”涵盖一族紧密相关的分离方法。区分色谱与大多数物理和化学分离方法的特征在 于使两个相互不混溶相接触，其中一个相静止且另一相移动。
[0023]术语“功能性”在本文中用于在能够与靶分子或靶化合物相互作用方面起作用的基团或分子。
[0024]术语“洗脱剂”以其常规含义用于此领域中，即适于从分离基质释放一种或一种以上化合物的PH值和/或离子强度的缓冲液。
[0025]术语“干扰素”是指在暴露于各种环境刺激(包括病毒感染或暴露于分裂素)时由多种真核细胞产生的一族分泌蛋白质。除具有抗病毒性质外，已显示干扰素也影响多种细胞功能。所有干扰素单元在本文中都参照WHO国际标准94 / 786 (rHuIFN- α共有)和95 / 650(rHuIFN-a2a)表示。根据本发明，干扰素包括共有干扰素和干扰素样产物。
[0026]在一个方面中，本发明提供将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的工艺，其包含将包含乙酰化和非乙酰化蛋白质的不纯制剂施加到多模式色谱载体和利用PH值变化实施洗脱。[0027]根据本发明，不纯制剂是任何包括乙酰化蛋白质和非乙酰化蛋白质者。优选地，于介于6与7之间的pH值下施加不纯制剂。优选地，不纯制剂是源自细胞。更优选地，不纯制剂是源自原核细胞。
[0028]根据本发明，多模式色谱载体用于将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离。多模式色谱载体包含疏水性基团和阴离子交换基团。
[0029]多模式色谱载体优选地提供于色谱柱中。优选地，多模式色谱载体为Capto?adhere ο多模式色谱揭示于以下文献中:克杰尔.埃里克松(Kiell Eriksson)等人，国际生物工艺(BioProcess International) 7 (2) (2009 年 2 月);陈杰(Jie Chen)等人，2010，色谱期刊A，1217，第216-224页；和美国专利第7，714，112号，其全文都并入本文中作为参考文献。在这些先前技术参考文献中，使用多模式色谱分离单株抗体。这些参考文献都不使用多模式色谱分离乙酰化蛋白质。
[0030]在一实施例中，多模式色谱载体用于液相色谱中，即通过使流动相通过包含多模式色谱载体的色谱柱。载体可呈多孔或非多孔粒子形式，例如基本上球形粒子、单块、过滤器、膜、表面、毛细管或任一其它常用格式。在一替代实施例中，多模式色谱载体以粒子(例如基本上球形粒子，包含高密度填充剂)形式用于膨胀床色谱中，即通过将移动相添加到分离基质的膨胀床。在另一替代实施例中，多模式色谱载体用于分批过程中，其中将分离基质添加到包含液体试样的容器中。
[0031]根据本发明，多模式色谱载体的疏水性基团包含芳香族基团、杂芳香族或非芳香族疏水性基团(例如烷基)。优选地，疏水性基团为己基、丁基、苯基或酿基团。
[0032]根据本发明，多模式色谱载体的阴离子交换基团可为强阴离子交换剂。在此上下文中，术语“强”阴离子交换剂应理解为在宽PH值范围内保持带电的基团。在一有利实施例中，强阴离子交换基团为季胺。在一替代实施例中，多模式色谱载体的阴离子交换基团可为弱离子交换剂。在此上下文中，术语“弱”阴离子交换剂应理解为意指在特定PH值下带电但可因pH值改变损失电荷的基团。
[0033]在一个实施例中，对于分离乙酰化蛋白质，使试样与多模式色谱载体接触以吸附乙酰化蛋白质且随后利用PH值变化实施洗脱，以便洗脱非乙酰化蛋白质，同时乙酰化蛋白质留在载体上。在一个实施例中，在第一步骤中，在使乙酰化蛋白质吸附到载体的条件下使包含乙酰化蛋白质的试样通过多模式色谱载体。应小心不超过载体的容量，即流速应足够缓慢以容许满意吸附。在后续步骤中，在PH值梯度和洗脱非乙酰化蛋白质的其它条件下使用多模式色谱载体实施洗脱。根据本发明，用于洗脱的PH值变化是逐步的或呈梯度的。优选地，在7与3之间实施pH值变化。更优选地，在6.0到7.0的pH值范围内装载蛋白质混合物且在5.5到3.0之间实施pH值变化。在一优选实施例中，洗脱溶液包括乙酸盐和铵。根据本发明，洗脱非乙酰化蛋白质的其它条件通常是由盐浓度(即离子强度、疏水性等)提供。色谱的一般原则已为此领域中所熟知，且所属领域技术人员可容易地采用使用本发明工艺必需的参数。
[0034]在一优选实施例中，如果需要，则可在本发明工艺的任何所述步骤之前或之间施加一个或一个以上洗涤步骤。
[0035]根据本发明，所述工艺可用于分离转译后乙酰化蛋白质和重组蛋白产生的共转译期间在表达系统中生成的乙酰化杂质。优选地，本发明工艺可用于纯化胰岛素、生长激素、介白素、干扰素或生长调节素。
