专利名称：利用抗体使人类红细胞功能化的方法
技术领域：
本发明涉及用于利用抗体使人类红细胞(red blood cell, RBC)功能化的方法和装置，并且在固相抗体筛查测定法的背景中是相关的。本发明制备出功能化更密集的指示细胞，通过靶向具有比常用的D抗原的表达程度更高的A、B、AB和丽S抗原，可以使用所述指示细胞与其他组分一起来检测抗体或抗原的存在或不存在。而且，本发明可以延及希望检测特异性结合的免疫球蛋白的任意免疫测定。
背景技术：
常规的固相抗体筛查测定法通过借助于粘附或凝聚至特异性地结合到例如固相上的免疫球蛋白的抗-IgG包被红细胞来检测IgG抗体。例如参见授予Sinor等的美国专利 4，816，413。常规的固相抗体筛查测定法通常借助于使用单克隆或多克隆抗-D抗体11初敏人类红细胞10(0+血型)而产生的指示剂。如果D抗原12存在于红细胞10上，则由于红细胞10的敏化发生而使用D抗原12。然后将IgG敏化细胞暴露于抗-IgG，使得细胞10呈抗-IgG包被。通常使用D抗原12的原因是高亲和抗-D抗体11的可用性。但是，D抗原12的表达不高(10，000至30，000抗原12/细胞10)。在固相几何学中，细胞10和平坦表面之间的相互作用区域可能会限制相互作用的区域，使得只有10至100个抗-IgG分子与底物相互作用。这种限制可能会强烈影响这些指示细胞与固相的结合的动力学和量级。因此，需要制备可以用来检测抗体或抗原存在或不存在的功能化更密集的指示细胞的方法和装置。
发明内容
本发明涉及功能化更密集的指示细胞的制备，所述指示细胞可以通过利用表达程度比D抗原更高的A、B、AB和MNS抗原而被用来检测抗体或抗原的存在或不存在。这些抗原系统具有接近100万抗原/细胞的表达水平，这与10，000至30，000抗原/细胞的常规D抗原位点形成非常鲜明的对比。抗原系统表达水平的这种显著增加是出乎预料的，在指示细胞和固相的结合的动力学和量级中能够形成加强(boost)，这影响测定法的效率(例如灵敏性、检测时间等)。在本发明的一个例示性实施方式中，可以使用柱亲和纯化法(即免疫亲和纯化法)来纯化(具有高的亲和性和浓度的)抗-A抗体。在该实施方式中，将带有胺柄(aminehandle)的合成A抗原包被在可商购获得的亲和柱上。然后将来自具有血型B的人类供体的源血浆暴露于所述亲和柱，其中抗-A抗体附接在固体支持物上的A抗原上。然后从亲和柱上将抗-A抗体洗脱，并且可以再通过已知的沉淀或亲和技术进一步纯化抗-A抗体。然后将(具有A抗原的)血型A红细胞暴露于这种纯化产物(即IgG)，并且该纯化的抗-AIgG抗体结合至红细胞并且包被红细胞。由于抗-IgG抗体对IgG抗体具有特异性，因此它们附接至IgG抗体(部分或全部包被它们)。于是制得功能化更密集的指示细胞，通过利用A、B、AB和MNS抗原，可以使用该指示细胞与其他组分一起来检测抗体或抗原的存在或不存在。在本发明的另一个例示性实施方式中，由于人类红细胞具有众多的抗原系统，因此可以同时靶向多个抗原系统以增加IgG包层的密度。在另一个例示性实施方式中，本发明降低了对洗涤循环的约束。为了确保抗-IgG抗体不被残留IgG抗体所饱和，选择高表达的抗原系统，使得即使一定量的抗-IgG被饱和(并且因此使得其不具有活性)，仍保留足够数量的抗-IgG，从而可以检测特异性结合。在另一个例示性实施方式中，将血浆、蛋白等导入到固相系统，并在37°C温育。使用带有已知抗原谱系的人类红细胞包被固相底物。对存在于固相上的抗原中的一种抗原(例如Kell血型的K抗原)具有特异性的存在于检测血浆中的抗体(在该情况中为IgG类)将变得特异性地结合至底物上的红细胞。然后使用溶液洗涤该系统以移除未结合的蛋白。导入具有很多结合位点的指示红细胞(上面包被有抗-IgG抗体的探针红细胞)，并且抗-IgG抗体(预包被在指示剂上或者只是添加有IgG包被指示剂)结合至底物上的红细胞上的IgG。本发明还可以在溶液中使用，其中寻查凝集以确定是否存在结合。至此，概述了根据本发明的一些特征，以便可以更好地理解本发明随后的具体实 施方式，以及以便更好地认识到本发明对现有技术的贡献。当然，还有将在下文进行说明的并且将形成本发明所附权利要求书的主题的根据本发明的其他特征。在这一方面，在详细解释根据本发明的至少一个实施方式之前要理解的是，本发明不限于其在下文描述给出的或者在附图中示出的构成细节和组分配置中的应用。符合本发明的方法和装置能够成为其他实施方式，并且以各种方式实践和实施。同样要理解的是，本文中使用的措辞和术语以及所包括的摘要仅出于说明目的，不应被看作是对本发明的限制。同样，本领域的技术人员应当理解的是，本公开内容所根据的构想可以容易被用作设计用于实现本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此重要的是，权利要求书应当被看作包括这种等同结构，只要它们不偏离根据本发明的方法和装置的实质和范围。
