专利名称：抗蓝舌病病毒vp7蛋白的单克隆抗体，分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体。本发明还涉及上述杂交瘤细胞株和单克隆抗体在制备诊断蓝舌病病毒感染动物试剂中的应用，属于蓝舌病的防治领域。
背景技术：
蓝舌病(Bluetonguedisease, BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue disease virus,BTV)引起的，通过吸血昆虫传播的反刍动物病毒性传染病，以口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发 生溃疡性炎症变化为特征。BTV为双股RNA病毒，其基因组包含10个节段，大小约为19kb。BTV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)蓝舌病病毒亚群(Bluetinguevirus subgroup)的成员之一，环状病毒属共有14个亚群,其中蓝舌病病毒亚群与鹿出血症病毒亚群有较强的交叉反应性。BT最早于1876年发现于南非的绵羊，由于发病绵羊持续高热，口腔出现溃疡损伤，口腔粘膜及舌头发蓝，因此，于1906年提议定名为“蓝舌病”，牛的BT发现于1943年。BTV几乎可以感染所有的反刍动物，包括家养和野生的牛、山羊和某些野生动物。牛、山羊、鹿及羚羊等野生反刍动物可长期带毒，并在疾病流间歇期扮演着病毒宿主的角色。而吸血昆虫，特别是库蠓是其主要传播媒介。1940年前本病仅限于撒哈拉以南的非洲大陆，到40年代已蔓延至中东一些国家和地区，例如塞浦路斯、叙利亚、伊拉克、土耳其、以色列和巴勒斯坦。1948年美国报道此病。70年代后期本病广泛分布于热带、亚热带国家。1956 1957年在欧洲尤其是西班牙和葡萄牙流行。1978在澳大利亚的库蠓体内分离到BTV。目前，热带和亚热带地区绝大多数国家的易感动物都可能感染BTV或与之密切相关的病毒。我国于1979年在云南师宗首先发现本病并分离出BTV，从而确定了本病在国内的存在，随后在湖北(1983)、安徽(1985)、四川(1988)、甘肃(1990)、山西(1991)等29个省均检出BTV血清学阳性牲畜。近年来，随着全球气候变暖，BT在许多国家相继爆发，且分布范围不断扩大。2006年8月，德国、比利时、法国、荷兰等首次发现牛感染BT，2007年7月，英国、法国、意大利等国爆发本病。世界动物卫生组织(OIE)通报，2008年3月 4月，法国、意大利等国爆发了 BT，2009年I月 12月，英国、法国、意大利、澳大利亚、希腊、以色列、丹麦、捷克、瑞典、挪威、西班牙、德国、奥地利、葡萄牙、匈牙利、荷兰、阿曼、阿尔及利亚、摩洛哥和突尼斯等国先后爆发BT。由于BTV有24个血清型，各个国家血清型分布不均一，到目前为止，并没有有效的疫苗来防治本病，所以，早期准确诊断，早期预防，是防止本病爆发的最有效方法。鉴于我国已在多数省份和地区检测到该病，加之国际贸易中本病存在的风险，故我国急需加强对该病的研究，做好可对其进行防控和检测的技术储备，特别是建立BT的实验室诊断方法尤为重要。VP7是一种极端疏水的蛋白质，具有349个氨基酸，比较VP7蛋白的一级结构，发现各血清型BTV-VP7蛋白中94%以上的氨基酸保守，包括第255位的赖氨酸。氨基酸序列的保守决定了 VP7是群特异性抗原这一特征。目前已有实验证实了 VP7蛋白存在绝对保守区域，更为重要的是，VP7是病毒核心颗粒上的主要暴露蛋白，至少有两个表位暴露于病毒表面，这些特性均表明VP7可以作为检测BT的理想靶抗原。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株能够分泌抗蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本发明的目的之二是提供一 种可与24个血清型蓝舌病病毒(BTV)发生特异性反应，而与IBAV、CV、AKAV, BVDV, IBRV、BRV、RV、BEV和FMDV不发生反应的单克隆抗体；本发明的目的之三是提供以上所述的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体在制备诊断或检测蓝舌病病毒(BTV)感染动物试剂中的应用。本发明是通过以下技术方案来实现的本发明采用TRIZOL法提取BTV-12型病毒总RNA，进而利用反转录技术克隆VP7基因cDNA，将该cDNA插入原核表达载体pMAL_c4X，利用pMAL_c4x原核表达载体通过TBl感受态细胞对BTV-VP7基因进行原核表达，本实验室所表达的重组VP7蛋白携带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签，利用pMAL融合蛋白表达与纯化试剂盒中提供的直链淀粉树脂柱，对融合表达的VP7蛋白进行纯化。将一部分纯化后的可溶性BTV-VP7蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。另一部分纯化后的VP7蛋白作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选最终获得一株稳定分泌抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV-4H7，其分类命名为分泌BTV-4H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCCNo. 5715，保藏日期为2012年I月16日。