[0036]在一个实施例中，本发明工艺可用于纯化重组蛋白以从其去除乙酰化形式。因此，本发明提供纯化从表达系统获得的重组蛋白产物的工艺，其包含i)将从表达系统获得的再折叠重组蛋白混合物施加到多模式色谱载体，和ii)利用PH值变化实施洗脱以获得基本上不含乙酰化蛋白质的重组蛋白产物。优选地，表达系统为微生物、酵母或哺乳动物表达系统。
[0037]在又一实施例中，本发明工艺用于纯化重组干扰素。因此，本发明提供纯化从表达系统产生的重组干扰素以获得其非乙酰化形式的工艺，其包含以下步骤:
[0038](a)使从表达系统产生的溶解且再折叠干扰素经受疏水性相互作用色谱，其中所述干扰素包含乙酰化形式和非乙酰化形式；和
[0039](b)使来自步骤(a)的所述干扰素经受本文提及的将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的过程，以便可获得所述非乙酰化形式的干扰素。
[0040]根据本发明，在表达系统中，待纯化的干扰素可从宿主细胞(例如埃希氏大肠杆菌或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))获得,经含有编码乙酰化蛋白质的基因的表达载体转化，如先前技术中所揭示。更优选地，干扰素为干扰素-α。更优选地，干扰素为IFN_a2a和D IFN_a2b。借助离心或过滤从培养基回收重组宿主细胞，且随后通过施加常规技术(例如渗透冲击、超声波处理、研磨或化学试剂)使其破碎以分离不溶体。优选地通过缓冲液(优选地Tris缓冲液)洗涤不溶体。在一个实施例中，用Tris /胍盐酸盐(GdHCl)缓冲液洗涤包涵体。
[0041]根据本发明的工艺，在步骤(a)中，使从表达系统产生的溶解且再折叠干扰素经受疏水性相互作用色谱(HIC)。HIC是用于分析和制备型分离生物分子的有力技术。所述技术利用位于蛋白质表面上的疏水性区域。HIC适于困难的分离，尤其杂质具有类似等电点或分子量的分离。适于所述目的的色谱柱可具有不同截面和长度且HIC树脂选自那些有市售者。蛋白质与吸附剂材料之间的接触阶段期间的PH值为所供应溶液的pH值。根据本发明的工艺，适于所述目的的HIC树脂材料选自那些可疏水性结合干扰素且在不同商标下有市售者。优选地，HIC柱为拖皮尔(Toyopearl)系列(托斯奇生物科学(Tosch Biosience)LLC)。更优选地，HIC柱为拖皮尔布提(Toyopearl Buty)_650M。
[0042]根据本发明的工艺，在步骤(b)中，使步骤(a)的干扰素进一步经受采用多模式色谱的本发明工艺。多模式色谱优选地是基于允许使用高流体速度的刚性琼脂糖基质。高度交联琼脂糖基质载体使介质具有高度化学和物理稳定性。多模式色谱载体包含能够与靶化合物的带负电位点相互作用的第一基团和能够与所述靶化合物进行至少一种除电荷-电荷相互作用以外的相互作用的第二基团。多模式色谱载体提供于色谱柱中。优选地，多模式色谱使用Capto? adhere ο
[0043]根据本发明，HIC和多模式色谱能够分离序列变体。HIC的第一柱步骤旨在去除共价聚集物且第二多模式色谱柱打算分离乙酰化变体。
[0044] 根据本发明，通过溶解表达系统中从重组蛋白产生获得的重组干扰素的不溶体且随后在氧化试剂存在下再折叠所得干扰素获得步骤(a)中的溶解且再折叠干扰素。根据本发明，本发明中可使用任何能够溶解不溶体的适宜试剂。在本发明的一个实施例中，可使用离液剂或洗涤剂溶解包涵体。优选地，离液剂为脲、胍盐酸盐且洗涤剂为SDS、N-乙酰基三甲基氯化铵或N-月桂酰基肌氨酸钠。更优选地，增溶剂为胍盐酸盐。分离和溶解不溶体的技术已为业内所知，例如那些揭示于生物科学与生物工程期刊(Journal of Bioscienceand Bioengineering)(第99卷,第4期,303-310, 2005)中者,其全文并入本文中用于参照。在一个实施例中，将包涵体以l-5mg / mL溶于Tris / GdHCl /吐温(Tween)中以获得干扰素。
[0045]根据本发明，在氧化试剂存在下执行溶解干扰素的再折叠。氧化试剂可选择性氧化半胱氨酸。优选地，氧化试剂为碘或亚碘酰苯甲酸盐；优选地，氧化试剂为邻-亚碘酰苯甲酸盐。氧化试剂用于以选择性和化学计量方式氧化半胱氨酸残基。就此来说，术语“选择性”指示氧化试剂(I)将半胱氨酸氧化到二硫键程度，而不或不显著氧化到更高程度，和
