专利名称：抗d人免疫球蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及抗D人免疫球蛋白的制备方法，属于血液制品领域。
背景技术：
在我国，汉族人以及大多数少数民族Rh⑶阴性血型所占的比例极少，仅占3/1000。但在新疆，维吾尔族Rh阴性血型的分布为5/100，远高于国内其他民族。抗D人免疫球蛋白(即或抗D-IgG)，在治疗Rh阴性的母亲分娩Rh阳性胎儿发生新生儿溶血症方面发挥着不可替代的作用，同时抗D-IgG也已经用于免疫性血小板紫癜(ITP)的治疗，并且有报道指出低剂量的抗D-IgG优于高剂量的静注丙球治疗ITP。鉴于此，在新疆开展抗-D人免疫球蛋白项目的研发，具有其他地区不可比拟的优越性，意义重大。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了抗D人免疫球蛋白(抗D-IgG)的制备方法，是从含有高滴度抗-D人免疫球蛋白的混合人血浆，经低温乙醇分离法分离纯化，并经多步病毒灭活方法处理。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为抗D人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤
1)血浆融化将原料血浆清洁消毒后融化,并于反应罐中合并；
2)组分分离用质量百分含量为0.85%的氯化钠溶液稀释血浆至蛋白质含量为4. 5%-5. 5%，调节pH值至7. 2±0. 05，降温至0°C后，喷入_15°C以下的95%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，反应液最终温度控制在-2. 5±0. 5°C，离心分离上清液，得到FI反应液和FI沉淀；
3)过滤JfFI反应液调节pH值至6.90±0. 05，喷入-15°C以下95%乙醇至乙醇终浓度为20%，反应液最终温度控制在-5±0. 5°C，搅拌2小时再静置2小时后，加入硅藻土吸附杂质，搅拌30分钟、静置，压滤得到的沉淀即为F II +III沉淀；
4)分离FIII :将步骤2)得到的FI沉淀和F II + III沉淀混合，得到F I + II + III沉淀，每千克F I + II + III沉淀以9L 0. 01mol/L的NaCl溶液溶解后，以pH4. 0醋酸钠溶液调pH至5. I ±0. 05，再将反应液温度调至0-0. 50C，加入预冷至_15°C以下的95%的乙醇至反应液乙醇终浓度为17%，之后搅拌2小时，静置过夜后进行压滤分离，得到F III滤液；
5)超滤脱盐脱醇浓缩将步骤4)得到的FIII滤液缓慢加入0. 5mol/L的盐酸液，调节pH至3. 8-4，用2-8°C水进行透析，至乙醇含量小于等于1%，并将蛋白液浓缩至3%以上浓度，得到浓缩蛋白液；
6)凝胶柱层析提纯包括以下步骤
a、将步骤5)得到的浓缩蛋白液，以0.5mol/L NaOH溶液调pH至6. 4-6. 8，用lmol/L PB溶液调浓缩蛋白液电导至2. 1±0. 2 X 103y s/cm ；
b、用磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱；C、上样步骤a得到的浓缩蛋白液，至IgG蛋白峰出现时收集穿透蛋白液；d、上样完成后用磷酸盐缓冲液冲洗，待IgG蛋白峰下降至最高峰的2/3处时，以醋酸盐缓冲液冲洗层析柱，得到层析蛋白液；
7)二次超滤脱盐浓缩将步骤6)得到的层析蛋白液，缓慢加入0. 5mol/L的盐酸溶液，调节PH至3. 8-4，用2-8°C水进行透析，至乙醇含量小于等于0. 025%,并将层析蛋白液浓缩至6%以上浓度，得到二次浓缩蛋白液；
8 )将步骤7 )得到的二次浓缩蛋白液中加入麦芽糖、pH调节液和水，使最终制品蛋白含量为5. 05-5. 2%，麦芽糖浓度为10±1%，pH值为4. 1±0. 3，并立即进行灭菌；
9)低pH孵放病毒灭活将步骤8)得到的灭菌后的二次浓缩蛋白液在温度23°C-25°C下孵育21天；
10)三次超滤脱糖浓缩将步骤9)得到的低pH孵放到期的二次浓缩蛋白液，用5倍体积的2-8°C透析水进行透析，并浓缩至10%以上浓度，得到三次浓缩蛋白液；
