专利名称：方法
方法
技 术领域本发明涉及蛋白质的合成和修饰。具体地，本发明涉及赖氨酸连接的蛋白质的修饰。
背景技术：
赖氨酸残基是蛋白质翻译后修饰的关键决定因素，它们在主要的翻译后修饰如泛素化、甲基化和乙酰化中的作用已为人熟知。然而，选择性地修饰蛋白质中的特定赖氨酸残基仍是一个问题。泛素化是一个可逆的翻译后修饰，在该过程中受体蛋白中的特定赖氨酸残基与泛素供体的C-末端形成异肽键。虽然泛素化通过蛋白酶体靶向来调节蛋白质稳定性的作用是公认的，但目前显示泛素参与生物学的几乎每一个方面，包括细胞信号转导、细胞内转运和对DNA损伤的应答W。泛素通过它的每个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48或K63)或通过N-末端形成共价链，并且认为泛素在不同的生物过程中介导的不同功能可能被编码在不同泛素链的不同性质中2’3。虽然蛋白质组学研究揭示体内存在所有的链类型4’5，但所知的多数均与K48链和K63链有关，这两个链分别在蛋白酶体降解和细胞信号传导中起重要作用w。相比之下，对其他所谓的“非典型”连接(linkage)知之甚少，而这些“非典型”连接则占在蛋白质组学数据已知的模式生物中发现的泛素连接的一半以上5。研究具体泛素链的作用的关键难题在于合成具有所定义的连接的均质链。本发明旨在克服与现有技术相关的问题。发明概述本发明人已经解决了特异靶向多肽链内用于修饰的单个赖氨酸残基的问题，其中一方面是在基因工程上编码用于目标赖氨酸的化学保护。这能够实现多肽链内特定残基的位点特异性保护。更重要的是，本发明人开发了用于差异保护多肽中的赖氨酸的技术。具体而言，本发明人教导了不同于基因工程编码的保护的化学保护的使用。通过这种方式，产生的多肽可具有受通过目标赖氨酸的基因工程编码保护的位点特异性保护的所述目标赖氨酸。然后，这种具有受位点特异性保护的赖氨酸的多肽可以进行化学处理以保护每个剩余的(未被保护的)具有不同化学保护基团的赖氨酸残基。这种双重方法具有的优点是形成的多肽在其赖氨酸上具有两种不同类型的化学保护。这能够使原始的目标赖氨酸通过化学被选择性地去保护，同时使其他赖氨酸上的其他保护基团保持完整。通过这种方式，目标赖氨酸被位点特异地的去保护并因此可以被修饰，而其他赖氨酸则不受影响。最后，根据需要所有未被修饰的赖氨酸都可以被任选地去保护以留下与天然相同的赖氨酸残基。本发明是基于选择性的保护/去保护多肽序列中的目标赖氨酸的创造性的差异化学方法。因此，一方面，本发明提供了修饰包含至少两个赖氨酸残基的多肽中的特定赖氨酸残基的方法，所述方法包括(a)提供包含受第一保护基团保护的目标赖氨酸残基和至少一个另外的赖氨酸残基的多妝；(b)处理所述多肽以保护所述另外的赖氨酸残基，其中所述另外的赖氨酸残基的保护基团不同于所述目标赖氨酸残基的保护基团；(C)选择性地去保护目标赖氨酸残基；和
(d)修饰(C)的所述去保护了的赖氨酸残基。合适地，所述多肽的产生包括(i)提供编码所述多肽的核酸，所述核酸包含编码所述目标赖氨酸的正交密码子;(ii)在正交tRNA合成酶/tRNA对存在下翻译所述核酸，其中所述正交tRNA合成酶/tRNA对能够识别所述正交密码子并向所述多肽链中引入受第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基。合适地，所述正交密码子包括TAG，所述tRNA包括MbtRNAatt,所述tRNA合成酶包括 MbPyIRS。合适地，由第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基选自由N ε -(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸组成的组。合适地，由第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基是N ε_(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。合适地，所述另外的赖氨酸残基的保护基团选自N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)。当所述另外的赖氨酸残基的保护基团是N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)时，合适地，它在碱性DMSO中提供。合适地，所述另外的赖氨酸残基的保护基团是N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)。合适地，步骤(b)包括用含N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)的碱性DMSO处理所述多肽。合适地，所用的Cbz-Osu的量计算为[与被处理的多肽的量相当的摩尔量]乘以[多肽中待保护的赖氨酸数目加I]。有利地，这提供了用于与待保护的赖氨酸反应的略过量的保护基团，并由此有助于推动反应完全(饱和度/均匀性)。合适地，步骤(C)包括用含三氟乙酸(TFA)的水处理所述多肽。合适地，步骤(d)的修饰包括(i)通过在Ag (I)存在下转换成N-羟基琥珀酰亚胺酯而活化硫酯；(ii)将待连接的多肽加入至所述目标赖氨酸；和(iii)温育以形成特异的异肽键。合适地，步骤(d)的修饰在目标赖氨酸残基的ε -氨基基团上进行。合适地，在步骤(d)中可对目标赖氨酸进行多个修饰。合适地，如上所述的方法另外包括步骤(e):使所述另外的赖氨酸残基去保护。合适地，步骤(e)包括用比例为1:3:6的三氟甲磺酸(TFMSA):三氟乙酸(TFA) : 二甲基硫醚(DMS)的混合物处理所述多肽。修饰完成后去保护所有剩余的赖氨酸的好处之一是将所述多肽恢复至与其天然形式尽可能接近。合适地，步骤(a)包括通过在所述多肽的翻译过程中从基因工程学上向所述多肽链中引入受第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基而产生所述多肽。合适地，所述多肽是泛素。合适地，步骤(d)的修饰是另外的多肽链与所述目标赖氨酸的共价连接。合适地，所述另外的多肽链是泛素。在该实施方式中，本发明可有利地应用于多肽的泛素化。在一些实施方式中，所述多肽是泛素，所述另外的多肽链是泛素。在这些实施方式中，本发明可有利地应用于泛素链的生产。这些链可以简单地通过在第一多肽中选择适当·的赖氨酸残基进行靶向而以泛素的任何K-连接形式(如K6、K11、K27、K29、K33、K48或Κ63连接的泛素)产生。