另外，本发明还提供了一种由所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，并将该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体命名为BTV-4H7。 间接免疫荧光技术检测结果表明，BTV-4H7可与24个血清型BTV发生特异性反应，而与 IBAV、AKAV, CV、BVDV, IBRV、BRV、BEV、RV 和 FMDV 不发生反应。因此，本发明又提出了所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或检测蓝舌病病毒(BTV)感染动物试剂中的应用。及所述的单克隆抗体在制备诊断或检测蓝舌病病毒(BTV)感染动物试剂中的应用。综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对BTV群特异性抗原VP7蛋白的单克隆抗体。为建立BT的血清学诊断方法奠定了基础。
图I为BTV-VP7基因RT-PCR扩增结果；I DL5000 DNA Marker ;2、3 VP7 基因 RT-PCR 扩增结果。图2为重组质粒pMAL-c4X_VP7的酶切鉴定；I DL1500 DNA Marker ；2 =EcoR I 和 Sal I 酶切 pMAL_c4X 结果;3、4 :EcoRI 和 SalI 酶切 pMAL-c4X-VP7 结果。图3为重组表达BTV-VP7的SDS-PAGE分析结果；I :重组子pMAL-c4X-VP7未诱导产物；2 :重组子pMAL-c4X_VP7诱导5小时表达产物；3 :重组子pMAL-c4X-VP7诱导10小时表达产物；4 :重组子pMAL-c4X_VP7诱导24小时菌体内表达产物；5 :重组子pMAL-c4X-VP7诱导24小时菌液中表达产物；6 :蛋白质分子标准(14. 4-116KD) ；7 :空载体pMAL_c4X诱导24小时表达产物。图4为重组蛋白pMAL-c4X_VP7纯化结果。I :未纯化重组蛋白；2 :纯化后的重组蛋白；3 :蛋白质分子量标准(10-200KD)。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。主要实验材料和来源I.蛋白、细胞和病毒原核细胞表达并纯化BTV12-VP7蛋白、TBl感受态细胞、BHK-21鼠源肾细胞、SP2/0骨髓瘤细胞、BTVl 24型病毒株、IBAV、CV和AKAV均由哈尔滨兽医研究所保存，提供；BVDV 和IBRV由哈尔滨兽医研究所薛飞研究员提供；BRV、RV、BEV和FMDV由哈尔滨兽医研究所于力研究员提供。2.主要试剂和药品胎牛血清(FBS )、DMEM和L-谷氨酰胺购自GIBCO公司；弗氏佐剂、50%PEG、50XHAT.50X HT、8-氮鸟嘌呤(8-AG)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG购自Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG为金桥生物技术有限公司进口分装；SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于 Southern Biotechnology公司；pMAL Protein Fusion and Purification System融合蛋白表达与纯化试剂盒购自New ENGLAND Biolabs (NEB)公司；限制性内切酶EcoRI和Sail反转录酶、T4连接酶和LATaq聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司。胶回收试剂盒购自上海华舜公司。3.实验动物6周龄BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。 实施例1BTV-VP7蛋白的原核表达及纯化I.引物设计根据GenBank上登陆的BTV-12 S7基因序列(序列号为AY263377)设计PCR扩增引物，序列如下BTVP7-EcoR I -18F :5’ -GACGAATTCATGGACACTATCGC-3’，划线部分为引入的EcoR I酶切位点。BTVP7-SalI-1067R :5’ -TAAGTCGACTTACACATAGGCGGC-3，，划线部分为引入的 SalI酶切位点。2. BTV-12病毒RNA的提取及反转录
利用Trizol法从感染BTV-12的BHK-21细胞中提取病毒基因组RNA作为模板，用BTVP7-Sal I -1067R引物做为反转录引物，进行反转录合成病毒cDNA。Trizol法提取RNA步骤收获感染BTV-12的BHK-21细胞1-5X IO7个，加入ImLTrizol混匀，室温静置5min，加入0. 2mL氯仿，用カ振摇15s，室温孵育2_3min，12000g, 4 °C离心15min，离心后液体分三层，小心取出上层无色液体，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后室温孵育10min，12000g，4°C离心lOmin，弃上清，沉淀加入ImL 75 %的こ醇(DEPC水配制的)，轻振15s，7500g，4°C离心5min，小心弃尽上清，沉淀室温风干3_5min，加入20-30 u LDEPC水溶解，-20°C保存。用提取的病毒总RNA进行反转录合成cDNA，体系如下
病毒总RNA9.5 JiL
20mM 引物1.5 JiL
IOmMdNTPs2 ^iL
5X AMV buffer4 ‘uL
AMV2 [IL