11)将步骤10)得到的三次浓缩蛋白液中按照10-30g/L加入甘氨酸，并调节pH至
6.4-7. 4，得到抗D人免疫球蛋白；
12)将步骤11)得到的抗D人免疫球蛋白以DV50进行除病毒。进一步的，所述步骤2)和步骤3)中调节pH值所用的调节剂为pH4. 0的醋酸盐缓冲液。进一步的，所述步骤3)中，硅藻土的加入量为每IL反应液加入2g。进一步的，所述步骤4)中，压滤分离的条件为温度控制在_4.5°C ±1.0°C，压滤压力控制在小于等于0. IMPa0进一步的,所述步骤6)中，所用的凝胶柱为DEAE-SepHarose-FF凝胶柱。进一步的,所述步骤8)中，pH调节液为0. 5mol/L的盐酸溶液。进一步的，所述步骤5)、7)、10)中，所述的透析条件分别为透析液蛋白浓度为0. 5-1%，透析水用量为透析液的6倍，透析水温度为2-8°C，透析膜截留分子量为50KD。进一步的，所述步骤12)中，是用Ultipor VF DV50除病毒过滤器进行病毒去除。本发明的有益效果为抗D-IgG是预防Rh血型母婴不合导致新生儿溶血病(HDN)和Rh血型不相容输血引起的不良反应的有效制品，同时在免疫性血小板紫癜(ITP)的治疗方面也起着越来越重要的作用，但至今未见相关制品上市，因此，对于抗-D人免疫球蛋白的研究开发工作，不仅充分利用了新疆的又一独特资源一Rh阴性人血液中的抗D-IgG，同时，必将带来巨大的社会效益和经济效益。
图I为抗D人免疫球蛋白的制备工艺流程图。
具体实施例方式实施例I :
准备工作Ultipor VF DV50除病毒过滤器为颇尔公司的Ultipor VF DV50除病毒过滤器。I、供血浆者的选择健康的Rh阴性男性及健康的更年期已过两年或者做过绝育手术的女性；可也筛选出对Rh(D)抗原而致敏的人群。2、供血浆者的免疫
2.I没有产生过Rh (D)抗原致敏的献浆员
静注l-2mlRh阳性的红细胞，3个月后再次注射一针l-2ml经过仔细筛选确认的Rh阳性红细胞，为保持血浆中抗D-IgG滴度在I :512(间接coombs方法)，必须每隔2_9个月，再次注射Rh阳性的红细胞。2. 2产生过Rh免疫反应的献浆员
每间隔两周注射0. 5ml的Rh阳性红细胞，加强免疫，直到血浆中抗D-IgG合适的滴度。3、采集血浆 测定献浆员血浆抗D-IgG滴度，筛选出抗D-IgG的滴度应至少达到20-30 u g/ml的血浆，使用自动采浆机采集血浆。抗D人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤
1)血浆融化将原料血浆清洁消毒后融化,并于反应罐中合并；
2)组分分离用质量百分含量为0.85%的氯化钠溶液稀释血浆至蛋白质含量为
4.5%-5. 5%，调节pH值至7. 2±0. 05，降温至0°C后，喷入_15°C以下的95%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，反应液最终温度控制在-2. 5±0. 5°C，离心分离上清液，得到FI反应液和FI沉淀；
3)过滤将FI反应液调节pH值至6.90±0. 05，喷入-15°C以下95%乙醇至乙醇终浓度为20%，反应液最终温度控制在-5±0. 5°C，搅拌2小时再静置2小时后，加入硅藻土吸附杂质，搅拌30分钟、静置，压滤得到的沉淀即为F II + III沉淀；
4)分离FIII :将步骤2)得到的FI沉淀和F II + III沉淀混合，得到F I + II + III沉淀，每千克F I + II + III沉淀以9L 0. 01mol/L的NaCl溶液溶解后，以pH4. 0醋酸钠溶液调pH至5. I ±0. 05，再将反应液温度调至0-0. 50C，加入预冷至_15°C以下的95%的乙醇至反应液乙醇终浓度为17%，之后搅拌2小时，静置过夜后进行压滤分离，得到F III滤液；
5)超滤脱盐脱醇浓缩将步骤4)得到的FIII滤液缓慢加入0. 5mol/L的盐酸液，调节pH至3. 8-4，用2-8°C水进行透析，至乙醇含量小于等于1%，并将蛋白液浓缩至3%以上浓度，得到浓缩蛋白液；
6)凝胶柱层析提纯包括以下步骤