在进行多个修饰时，可重复步骤(c)-(d)以产生由通过赖氨酸残基的共价连接而连接的多肽链。显然，这可能包括在每轮修饰结束时且在按修饰顺序的下一反应进行前的重复去保护。或者，如果用于后续修饰的反应化学已经特异于来自前(几)轮修饰的目标赖氨酸(或经修饰的目标赖氨酸)，则后续的修饰可能不需要保护/去保护。本发明还提供了根据上述产生的多肽。所述多肽可包括K-连接的泛素链。所述K-连接可以是Κ6、Κ11、Κ27、Κ29、Κ33、Κ48或Κ63连接。合适地，所述K-连接是Κ6或Κ29连接。另一方面，本发明涉及TRABID作为Κ29去泛素化酶的应用。另一方面，本发明涉及切割Κ29连接的泛素的方法，所述方法包括使Κ29连接的泛素与TRABID接触。另一方面，本发明涉及包含至少一个受保护的赖氨酸残基的泛素多肽。泛素多肽包含一个或多个K6Boc、K29Boc。另一方面，本发明涉及编码泛素的核酸，其中在所述泛素中至少一个赖氨酸密码子被正交密码子替代。另一方面，本发明涉及本发明的K-连接泛素用于例如活化或增强对DNA损伤的响应，和/或用于预防或治疗诸如早发型乳腺癌或卵巢癌的癌症中的应用。这些应用可有利地用于药物中。本发明优选的方法也可在以下说明书中称为G0PAL(基因工程上编码的正交保护和活性连接)。合适地，本发明方法中的靶向反应用于将蛋白质连接在一起。在本发明的另一方面，提供了可从所述方法获得的蛋白质。合适地，所述蛋白质是泛素。在本发明的另一方面，提供了均匀连接的泛素链，其中所述泛素多肽通过第6位的赖氨酸残基和C-末端而连接。所述泛素链用于活化或增强对DNA损伤的响应，并因此用于预防或治疗癌症。
以下根据附图对本发明进行描述图I :用于位点特异性异肽键形成的GOPAL策略，例示了用于K6-连接非双泛素的合成的GOPAL策略。I为N ε -(叔丁氧基擬基)-L-赖氨酸,显不为蓝色。Cbz-Osu为N-(节氧基羰基)琥珀酰亚胺，其与蛋白质中赖氨酸的N ε -胺反应，产生N ε -(苄氧基羰基)_L_赖氨酸。TFA为三氟乙酸，DIEA为N，N-二异丙基乙胺，DMSO为二甲基亚砜，HOSu为N-(羟基)琥珀酰亚胺，TFMSA为三氟甲磺酸，DMS为二甲基硫。图2 :用UCH-L3切割UbBocK6_His6的六组氨酸标签。图3 :用于形成异肽键的供体和受体泛素反应伴侣的表征。A.受体泛素的电喷雾电离质谱(ESI-MS)。在第6位通过基因工程引入I的泛素(UbBocK6，绿色，i)。用UCH-L3去除UbBocK6-his6中的C-末端His标签(所观察的质量=866 a,所计算的质量=866 a),ia为Na+加合物。蓝色的ESI-MS图谱显示UbBocK6，其中的游离胺(amine)已经用Cbz进行了化学保护，并且I在第6位的保护基团Boc已被选择性地去保护。ii为UbK6 (Cbz7)，所观察的质量=9501. 5Da ;所计算的质量=9503Da ;iia 为 UbK6 (Cbz7) +Na+。iii 为 UbK6 (Cbz8)，所观察的质量=9636. 5Da ;所计算的质量=9637Da ;iiia为UbK6 (Cbz8) +Na+。iia和iia分别对应于少量的UbBocK6 (Cbz7)和UbBoc6 (Cbz8)，它们由TFA对I中Boc基团的不完全去保护而产生。B.纯化的泛素-MES硫酯(UbSR，橙色，i)。所观察的质量=8690Da，所计算的质量=8689Da。蓝色的ESI-MS图谱代表其中的游离胺已经用Cbz保护基团化学保护的UbSR。ii为UbSR(Cbz8)，所观察的质量=9760Da，所计算的质量=976IDa ;iii为UbSR(Cbz9)，所观察的质量=98%Da,所计算的质量=98%Da。图4:K6-连接和K29-连接的双泛素的合成、纯化和表征。A. UbBocK6 (Cbz7_8)和UbSR (Cbz7_8)之间的异肽形成反应的SDS-PAGE分析。泳道M，宽范围的分子量标记(Bio-Rad);泳道i，浓度经标准化的UbSR (Cbz7_8)上样；泳道ii，浓度经标准化的UbK6 (Cbz7_8)上样；泳道iii，16小时后的K6异肽键形成反应混合物。B. MonoS阳离子交换色谱后纯UbK62的洗脱部分。C.纯化的K6-连接的双泛素(UbK62)的ESI-MS分析证实了异肽键的形成(所观察的质量=17113Da，所计算的质量=17112Da)。D.纯化的K29-连接的双泛素(UbK292)的ESI-MS分析。i为异肽键的形成(所观察的质量=17111Da，所计算的质量=17112Da) ;ii为硝酸盐(所观察的质量=17174Da，所计算的质量=17175Da)。E.胰蛋白酶酶解的MS/MS图谱证实在纯化的K6-连接的双泛素样品中K6是异肽键形成的位点。肽MQIFVK (GG) TLTGK含有两个来自与受体泛素连接的供体泛素的甘氨酸残基。F.肽AK (GG)IQDKEGIPPDQQR的胰蛋白酶酶解的MS/MS图谱证实了在纯化的K29-连接的双泛素样品中K29是异肽键形成的位点。图5 (UbK6)2的纯化。A.粗的重折叠(UbK6)2的第一轮离子交换色谱。缓冲液A为pH 4. 5的NH40Ac。缓冲液B为pH 4. 5的NH4OAcUM NaCl。B.第二轮离子交换色谱，产生纯的K6-连接的双泛素。缓冲液A为pH 4. 5的NH40Ac。缓冲液B为pH 4. 5的NH4OAc、IM NaCl。图6 :K6-连接的双泛素的结构。Α.源自晶体结构的紧凑的Κ6-连接的双泛素分子的两个视图，卡通图中关键残基用球和棒显示。远端分子(黄色)通过其C-末端与邻近部分(橙色)的Lys6连接。疏水性表面残基分别显示为蓝色(Ile44、Val70)和绿色(Leu8)，并显示了泛素分子的N-末端和C-末端。B.与A相同视图的K6-连接的双泛素分子的表面图。远端分子的暴露出的Ile44和Val70显示为蓝色。C. K6-连接的二聚体中泛素-泛素界面的近视图。与A中颜色相同的泛素骨架显示为宽带，界面残基以棍图显示。形成近端界面的疏水残基(Ile44、Val70和Arg42)显示为蓝色，远端界面的疏水残基(Leu71、Leu8和Ile36)显示为绿色。Gln49pra^PThr9dist之间的界面氢键用灰色虚线表示。D.来自K48-连接的双泛素结构的远端泛素分子(粉红色，pdb-id Iaar,46)叠加在来自K6-连接的双泛素的远端泛素(黄色/橙色，如A)上。IeuS通常有助于K48-连接的双泛素中Ile44补丁和大多数泛素复合结构的疏水性。K6-连接的双泛素中Leu8环的构象变化将Leu8从Ile44表面移开，以参与到K6-相互作用中的垂直Ile36表面中。