RnasmI jxL反应过程中，先将病毒总RNA和引物干95°C孵育lOmin，冰浴冷却5min，然后将其余试剂加入，混匀，42°C孵育60min，70°C孵育15min灭活。3. BTV-12VP7基因扩增与纯化以反转录获得的cDNA为模板，利用所设计的BTVP7_EcoR I -18F做为上游引物、BTVP7-Sal I -1067R做为下游引物，扩增BTV-12型病毒VP7基因片段。PCR反应体系(50 ii L)如下
IOxLA Taq Buffer5 |_iL
2.5mM dNTPs8 |_iL
LA Taq0.5 (iL
20mM上游引物2卩L
20mM下游引物2
cDNA 模板I
灭菌ddH2031.5反应条件为94°C预变性 5min ;94°C变性 lmin，54°C退火 lmin，72°C延伸 I. 5min，循环扩增30次；72°C延伸IOmin。然后对PCR产物胶回收，将全部PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下切取含有目的基因的胶块，之后按照上海华舜生物工程有限公司胶回收试剂盒说明书回收PCR扩增出的VP7基因BTV-VP7基因RT-PCR扩增结果如图I所示。VP7基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。4.BTV-VP7基因与表达载体的连接将胶回收得到的VP7基因进行酶切，酶切体系如下
IOxH Buffer5 pL
EcoR I2.5 jaL
Sal 丨2.5‘uL VP7基因10 |iL
灭菌 ddH2030 ML同时,对原核表达载体PMAL-C4X进行酶切，酶切体系如下
IOxH Buffer5 |iL
EcoR I2.5 liL
Sal I2.5 pL
pMAL-c4X 载体15
灭菌ddH2025 f.iL上述酶切反应条件为37°C水浴，作用时间为4h，之后将全部酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收。将双酶切并胶回收纯化的VP7基因及pMAL_c4X原核载体进行连接，连接体系如下
10x14 DNA Ligase BufferI
T4 DNA 连接酶0.5 IiL
酶切VP7基因4成
酶切pMAL-c4X载体2 ^iL
灭菌ddH202.5 |iL连接条件为在DNA连接仪中16°C，过夜。5.转化与挑菌将4中得到的连接产物全部转入E. coli DH5a感受态细胞中，冰水浴放置30min，之后42°C水浴热刺激I. 5min，再迅速将其置于冰水浴中，静置2min。向管中加入250 y L LB液体培养基，37°C摇床中摇动培养lh，将100 u L菌液涂布于含氨苄青霉素(100 u g/mL)的LB平板上，37°C培养过夜。从平板上随机挑取单个菌落，分别接种到5mL LB (Amp+, 100 u g/mL)液体培养基中37°C振荡培养。6.重组质粒的酶切鉴定与测序 I)利用AXYGEN公司的质粒小量抽提试剂盒，按照试剂盒说明书操作从5中培养的菌液中提取质粒，将所提取的质粒与PMAL-C4X载体质粒一起进行琼脂糖凝胶电泳，选出疑似重组质粒。2)对疑似重组质粒进行酶切鉴定，酶切体系如下
IOxH Buffer5 \iL
EcoR I2.5 uL
Sal 丨2.5‘uL
重组质粒10
灭菌ddH2030 酶切条件为37°C水浴，作用此。3)将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初歩判定阳性质粒。4)将经过初歩断定含有阳性质粒的菌液送交南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列測定，将通过序列測定，鉴定正确的重组质粒命名为pMAL-c4X-VP7。重组质粒pMAL-c4X-VP7的酶切鉴定结果如图2所示。7. BTV-12VP7基因的原核表达与纯化按照5所述转化方法将重组质粒pMAL-c4X_VP7转化到原核表达用TBl感受态细胞，然后取出100 u L菌液涂布于含有氨苄青霉素(100 u g/mL)的LB平板上，37°C培养过夜，挑取LB平板培养基上的白色孤立菌落，接种于5mL含有氨苄青霉素(100 u g/mL)的LB液体培养基中37°C培养过夜。表达诱导条件采用pMAL融合蛋白表达与纯化试剂盒说明书推荐的条件，具体操作如下取ImL重组菌菌液加入到IOOmL的LB培养基中37°C震荡培养至0D600nm约为0. 5时，加IPTG至终浓度为0. 5mmol/L, 16°C诱导24h。本试验所表达的重组VP7蛋白携带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签，利用pMAL融合蛋白表达与纯化试剂盒中提供的直链淀粉树脂柱，可以对融合表达的VP7蛋白进行纯化。纯化步骤參照试剂盒说明书进行，具体如下将经过诱导的500mL菌液4000g，室温离心lOmin，收集细菌沉淀。用25mL Column Buffer (pH7. 0)重悬细菌沉淀，并对重悬的细菌进行超声波处理。将超声破碎后的菌液9000g，4°C离心20min。将离心后的上清在直链淀粉树脂柱中过柱(2mL)5次后，用12倍柱体积的ColumnBuffer (pH7. 0)清洗树脂柱，最后用5mL含IOmM麦芽糖的Column Buffer (pH7. 0)洗脱融合蛋白，即表达纯化的BTV VP7蛋白，重组表达BTV-VP7的SDS-PAGE分析结果如图3所示，重组蛋白pMAL-c4X_VP7纯化后SDS-PAGE分析结果如图4所示。所表达的BTV VP7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。实施例2单克隆抗体的制备I.