a、将步骤5)得到的浓缩蛋白液，以0.5mol/L NaOH溶液调pH至6. 4-6. 8，用lmol/L PB溶液调浓缩蛋白液电导至2. 1±0. 2 X 103y s/cm ；
b、用磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱；
C、上样步骤a得到的浓缩蛋白液，至IgG蛋白峰出现时收集穿透蛋白液；d、上样完成后用磷酸盐缓冲液冲洗，待IgG蛋白峰下降至最高峰的2/3处时，以醋酸盐缓冲液冲洗层析柱，得到层析蛋白液；
7)二次超滤脱盐浓缩将步骤6)得到的层析蛋白液，缓慢加入0. 5mol/L的盐酸溶液，调节PH至3. 8-4，用2-8°C水进行透析，至乙醇含量小于等于0. 025%,并将层析蛋白液浓缩至6%以上浓度，得到二次浓缩蛋白液；
8)将步骤7 )得到的二次浓缩蛋白液中加入麦芽糖、pH调节液和水，使最终制品蛋白含量为5. 05-5. 2%，麦芽糖浓度为10±1%，pH值为4. 1±0. 3，并立即进行灭菌；
9)低pH孵放病毒灭活将步骤8)得到的灭菌后的二次浓缩蛋白液在温度23°C-25°C下孵育21天；
10)三次超滤脱糖浓缩将步骤9)得到的低pH孵放到期的二次浓缩蛋白液，用5倍体积的2-8°C透析水进行透析，并浓缩至10%以上浓度，得到三次浓缩蛋白液；
11)将步骤10)得到的三次浓缩蛋白液中按照10-30g/L加入甘氨酸，并调节pH至
6.4-7. 4，得到抗D人免疫球蛋白；
12)将步骤11)得到的抗D人免疫球蛋白以DV50进行除病毒。步骤2)和步骤3)中调节pH值所用的调节剂为pH4. 0的醋酸盐缓冲液。 步骤3)中，硅藻土的加入量为每IL反应液加入2g。步骤4)中，压滤分离的条件为温度控制在-4. 5°C ± I. (TC，压滤压力控制在小于等于 0. IMPa0步骤6)中，所用的凝胶柱为DEAE-SepHarose-FF凝胶柱。步骤8)中，pH调节液为0. 5mol/L的盐酸溶液。步骤5)、7)、10)中，所述的透析条件分别为透析液蛋白浓度为0. 5-1%，透析水用量为透析液的6倍，透析水温度为2-8°C，透析膜截留分子量为50KD。步骤12)中，DV50除病毒的具体过程为用颇尔公司的Ultipor VF DV50除病毒过滤器进行病毒去除。最终广品确认
按照本发明提供的技术方案进行了小试，制备出实验室样品，并按照《中华人民共和国药典》对样品进行了鉴别(免疫电泳、免疫双扩散)、抗D效价、分子大小分布、pH值、纯度等主要指标的检测。根据检测结果显示制备的样品主要成分为抗D IgG，其纯度达到98%，抗D效价为115Mg /ml，结果符合规定。
检测结果如表I所示
权利要求
1.抗D人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤 1)血浆融化将原料血浆清洁消毒后融化,并于反应罐中合并； 2)组分分离用质量百分含量为0.85%的氯化钠溶液稀释血浆至蛋白质含量为4.5%-5. 5%，调节pH值至7. 2±0. 05，降温至(TC后，喷入_15°C以下的95%こ醇至反应液こ醇浓度为8%，反应液最终温度控制在-2. 5±0. 5°C，离心分离上清液，得到FI反应液和FI沉淀； 3)过滤将FI反应液调节pH值至6.90±0. 05，喷入-15°C以下95%こ醇至こ醇终浓度为20%，反应液最终温度控制在_5±0. 5°C，搅拌2小时再静置2小时后，加入硅藻土吸附杂质，搅拌30分钟、静置，压滤得到的沉淀即为F II + III沉淀； 4)分离FIII :将步骤2)得到的FI沉淀和F II + III沉淀混合，得到F I + II + III沉淀，每千克F I + II + III沉淀以9L 0. 01mol/L的NaCl溶液溶解后，以pH4. 0醋酸钠溶液调pH至5. I ±0. 05，再将反应液温度调至0-0. 50C，加入预冷至-15°C以下的95%的こ醇至反应液こ醇终浓度为17%，之后搅拌2小吋，静置过夜后进行压滤分离，得到F III滤液； 5)超滤脱盐脱醇浓缩将步骤4)得到的FIII滤液缓慢加入0. 5mol/L的盐酸液，调节pH至3. 