E. K6-、K48-、K63-和线性双泛素结构的比较。F.由于K6-连接的双泛素的不对称界面，使得K6-接触的扩展成为可能。G. K6-连接的泛素六聚体的模建，在该六聚体中，二聚体的近端泛素部分连续叠加到远端泛素上。这表明，延长的K6-连接链可以形成具有五倍螺旋轴的螺旋丝。单个泛素分子间没有碰撞，但在泛素单元的这种排列中，可在链中中UB+2ad UB-2之间形成额外界面(在分子C:A和C:E之间为83 A2 )。图7 =DUB对(UbK6)2、(UbK29)2和(UbK63)2的活性的谱图。A. K6-连接的双泛素 (UbK6) 2针对在胶上方显示的去泛素化酶作图。10分钟和60分钟后通过SDS-PAGE分析样品。去泛素化酶家族如胶上方所示。去泛素化酶实验如前所述7。3yg双泛素和所示的去泛素化酶在30 μ L反应体系中温育。终止反应并上样到SDS-PAGE胶上以从双泛素中分离由去泛素化酶介导的切割产生的单泛素(Ub)。对于高活性的USP2、USP5和USP21DUB，每个反应使用O. 2 μ g的酶。使用O. I μ g Cezanne，其对Kll-连接的双泛素的完全水解足以(A. Bremm,数据未显示)。对于所有其他DUB，用2 μ g的酶。B和C. K29-连接的和K63-连接的双泛素各自对与K6实验中同样的去泛素化酶作图。图8 :显示位点特异性异肽键形成的GOPAL策略，例示了 K6-连接的双泛素的合成。I为N ε -(叔丁氧基擬基)-L-赖氨酸,显不为蓝色。Cbz-Osu为N-(节氧基擬基)玻珀酰亚胺，其与蛋白质中赖氨酸的N ε -胺反应产生N ε -(苄氧基羰基)-L-赖氨酸。TFA为三氟乙酸，DIEA为N，N- 二异丙基乙胺，HOSu为N-(羟基)琥珀酰亚胺，TFMSA为三氟甲磺酸。图9 Lys6-连接和Lys29_连接的泛素的合成和表征。(a)受体泛素的ESI-MS。在绿色线条中，具有通过基因工程在第6位引入的I的泛素(UbBocLyse)为“I”(所观察的质量=8，665Da，所计算的质量=8，665Da)。“ia”为Na+加合物。蓝色线条为用Cbz化学保护且选择性地去保护I中第6位的Boc保护基团后的UbBocLys6。“ii”为UbLys6 (Cbz7)，所观察的质量=9, 501. 5Da,所计算的质量=9，503Da ;“iia” 为 UbLys6 (Cbz7) +Na+ ；“iii” 为 UbLys6 (Cbz8),所观察的质量=9，636. 5Da,所计算的质量=9，637Da iiia”为 UbLys6 (Cbz8) +Na+ “ii+Boc” 和 “iii+Boc” 分别对应于其余的 UbBocLys6 (Cbz7)和UbBocLys6 (Cbz8)的线条。(b)纯化的泛素-MES硫酯(UbSR，橙色线条，“ i ” :所观察的质量=8，690Da,所计算的质量=8，689Da)。蓝色线条表示Cbz保护后的UbSR。“ i i ”为UbSR (Cbz8)，所观察的质量=9，760Da,所计算的质量=9，76IDa ; “ i i i ”为UbSR (Cbz9)，所观察的质量=9，8%0&，所计算的质量=9，8950&。(c)经纯化的Lys6_连接的双泛素(UbLys62)的ESI-MS分析表明形成了异肽键(所观察的质量=17，113Da，所计算的质量=17，112Da)。(d)纯化的Lys29-连接的双泛素(UbLys292)的ESI-MS分析。“i”为异肽键的形成(所观察的质量=17，lllDa，所计算的质量=17，112Da) ;“^”为似+、1(+加合物(所观察的质量=17，174Da，所计算的质量=17，172Da)。(e、f)胰蛋白酶酶解的MS/MS图谱证实了在纯化的Lys6和Lys29连接样品中Lys6和Lys29是异肽键形成的位点。diUb :双泛素。图10 :Lys6_连接的双泛素的结构。(a) Lys6_连接的双泛素的两个视图，远端分子用黄色表示，近端分子用橙色表示。疏水表面残基用蓝色(Ile44、Val70)和绿色(Leu8、Ile36、Leu71)表示。异肽连接是具有弹性的，而Gly76则被打乱(见补充图3a)。(b)Lys6-连接的双泛素用表面图表示。远端分子的暴露出的Ile44和Val70用蓝色表示。(c)不对称的Lys6_连接的双泛素的示意图。(d)Lys6-连接的双泛素界面的近视图。形成近端界面的残基用蓝色表示，形成远端界面的残基用绿色表示。Gln49pra和Thr9dist之间的界面氢键用灰色虚线表示。(e)来自于Lys48_连接的双泛素结构的远端泛素分子(灰色，PDB: Iaar41)叠加在Lys6_连接的双泛素的远端泛素(黄色和橙色，如在a中)上。Lys48_连接的双泛素中Ile44补丁的Leu8在Lys6-连接的双泛素中经历了构象变化以参与到Ile36表面中和 Lys6- 二聚体界面中。(f)Lys6_、Lysll-(PDB:2xewlI)、Lys48-(PDB: Iaar41)和Lys63-连接的(PDB:2jf5 ;ref. 7)双泛素和线性双泛素(PDB:2w9n7)的结构比较。近端分 子用较浅的颜色显示，Ile44、Val70和Leu8用蓝色显示。图11 :对(UbLys6)2, (UbLys29)2^P (UbLys63)2的去泛素化酶活性的谱图。每个裂解针对在胶上方显示的去泛素化酶(DUB)作图。10分钟和60分钟后通过SDS-PAGE和银染分析样品。去泛素化酶家族如所述去泛素化酶上方所示。去泛素化酶试验如补充方法中所述。整块凝胶见补充图4。图12 :通过定量蛋白质印迹测定，(UbLys29)2的TRABID特异性常数比(UbLys63)2的高40倍。(a)代表性定量蛋白质印迹。用反应中包含的Alexa-BSA的荧光对上样量进行标准化。上方的两个印迹为I. 3μ M TRABID，底部印迹为130nM TRABID。Lys29连接上
I.3μΜ TRABID的O时间点泳道来自与其他时间点相同的凝胶，但中间的无关泳道已经被去除。(b、c)用TRABID切割(证1^863)2和(UbLys29)2的至少三次独立试验的进展曲线用如在补充方法中所描述的方法拟合，以获得特异性常数。误差线代表标准偏差。补充图7中的完整凝胶。Ub，泛素。图13显示图表和照片。图14显示PylS序列的比对。图15显示PylS序列的序列同一性。图16显示PylS序列催化域的比对(从350至480 ;编号按照图14比对)。图17显示PylS序列催化域的序列同一性。图18显示基于巴氏甲烧八叠球菌(M. barkeri) PylS或马氏甲烧八叠球菌(M. mazei)PylS序列的具有移入突变的合成酶的比对。红色星号表示突变的位置。