(2)优先氧化定位接近经还原蛋白质的活性半胱氨酸。氧化试剂对合成蛋白质的摩尔比可根据所用氧化试剂广泛变化。摩尔比可为至少化学计量(I: I或更大)且通常将在1:1到100: I范围内。在邻-亚碘酰苯甲酸盐的情形下，摩尔比通常将在约1:1到约5: I范围内。在所有情况下，氧化试剂在反应的末端部分中过量以确保经还原蛋白质完全氧化。这些条件可通过在整个持续时间内运行与过量氧化试剂反应或在大部分反应时段内运行与适当等摩尔份数的反应物反应和在接近反应时段结束时添加过量氧化剂来达成。硫醇基团通过(例如)使用邻-亚碘酰苯甲酸盐的氧化可参照全文并入本文中的美国专利第4，530，787 号。
[0046]本发明的主要目的是去除主体杂质同时维持高回收率。本发明证实在业内的色谱中采用两柱步骤代替四柱步骤的工艺。本文获得的产物具有高纯度和产率；例如，可达成高达30-40%的总回收率和高于95%纯度的产率。
[0047]SM
[0048]实例I使用本发明工艺的IFN- a -2a的纯化
[0049]基因克隆、质粒构筑体和细胞培养
[0050]根据重组DNA技术执行IFN-α基因克隆、质粒构筑体和密码子优化。重组IFN- a -2a在具有含IFN- a -2a的基因的质粒PET30a的细菌BL21 (DE3)细胞中表达为不溶性包涵体。利用设定于30%下的溶解氧含量在5-L分批进料发酵中实施发酵。于ImM IPTG下诱发3小时后，通过离心从培养液收获细胞。将细胞团用20mM Tris pH7.4 / 0.5mM EDTA缓冲液洗涤且随后重新悬浮于相同缓冲液溶液中用于通过超声波处理使细胞破碎。通过离心收集IB。
[0051]包涵体溶解
[0052]用适当体 积的50mM Tris pH7.4/7.0GdHCl / 2%吐温80溶解IB以获得4mg /mL的IFN-a -2a。通过于室温下轻柔搅拌Ihr达成完全溶解。将蛋白质溶液用50mM TrispH7.4缓冲液稀释11倍。通过冷离心30min去除不溶性碎片。
[0053]二硫化物氧化
[0054]在二硫化物氧化之前制备存于50mM Tris pH7.4缓冲液中的ImM碘苯甲酸酯。每小时5次将10 μ M碘苯甲酸酯引入蛋白质溶液中(总共50 μ Μ)。于室温下在轻柔搅拌下培育蛋白质溶液。
[0055]疏水性相互作用色谱
[0056]将ImM EDTA和IOmM甲硫氨酸添加到蛋白质溶液中，之后添加固体硫酸铵以获得IM0用乙酸将pH值调节到6.5。在通过离心和过滤去除颗粒后，如下所述来实施色谱纯化:
[0057]拖皮尔布提-650M，5X 5cm，流速:25ml / min。
[0058]缓冲液A:20mM NaPi pH6.5 / 1.0M AmSO4 / ImM EDTA / IOmM 甲硫氨酸；
[0059]缓冲液B:20mM NaPi ρΗ6.5 / ImM EDTA / IOmM 甲硫氨酸。
[0060]将蛋白质溶液装载到经缓冲液A平衡的柱上。在装载后，将柱用至少5CV的100%缓冲液A洗涤直到0D280达到接近零为止。将蛋白质用一系列步骤洗脱:经2CV20% B，经2CV40% B，经 2CV60% B，经 2CV80% B 和经 2CV100% B。将柱用水、0.5N NaOH 和 0.1N HCl清洗，之后用缓冲液A再生。收集ISmL的每一流份并取样以用于通过RP-HPLC进行分析。汇集基本上不含聚集IFN-a -2a的流份。
[0061]多模式色谱
[0062]弓丨入5mM乙酸铵pH6.5缓冲液以稀释硫酸铵直到最终导电率小于15mS / cm为止。
[0063]如下实施来实施色谱纯化:
[0064]Capto Adhere2.6X6cm,流速:6.7ml / min。
[0065]缓冲液C:25mM乙酸铵缓冲液，通过添加50%乙酸使pH值为6.5 ;
[0066]缓冲液D:5mM乙酸。
[0067]将稀释蛋白质溶液装载到先前经缓冲液C平衡的柱上。在完成时，将柱用3CV的60% D洗涤。将靶蛋白质用80% D洗脱。IFN-a-2a的色谱图示于图1中。将柱先后用100% C和2M NaClUN Na0H、2M NaCl和0.1M乙酸清洗。收集17_mL的每一流份并取样以用于通过RP-HPLC进行分析。汇集基本上不含乙酰化同型异构体的流份。通过比较各纯度评价所得产物。SDS-PAGE分析的结果如图2中所示。
[0068]无菌过滤
[0069]汇集来自满足纯度规范的Capto Adhere柱的流份并使用3-KD离心过滤器浓缩到3mg / mL以上。通过0.2 μ m膜进一步过滤纯化主体。IFN-a-2a的每一步骤产率示于表I中。乙酰化IFN于包涵体中的量为约20-30%。在执行上文提及的色谱步骤后，未检测到乙酰化IFN。