小鼠免疫以纯化后的原核表达重组VP7蛋白免疫5只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，一免将重组VP7蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，ニ免和三免将重组VP7蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，免疫剂量为50 y g/只，免疫途径为腹腔免疫。分别在ニ免和三免后一周对小鼠进行断尾采血，分离血清(4°C离心，3000g, IOmin),用间接ELISA检测抗体水平。在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠再进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射50 ii g免疫抗原(不加佐剂)。2.细胞融合
融合前一天准备饲养层细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髄瘤细胞4:1的比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准好的饲养层细胞之上。3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆利用纯化后的原核表达BTV12-VP7蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆，克隆3轮，将克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。并最终获得ー株可以稳定分泌抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为BTV-4H7，其分类命名为分泌BTV-4H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 5715，保藏日期为2012年I月16日。4.单克隆抗体的大量制备
给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，0. 5mL/只，I周后腹腔注射I X IO6个杂交瘤细胞，7d IOd后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽ー次，将抽取的腹水10000g/min离心lOmin，去除上层油脂和沉淀，上清分装保存于_20°C。实施例3单克隆抗体的鉴定I.单克隆抗体的亚类鉴定SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒对实施例I所制备的单克隆抗体进行亚类鉴定，具体方法參照操作说明书进行。结果显示本发明单克隆抗体BTV-4H7的重链为IgG1，轻链为k链。2. IFA 试验将生长至70% 80%的BHK-21细胞接毒I 24型BTV。感染48小时后冷こ醇4° C固定30分钟，I :100倍稀释的BTV-VP7腹水感作I小时，然后1:128倍稀释的FITC标记的羊抗鼠ニ抗37° C感作I小吋。最后荧光显微镜观察結果。为了印证本发明实施例I所制备的单克隆抗体与BTV反应的特异性，本实验还设定了 IBAV、AKAV, CV、BVDV, IBRV、BRV、BEV、RV 和 FMDV 对照。试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体BTV-4H7能够与I 24型BTV反应而与 IBAV、AKAV, CV、BVDV, IBRV、BRV、BEV、RV 和 FMDV 不反应(表 I )。表IIFA鉴定单克隆抗体4H7特异性
权利要求
1.一株分泌抗蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No. 5715。
2.一种由权利要求I所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求I所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或检测蓝舌病病毒感染动物试剂中的应用。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或检测蓝舌病病毒感染动物试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体，分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用。本发明以原核表达的BTV-VP7蛋白免疫BALB/c小鼠，分离免疫后小鼠的脾细胞，使其与SP2/0细胞进行融合，用原核表达的BTV-VP7蛋白检测分泌相应单克隆抗体的杂交瘤细胞，并采用有限稀释法对筛选到的杂交瘤细胞进行分离纯化，最终得到一株可以稳定分泌抗BTV-VP7蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其所分泌的单克隆抗体命名为BTV-4H7。IFA实验结果显示BTV-4H7可以与1～24型BTV发生特异性反应。利用该单克隆抗体建立的C-ELISA可以快速、准确的检出1～24型BTV感染动物阳性血清。
文档编号C07K16/10GK102776152SQ20121021307
公开日2012年11月14日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者刘霓红, 吴东来, 徐青元, 杨涛 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 哈尔滨维科生物技术开发公司