具体实施例方式对于本发明重要的是多肽中目标赖氨酸和其它赖氨酸的保护基团不同。正是通过这些保护基团的化学差异，差异去保护化学可以通过其特异的或选择性的去保护和由此的修饰能力来特异地或选择性地修饰目标残基。
合适地，步骤(d)中期望的反应在赖氨酸残基的ε -氨基上进行。在另一个优选的实施方式中，步骤(b)中待保护的其他赖氨酸侧链也是ε -氨基。这种情况下，上述方法也适用于多肽链的末端氨基基团。在本发明的方法中，所述基因工程引入优选使用正交或扩展的遗传密码，在所述密码中，一个或多个特定的正交密码子已经分配而编码特定的赖氨酸残基，其中赖氨酸侧基团链被保护而使其能够通过使用正交tRNA合成酶/tRNA对在基因工程学上被引入。原则上，所述正交tRNA合成酶/tRNA对可以是能够响应正交密码子而使tRNA装载受保护的赖氨酸并能够将该受保护的赖氨酸引入到所述多肽链中的任何此类对。所述正交密码子可以是正交的琥拍(amber)密码子、赭石(ochre)密码子、乳白 (opal)密码子或四联体密码子。所述密码子仅需对应于用于携带受保护的赖氨酸分子的正交tRNA。优选地，所述正交密码子是琥珀密码子。应该指出的是，本文所述具体实例已经使用了琥珀密码子和相应的tRNA/tRNA合成酶。如上所述，这些是可变的。或者，为了使用其他密码子而不影响使用或选择能够与受保护的赖氨酸共同作用的可选tRNA/tRNA合成酶对，tRNA的反密码子区可简单地更换为用于所选密码子的期望反密码子区。所述反密码子区既不参与tRNA的携带或引入功能也不参与tRNA合成酶的识别，从而使这种互换完全在本领域技术人员的能力范围内。因此，如果需要，可以使用可选的正交tRNA合成酶/tRNA对。优选地，正交合成酶/tRNA对是巴氏甲烧八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)MS吡咯赖氨酸tRNA合成酶(MbPylRS)及其关连琥珀抑制tRNA (MbtRNAatt)。巴氏甲烷八叠球菌的PylT基因编码MbtRNAcm tRNA。巴氏甲烷八叠球菌的PylS基因编码MbPylRS tRNA合成酶蛋白。当使用数字编号提及特定的氨基酸残基时，所述编号采用MbPylRS (巴氏甲烷八叠球菌吡咯基-tRNA合成酶)的氨基酸序列作为参考序列(即，由可公开获得的登录号为Q46E77的野生型巴氏甲烷八叠球菌PylS基因所编码)MDKKPLDVLI SATGLWMSRT GTLHKIKHYE VSRSKIYIEM ACGDHLVVNNSRSCRTARAF RHHKYRKTCK RCRVSDEDIN NFLTRSTEGK TSVKVKVVSAPKVKKAMPKS VSRAPKPLEN PVSAKASTDT SRSVPSPAKS TPNSPVPTSAPAPSLTRSQL DRVEALLSPE DKISLNIAKP FRELESELVT RRKNDFQRLYTNDREDYLGK LERDITKFFV DRDFLEIKSP ILIPAEYVER MGINNDTELSKQIFRVDKNL CLRPMLAPTL YNYLRKLDRI LPDPIKIFEV GPCYRKESDGKEHLEEFTMV NFCQMGSGCT RENLESLIKE FLDYLEIDFE IVGDSCMVYGDTLDIMHGDL ELSSAVVGPV PLDREffGIDK PffIGAGFGLE RLLKVMHGFKNIKRASRSES YYNGISTNL.所述序列在下面称为SEQ ID NO. I。如果需要，本领域技术人员可以通过突变MbPylRS tRNA合成酶蛋白来对其进行改造，从而针对具有待使用的特定受保护侧链的赖氨酸类别进行优化。对突变的需求取决于赖氨酸残基和所用的保护/掩蔽基团(caging group)。不需要突变MbPylRS tRNA合成酶的实例是在步骤(a)所用的具有受保护侧链的赖氨酸残基是N ε -(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸的情况。可能需要突变MbPylRS tRNA合成酶的实例是在步骤(a)所用的赖氨酸侧基链被较大的化学基团如光不稳定的掩蔽基团保护的情况。
这种突变可以通过在MbPylRS tRNA合成酶的一个或多个以下位置引入突变而实现M241、A267、Y271、L274 和 C313。优选地，所述突变可以包括 M241F、A267S、Y271C 和L274M。
tRNA 合成酶本发明的tRNA合成酶可以为多种。虽然在实施例中所用的是具体的tRNA合成酶序列，但本发明不限于这些实施例。原则上，任何一个具有相同tRNA携带(氨酰化)功能的tRNA合成酶都可应用于本发明。例如，tRNA合成酶可来自诸如古细菌(archea)的任何合适的物种，如来自巴氏甲烧八叠球菌 MS、巴氏甲烧八叠球菌 str. Fusaro (Methanosarcinabarkeri str. Fusaro)、马氏甲烧八叠球菌Gol、嗜乙酸甲烧八叠球菌(Methanosarcina acetivorans) C2A、嗜热甲烧八叠球菌(Methanosarcinathermophila)或布氏拟甲烧球菌(Methanococcoidesbutonii)。或者，tRNA合成酶可来自细菌，如来自哥本哈根脱亚硫酸杆菌(Desulfitobacteriumhafniense)DCB-2、哥本哈根脱亚硫酸杆菌Y51、哥本哈根脱亚硫酸杆菌 PCPl 和醋酸氧化脱硫肠状菌(Desulfotomaculum acetoxidans) DSM 771。来自这些生物体的示范序列是公众可获得的序列。