8-4，用2-8°C水进行透析，至こ醇含量小于等于1%，并将蛋白液浓缩至3%以上浓度，得到浓缩蛋白液； 6)凝胶柱层析提纯包括以下步骤 a、将步骤5)得到的浓缩蛋白液，以0.5mol/L NaOH溶液调pH至6. 4-6. 8，用lmol/L PB溶液调浓缩蛋白液电导至2. 1±0. 2X 103y s/cm ； b、用磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱； C、上样步骤a得到的浓缩蛋白液，至IgG蛋白峰出现时收集穿透蛋白液； d、上样完成后用磷酸盐缓冲液冲洗，待IgG蛋白峰下降至最高峰的2/3处时，以醋酸盐缓冲液冲洗层析柱，得到层析蛋白液； 7)二次超滤脱盐浓缩将步骤6)得到的层析蛋白液，缓慢加入0. 5mol/L的盐酸溶液，调节PH至3. 8-4，用2-8°C水进行透析，至こ醇含量小于等于0. 025%,并将层析蛋白液浓缩至6%以上浓度，得到二次浓缩蛋白液； 8)将步骤7)得到的二次浓缩蛋白液中加入麦芽糖、pH调节液和水，使最终制品蛋白含量为5. 05-5. 2%，麦芽糖浓度为10±1%，pH值为4. 1±0. 3，并立即进行灭菌； 9)低pH孵放病毒灭活将步骤8)得到的灭菌后的二次浓缩蛋白液在温度23°C-25°C下孵育21天； 10)三次超滤脱糖浓缩将步骤9)得到的低pH孵放到期的二次浓缩蛋白液，用5倍体积的2-8°C透析水进行透析，并浓缩至10%以上浓度，得到三次浓缩蛋白液； 11)将步骤10)得到的三次浓缩蛋白液中按照10-30g/L加入甘氨酸，并调节pH至6.4-7. 4，得到抗D人免疫球蛋白； 12)将步骤11)得到的抗D人免疫球蛋白以DV50进行除病毒。
2.根据权利要求I所述的抗D人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)中调节pH值所用的调节剂为pH4. 0的醋酸盐缓冲液。
3.根据权利要求I所述的抗D人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，娃藻土的加入量为姆IL反应液加入2g。
4.根据权利要求I所述的抗D人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，压滤分离的条件为温度控制在-4. 5°C ±1. (TC，压滤压力控制在小于等于0. IMPa0
5.根据权利要求I所述的抗D人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中，所用的凝胶柱为DEAE-S印Harose-FF凝胶柱。
6.根据权利要求I所述的抗D人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤8)中，PH调节液为0. 5mol/L的盐酸溶液。
7.根据权利要求I所述的抗D人免疫球蛋白的制备方法，其特征在干，所述步骤5)、7)、10)中，所述的透析条件分别为透析液蛋白浓度为0. 5-1%，透析水用量为透析液的6倍，透析水温度为2-8°C，透析膜截留分子量为50KD。
8.根据权利要求I所述的抗D人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤12)中，是用Ultipor VF DV50除病毒过滤器进行病毒去除。
全文摘要
本发明公开了抗D人免疫球蛋白(抗D-IgG)的制备方法，是从含有高滴度抗-D人免疫球蛋白的混合人血浆，经低温乙醇分离法分离纯化，并经多步病毒灭活方法处理。本发明的有益效果为抗D-IgG是预防Rh血型母婴不合导致新生儿溶血病(HDN)和Rh血型不相容输血引起的不良反应的有效制品，同时在免疫性血小板紫癜(ITP)的治疗方面也起着越来越重要的作用，但至今未见相关制品上市，因此，对于抗-D人免疫球蛋白的研究开发工作，不仅充分利用了新疆的又一独特资源——Rh阴性人血液中的抗D-IgG，同时，必将带来巨大的社会效益和经济效益。
文档编号C07K16/18GK102816237SQ20121021535
公开日2012年12月12日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者吕献忠, 孔冬冬 申请人:新疆德源生物工程有限公司