[0070]表1.试样名称:IFN_ a -2a
【权利要求】
1.一种将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的方法，其包含将包含乙酰化和非乙酰化蛋白质的不纯制剂施加到多模式色谱载体和利用PH值变化实施洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多模式色谱载体包含疏水性基团和阴离子交换基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述多模式色谱载体的所述疏水性基团包含芳香族基团、杂芳香族或非芳香族疏水性基团(例如烷基)。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述疏水性基团为己基、丁基、苯基或醚基团。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述多模式色谱载体的所述阴离子交换基团可为强阴离子交换剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多模式色谱载体为Capto?adhere。
7.根据权利要求1所述的方法，其中于介于6与7之间的pH值下施加所述不纯制剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述不纯制剂是源自细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述不纯制剂是源自原核细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其中用于洗脱的所述pH值变化是逐步的或呈梯度的。
11.根据权利要求1所述的方法，其中于介于7与3之间实施所述pH值变化。
12.根据权利要求1所述的方法，其中于介于5.5到3.0之间实施洗脱的所述pH值变化。
13.根据权利要求1所述的方法，其中利用包含乙酸盐和铵的溶液实施所述洗脱。
14.根据权利要求1所述的方法，其可用于纯化胰岛素、生长激素、介白素、干扰素或生长调节素。
15.一种纯化从表达系统产生的重组干扰素以获得其非乙酰化形式的方法，其包含以下步骤: (a)使从表达系统产生的溶解且再折叠干扰素经受疏水性相互作用色谱，其中所述干扰素包含乙酰化形式和非乙酰化形式；和 (b)使来自步骤(a)的所述干扰素经受本文提及的将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的过程，以便可获得所述非乙酰化形式的干扰素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述干扰素为干扰素-α。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述干扰素为IFN-a2a和IFN-a 2b。
18.根据权利要求15所述的方法，其中通过溶解表达系统中从重组蛋白产生获得的所述重组干扰素的不溶体且随后在氧化试剂存在下再折叠所述所得干扰素来获得步骤(a)中的所述溶解且再折叠干扰素。
19.根据权利要求18所述的方法，其中利用诸如离液剂或洗涤剂等增溶剂实施所述溶解。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述离液剂为脲或胍盐酸盐。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述洗涤剂为SDS、N-乙酰基三甲基氯化铵或N-月桂酰基肌氨酸钠。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述增溶剂为胍盐酸盐。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述氧化试剂为碘或亚碘酰苯甲酸盐。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述氧化试剂为邻-亚碘酰苯甲酸盐。
【文档编号】C12N15/21GK103930433SQ201180074283
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2011年10月21日 优先权日:2011年10月21日
【发明者】游国明, 朱迪·慧泉·周, 珍妮弗·勒妮·霍普 申请人:泰福生技股份有限公司, 拉荷亚生物科技有限公司