提供下面的实例作为吡咯赖氨酸tRNA合成酶的示范序列>巴氏甲烷八叠球菌MS/1-419/巴氏甲烷八叠球菌MSVERSION Q6WRH6. IGI:74501411MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIV ⑶ SCMVY ⑶ TUHMHGDLELSSAWGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>巴氏甲烷八叠球菌F/1-419/巴氏甲烧八叠球菌str. FusaroVERSION ΥΡ_304395· IGI:73668380MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKASTDTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRDFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPDPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLESLIKEFLDYLEIDFEIV ⑶ SCMVYGDTUHMHGDLELSSAWGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>马氏甲烷八叠球菌/1-454马氏甲烷八叠球菌GolVERSION ΝΡ_633469· IGI:21227547MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPI LIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL>嗜乙酸甲烷八叠球菌/1-443嗜乙酸甲烷八叠球菌C2AVERSION NP_615128. 2GI:161484944MDKKPLDTLISATGLWMSRTGMIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGERLVVNNSRSSRTARALRHH KYRKTCRHCRVSDEDINNFLTKTSEEKTTVKVKVVSAPRVRKAMPKSVARAPKPLEATAQVPLSGSKPAPATPVSAPAQAPAPSTGSASATSASAQRMANSAAAPAAPVPTSAPALTKGQLDRLEGLLSPKDEISLDSEKPFRELESELLSRRKKDLKRIYAEERENYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINSDTELSKQVFRIDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIITEFLNHLGIDFEII⑶SCMVYGNTLDVMHDDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRAARSESYYNGISTNL>嗜热甲烷八叠球菌/1-478嗜热甲烷八叠球菌，VERSIONDQ017250. IGI: 67773308MDKKPLNTLISATGLWMSRTGKLHKIRHHEVSKRKIYIEMECGERLVVNNSRSCRAARALRHHKYRKICKHCRVSDEDLNKFLTRTNEDKSNAKVTVVSAPKIRKVMPKSVARTPKPLENTAPVQTLPSESQPAPTTPISASTTAPASTSTTAPAPASTTAPAPASTTAPASASTTISTSAMPASTSAQGTTKFNYISGGFPRPIPVQASAPALTKSQIDRLQGLLSPKDEISLDSGTPFRKLESELLSRRRKDLKQIYAEEREHYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPMEYIERMGIDNDKELSKQIFRVDNNFCLRPMLAPNLYNYLRKLNRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIIKDFLDYLGIDFEIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPVPMDRDWGINKPWIGAGFGLERLLKVMHNFKNIKRASRSESYYNGISTNL>布氏拟甲烷球菌/1-416布氏拟甲烷球菌DSM 6242, VERSION YP_566710. IGI :91774018MEKQLLDVLVELNGVWLSRSGLLHGIRNFEITTKHIHIETDCGARFTVRNSRSSRSARSLRHNKYRKPCKRCRPADEQIDRFVKKTFKEKRQTVSVFSSPKKHVPKKPKVAVIKSFSISTPSPKEASVSNSIPTPSISVVKDEVKVPEVKYTPSQIERLKTLMSPDDKIPIQDELPEFKVLEKELIQRRRDDLKKMYEEDREDRLGKLERDITEFFVDRGFLEIKSPIMIPFEYIERMGIDKDDHLNKQIFRVDESMCLRPMLAPCLYNYLRKLDKVLPDPIRIFEIGPCYRKESDGSSHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENMEALIDEFLEHLGIEYEIEADNCMVYGDTIDIMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGVNKPWMGAGFGLERLLKVRHNYTNIRRASRSELYYNGINTNL>哥本哈根脱亚硫酸杆菌_DCB-2/l_279哥本哈根脱亚硫酸杆菌DCB-2VERSION YP_002461289. IGI:219670854 MSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN
>哥本哈根脱亚硫酸杆菌_Y51/1-312哥本哈根脱亚硫酸杆菌Υ51VERSION YP_521192. IGI:89897705MDRIDHTDSKFVQAGETPVLPATFMFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFffLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMK⑶LELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN>哥本哈根脱亚硫酸杆菌PCP1/1-288哥本哈根脱亚硫酸杆菌·
VERSI0NAY692340. IGI:53771772MFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEKLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLffDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIFDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN>醋酸氧化脱硫肠状菌/1-277醋酸氧化脱硫肠状菌DSM 771VERSION YP_003189614. IGI:258513392MSFLWTVSQQKRLSELNASEEEKNMSFSSTSDREAAYKRVEMRLINESKQRLNKLRHETRPAICALENRLAAALRGAGFVQVATPVILSKKLLGKMTITDEHALFSQVFWIEENKCLRPMLAPNLYYILKDLLRLWEKPVRIFEIGSCFRKESQGSNHLNEFTMLNLVEWGLPEEQRQKRISELAKLVMDETGIDEYHLEHAESVVYGETVDVMHRDIELGSGALGPHFLDGRWGVVGPWVGIGFGLERLLMVEQGGQNVRSMGKSLTYLDGVRLNI在通过突变tRNA合成酶已经提供了特定的tRNA携带(氨酰化)功能时，简单地使用另一种如选自上述中一种的野生型tRNA序列可能是不恰当的。这种情况下，重要的是保持同样的tRNA携带(氨酰化)功能。这可以通过把示范tRNA合成酶中的突变转移到如选自上述中一种的备用的tRNA合成酶骨架上来实现。通过这种方式，能将所选择的突变转移到相应的tRNA合成酶序列上，如来自示范的巴氏甲烷八叠球菌和/或马氏甲烷八叠球菌序列以外的其他生物体的相应的PylS序列。通过与已知的tRNA合成酶如示范的巴氏甲烷八叠球菌和/或马氏甲烷八叠球菌的序列比对，可能会选择目标tRNA合成酶蛋白/骨架。现通过参照pylS (吡咯赖氨酸tRNA合成酶)序列来阐述该问题，但所述原理同样适用于感兴趣的特定tRNA合成酶。例如，图14提供了所有PylS序列的比对。这些序列可能出现低的整体百分序列同一性。因此，重要的是通过例如和已知tRNA合成酶进行序列比对(而不是简单地用低的序列同一性评分)对序列进行研究，以确保所用的序列的确是tRNA合成酶。因此，合适地，当考虑序列同一性时，它被合适地认为是跨越如图14所示的tRNA合成酶。合适地，百分同一性可以如图14所定义。图15显示tRNA合成酶之间序列同一性的图。合适地，百分同一性可以如图15所定义。关注催化区域可能是有用的。图16比对的仅仅是催化区域。这样做目的是提供由其可以定义高百分同一性的tRNA催化区域，以捕获/鉴别适合接受所引入的突变的骨架，从而产生相同的tRNA携带(氨酰化)功能，例如新的或非天然的氨基酸识别。因此，合适地，当考虑序列同一性时，合适地，它被认为是跨越如图16所示的催化区域。合适地，百分同一性可以如图16所定义。图17显示了催化区域之间序列同一性的图。合适地，百分同一性可以如图17所定义。通过定点诱变编码tRNA合成酶骨架的核苷酸序列，可以将突变“转移”或“引入(植入)”到可选的tRNA合成酶骨架上。该技术在本领域里是众所熟知的。实质上，选择骨架PylS序列(例如用上面所讨论的活性位点比对)且将所选择的突变转移到(即安置在)相应的/同源位置。当使用数字地址表示特定的氨基酸残基时，除非明显，否则编号使用MbPylRS (巴氏甲烷八叠球菌吡咯赖氨酸-tRNA合成酶)的氨基酸序列作为参考序列(即由公众可获得
的登陆号为Q46E77的野生型巴氏甲烷八叠球菌PylS基因所编码)MDKKPLDVLI SATGLWMSRT GTLHKIKHYE VSRSKIYIEM ACGDHLVVNN SRSCRTARAFRHHKYRKTCK RCRVSDEDIN NFLTRSTEGK TSVKVKVVSA PKVKKAMPKS VSRAPKPLENPVSAKASTDT SRSVPSPAKS TPNSPVPTSA PAPSLTRSQL DRVEALLSPE DKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLY TNDREDYLGK LERDITKFFV DRDFLEIKSP ILIPAEYVER MGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTL YNYLRKLDRI LPDPIKIFEV GPCYRKESDG KEHLEEFTMV NFCQMGSGCTRENLESLIKE FLDYLEIDFE IVGDSCMVYG DTLDIMHGDL ELSSAVVGPV PLDREffGIDKPffIGAGFGLE RLLKVMHGFK NIKRASRSES YYNGISTNL根据本领域的广泛理解使用该序列定位感兴趣的残基。这并不总是一个严格的计数练习——必须注意背景或对齐。例如，如果感兴趣的蛋白的程度稍有不同，正确残基在对应于(例如)L266的序列中的定位可能需要将序列对齐，并挑出相当或相应的残基，而不是简单地取用感兴趣序列的第266位残基。这在本领域技术人员范围内。本文所用的突变表示法是本领域的标准。例如，L266M是指与野生型序列的第266位的L对应的氨基酸被替换为M。交替的tRNA骨架之间突变的引入现可参照示范性的巴氏甲烷八叠球菌和马氏甲烷八叠球菌的序列进行描述，但相同的原则同样适用于引入到其他骨架或从其他骨架引入。例如，Mb AcKRS是用于引入AcK的工程化的合成酶。亲本蛋白/骨架巴氏甲烷八叠球菌PylS突变L266V、L270I、Y271F、L274A、C317FMb PCKRS :用于引入PCK的工程化的合成酶。亲本蛋白/骨架巴氏甲烷八叠球菌PylS。突变M241F、A267S、Y271C、L274M。通过把这些突变引入至马氏甲烷八叠球菌PylS中能得到具有相同底物特异性的合成酶。在图18可以看出两个合成酶的序列同源性。因此，可以通过将来自Mb骨架的突变引入至Mm tRNA骨架上而产生下列合成酶
Mm AcKRS :引入突变 L301V、L305I、Y306F、L309A、C348F 至马氏甲烷八叠球菌PylS ；Mm PCKRS :引入突变 M276F、A302S、Y306C、L309M 至马氏甲烷八叠球菌 PylS。下面给出所引入突变的示范性合成酶的全长序列。>Mb_PylS/l-419MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>Mb_AcKRS/l-419MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSGEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMVAPTIFNYARKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFFQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>Mb_PCKRS/l-419MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERFGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLSPTLCNYMRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREffGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>Mm_PylS/l-454MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIV⑶SCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL>Mm_AcKRS/l-454MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPM·VAPNIFNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIV⑶SCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
>Mm_PCK RS/1-454MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERFGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLSPNLCNYMRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIV⑶SCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL同一原则同样适用于其他突变和/或其他骨架。可有利地对用这种方式产生的具有引入的多肽进行测试，以确保保留了期望的功能/底物特异性。可以将编码用于上述方法的感兴趣多肽的多核苷酸引入到重组的可复制载体中。该载体可用于在兼容的宿主细胞中复制该核酸。因此，在进一步的实施例中，本发明提供了通过将本发明的多核苷酸引入到可复制载体、将该载体引入到兼容的宿主细胞并在使载体复制的条件下培养上述宿主细胞来生产本发明的多核苷酸的方法。所述载体可从宿主细胞中回收。合适地，宿主细胞包括诸如大肠杆菌的细菌。优选地，本发明的多核苷酸在载体中与控制序列可操作地连接，所述控制序列能够使宿主细胞表达编码序列，即所述载体为表达载体。术语“可操作地连接”指的是所描述的组分处于允许其以预期的方式发挥作用的关系中。“可操作地连接”到编码序列的调节序列以在与调控序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式连接。本发明的载体可被转化或转染到所描述的合适的宿主细胞中，以表达本发明的蛋白质。该方法包括在使载体表达编码所述蛋白的编码序列的条件下培养转化有上述表达载体的宿主细胞，和任选地回收所表达的蛋白质。所述载体可以是，例如提供有复制起点、任选的用于表达所述多核苷酸的启动子和任选的所述启动子的调节子的质粒或病毒载体。所述载体可包含一个或多个选择性标记基因，例如细菌质粒情况下的氨苄青霉素抗性基因。可以使用载体以例如，转染或转化宿主细胞。可操作地连接到编码本发明的蛋白序列的序列上的调控序列包括启动子/增强子和其它表达调控信号。可选择这些调控序列以使其与经设计使表达载体用于其中的宿主细胞相容。术语“启动子”在本领域中是熟知的，包括在大小和复杂度上从最小启动子到包括上游元件和增强子的启动子的范围内的核酸区域。目标赖氨酸被保护基团保护(如所述方法的步骤(a))。所述保护基团不同于用来保护另外的赖氨酸的保护基团(如所述方法的步骤(b))。必须实施用于在所述方法的步骤(C)中选择性地从目标赖氨酸去除所述保护基团的方法，从而不使所述另外的赖氨酸同时去保护。赖氨酸侧链的化学保护剂是多种多样的，并可由本领域的技术人员根据要用的去保护方法的类型来选择。然而，适当选择所述保护剂以允许通过基因工程引入赖氨酸残基，并由此允许其通过细胞中的正交合成酶/tRNA对引入。合适地，步骤(a)中使用的保护剂如本文所述。更合适地，带有步骤(a)中使用的保护剂的赖氨酸是N ε -(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。另一个实施方式采用了受光不稳定的掩蔽基团保护的赖氨酸。这样的优点是允许光去掩蔽(去保护)，这比化学去保护更容易。所述另外的赖氨酸残基和任意的N-末端氨基使其侧链受到保护，从而允许目标赖氨酸的特异性修饰。有利地，这可以通过使用如下反应而实现在所述反应中保护基团可达到或至少接近所述多肽链中存在的所述另外的赖氨酸残基的饱和(100% )。使用容易变性和复性且不失去其特性的多肽作为蛋白质是有利的。因此，如果本发明的多肽是一个小蛋白，可能是有利的。还有利的是，所述多肽很少或没有翻译后修饰，如糖基化。进行修饰的示范性多肽包括组蛋白和/或小的转录因子。合适地，进行修饰的多肽不太大。合适地，不太大是指不超过几百个氨基酸的长度，合适地，400个氨基酸或更少，更合适地，约300个氨基酸或更少。多结构域蛋白因为影响与其他结构域(如多蛋白复合物的其他成员)相互作用的机会增加而较少用于缺乏。合适地，所用的保护基团可以如本文所述。更合适地，保护剂是N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)。合适，其可以在碱性DMSO中使用。 可选的或额外的保护基团和它们的操作(如它们的添加/删除的化学)描述如下。BocLys 描述在“Genetic incorporation of N ε - (t-butyloxycarbonyl)-L-Iysine (BocLys) 〃 (YANAGISAWAj Τ·，ISHIIj R.，FUKUNAGA, R.，K0BAYASHI，Τ·，SAKAMOTO, K. &Υ0Κ0ΥAM，S. (2008)Multistep engineering ofpyrrolysyl-tRNA synthetase to geneticallyencodeN(epsilon)-(o~az idobenzyloxycarbonyI)lysine for site-specificproteinmodification. Chem Biol,15，1187-97)。去(off)-三氟乙酸(TFA)
OI
义 Jkr 「 X
HNHN
/ V.
ο能被温和地连接到蛋白质胺上的正交保护基团，其中
XI.苄氧基羰基(Cbz或Ζ)连接(on) -N-(苄氧基羰基氧基)-琥珀酰亚胺(KAWAKAMI, T.，HASEGAWA, K.，TERUYA, K.，AKAJI, K.，H0RIUCHI, M.，INAGAK
I,F. , KURIHARA, Y. , UESUGI, S. &ΑΙΜ0Τ0, S. (2001) Polypeptide synthesis usingan expressed peptide as a building block forcondensation with a peptidethioester!application to the synthesis ofphosphorylated p2IMax protein(1-101) ·J Pept Sci,7，474-87)
去-HF/DMS,TFMSA/TFA/DMS,催化氢化(TAM, J. , HEATH, ff. &MERRIFIELD, R. (1983) SN2DEPR0TECTI0N0F SYNTHETICPEPTIDES WITH A LOW CONCENTRATION OF HF INDIMETHYL SULFIDE-EVIDENCE ANDAPPLICATION INPEPTIDE-SYNTHESIS. Journal of the American Chemical Society,105，6442-6455)(TAM, J. P. , HEATH, ff. F. &MERRIFIELD, R. B. (1986) Mechanisms forthe removal ofbenzyl protecting groups in synthetic peptides bytrifluoromethanesulfonic acidtrifluoroacetic-acid dimethyl sulfide. Journal of theAmerican Chemical Society,108，5242-5251)有机合成中的Greene保护基团
权利要求
1.修饰包含至少两个赖氨酸残基的多肽中特定赖氨酸残基的方法，所述方法包括 (a)提供一种多肽，所述多肽包含受第一保护基团保护的目标赖氨酸残基和至少一个另外的赖氨酸残基； (b)处理所述多肽以保护所述另外的赖氨酸残基，其中，所述另外的赖氨酸残基的保护基团与所述目标赖氨酸残基的保护基团不同； (C)选择性地去保护所述目标赖氨酸残基；和 (d)修饰(c)中所述的去保护了的赖氨酸残基。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述多肽的产生包括 (i)提供编码所述多肽的核酸，其中所述核酸包含编码所述目标赖氨酸的正交密码子; ( )在正交tRNA合成酶/tRNA对存在下翻译所述核酸，其中所述正交tRNA合成酶/tRNA对能够识别所述正交密码子并将受第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基引入至所述多肽链中。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述正交密码子包括TAG，所述tRNA包括MbtRNACUA，所述tRNA合成酶包括MbPylRS。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，受第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基是N ε -(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述另外的赖氨酸残基的保护基团是N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)。
6.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，步骤(b)包括在碱性DMSO中用N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)处理所述多肽。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，步骤(c)包括用含三氟乙酸(TFA)的水处理所述多肽。
8.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，步骤(d)的修饰包括 (i)通过在Ag (I)存在下转换成N-羟基琥珀酰亚胺酯而活化硫酯； ( )添加将与所述目标赖氨酸连接的多肽；和 (iii)温育以形成特异的异肽键。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，步骤(d)的修饰在所述目标赖氨酸残基的ε-氨基基团上进行。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，在步骤(d)中对所述目标赖氨酸进行多个修饰。
11.如前述任一项权利要求所述的方法，进一步包括使所述另外的赖氨酸残基去保护的步骤(e)。
12.如权利要求11所述的方法，其中，步骤(e)包括用比例为1:3:6的三氟甲磺酸(TFMSA):三氟乙酸(TFA) : 二甲基硫醚(DMS)的混合物处理所述多肽。
如权利要求I所述的方法，其中，步骤(a)包括通过在所述多肽的翻译过程中通过基因工程方式向所述多肽链中引入受第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基而产生所述多肽。
13.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述多肽为泛素。
14.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，步骤(d)的修饰是另外的多肽链与所述目标赖氨酸的共价连接。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述另外的多肽链为泛素。
16.如权利要求10所述的方法，其中，重复步骤(c)-(d)以生产由通过赖氨酸残基的共价连接而连接的多肽链。
17.如前述任一项权利要求生产的多肽。
18.如权利要求17所述的多肽，其包括K-连接的泛素链。
19.如权利要求18的多肽，其中，所述K-连接是K6或K29连接。
20.TRABID作为K29去泛素化酶的应用。
21.切割K29连接的泛素的方法，所述方法包括使K29连接的泛素与TRABID接触。
全文摘要
本发明涉及修饰包含至少两个赖氨酸残基的多肽中特定的赖氨酸残基的方法，所述方法包括(a)提供包含受第一保护基团保护的目标赖氨酸和至少一个另外的赖氨酸残基的多肽；(b)处理所述多肽以保护所述另外的赖氨酸残基，其中，所述另外的赖氨酸残基的保护基团与目标赖氨酸残基的保护基团不同；(c)选择性地去保护目标赖氨酸残基；和(d)修饰(c)中去保护了的赖氨酸残基。
文档编号C07K14/00GK102939302SQ201180025551
公开日2013年2月20日 申请日期2011年3月23日 优先权日2010年3月24日
发明者贾森·钦, 维·P·阮, 萨特帕尔·维尔德 申请人:医药研究委员会