图Ia显示一种常规方法，其中，抗原系统使用D抗原。图Ib显示根据本发明的一个实施方式，其中，抗原系统使用A、B、AB和MNS抗原。图2(a)至(e)显示根据本发明的一个实施方式，其中，在从血浆中纯化抗体时使用免疫亲和色谱法。该方法使用A、B、AB和MNS抗原。图3(a)至(C)显示根据本发明的另一个实施方式，其中，将血浆、蛋白等导入固相系统，并使用带有已知抗原谱系的人类红细胞包被底物。带有抗-IgG抗体的指示红细胞结合至底物上的红细胞上的IgG。
具体实施例方式在本发明中，本发明人着眼于存在高表达水平的抗原系统，以制备功能化更密集的指示细胞，所述指示细胞能够用于指示特定抗体或抗原的存在或不存在，这是因为使用具有显著高于常用的抗原D的表达程度的A、B、AB和MNS抗原的缘故。本发明的这种抗原系统可以包括A、B、AB抗原或丽S抗原。如本领域的技术人员应当知道的，ABO血型系统是最重要的人类血型系统，并且包括血型A、B、AB和O。ABO抗原在主要附接于条带3蛋白上的聚乳糖胺(polyactosamine)长链的末端上表达,红细胞(RBC)膜的阴离子交换器和少量的表位表达在中性鞘糖脂上。
MNS抗原系统是基于染色体4上的血型糖蛋白A和B基因的人类血型系统。46个抗原中最重要的是M、N、S、s和U抗原。本发明的抗原系统(其中例如有对抗-A 13等抗体具有高亲和力(见图Ib))具有接近100万抗原/红细胞10的显著表达水平(具有将IgG位点的数量提高100倍的潜力)。因此，约100万抗原14的A抗原位点/红细胞10与约10，000至30，000抗原12的常规D抗原位点/细胞10形成鲜明的对比(见图Ia)。抗原系统表达水平中的这种显著增加在指示细胞和固相的结合的动力学和量级上可以形成加强，这能够改善测定法的效率。在本发明的一个例示性实施方式中，(具有高亲和力和浓度的)抗-A抗体可以如图2所示使用柱亲和纯化法(即，免疫亲和色谱法)进行纯化。在免疫亲和色谱法中，可以通过柱色谱法实现与固相的结合，由此将固体介质填充至柱15，使初始混合物16通过柱15以允许固定(图2(a))，使洗涤缓冲液17通过柱15(图2(b))，并且随后使洗脱缓冲液18施加至柱15(图2(c))并收集。这些步骤通常在常压下进行。在该程序中，从人类血液16对抗体19进行的亲和纯化例如使用获自血型B的供体的人类血浆16 (B卩，天然存在的抗体)进行(见图2(a))。因此，如果已知人类血浆16含有抗特异性抗原20的抗体19，那么就可以使用亲和纯化法进行纯化。与目标物19的特异性相对应的抗原然后可以共价地偶联至固体支持物(例如琼脂糖)并在从人类血浆16纯化抗体19时用作亲和配体。碳水化合物(即A抗原)与柱子的亲和分离/偶合公开在例如《蛋白质纯化》(Protein Purification, Robert K. Scopes,第 3 版，Springer, NY, NY1993) ”和《生物偶合技术》(Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson,第 2 版，Elsevier, NY,NY 20008)，在此通过参考方式引入。在本发明的该例示性实施方式中，在步骤100，带有胺柄的合成A抗原20偶合至可商业购得的亲和柱15。亲和柱15使用相关A抗原20包被。在步骤101 (见图2 (a))，随后将来自具有血型B的人类供体的源血浆16的粗制产物暴露于亲和柱15，其中抗-A抗体19附接至固体支持物上的A抗原20。在步骤102，然后通过已知的沉淀或亲和技术(如在Rbert K. Scopes (见上文)的《蛋白质纯化》所公开的技术)纯化抗-A抗体19，以移出目标抗体19。这些技术包括洗涤17(见图2(b))，使用低pH缓冲液18 (例如甘氨酸pH 2.8)洗脱目标抗体19 (见图2(c))。将洗脱液收集到中性Tris或磷酸盐缓冲液中以中和低pH洗脱缓冲液并使抗体19的活性的任何劣化停止。该程序从人类血浆16中移除不需要的抗体19，并纯化目标抗体19。可以使用如上所述同样的技术进一步将抗-A抗体19分离至IgG或IgM抗体21 (例如，蛋白G柱可以选择性地结合IgG但是不结合IgM)。于是，在步骤103中，将血型A红细胞10 (具有A抗原20)然后暴露于这种纯化产物(即，IgG抗体21)(见图2(d))，并使IgG抗体21的纯化产物结合并包被红细胞10。在步骤104，然后根据已知的方法(例如在Sinor等的文章中所述的方法)洗涤被包被的细胞10。
在步骤105中，然后将细胞10暴露于抗-IgG抗体22。由于抗-IgG抗体22对IgG抗体21具有特异性，它们附接至IgG抗体21，从而包被指示细胞23 (见图2(e))。该步骤可以在使用之前(即，在使用抗-IgG预敏化IgG包被红细胞)或使用过程中(简单地将IgG包被指示剂与抗-IgG混合)进行。至此，本发明公开了一种新型的预料不到的程序，该程序将制得功能化更密集的指示细胞23，通过利用表达程度高于D抗原的A、B、AB和MNS抗原，可以使用该指示细胞与其他组分一起来检测抗体或抗原的存在或不存在。在根据本发明的另一个例示性实施方式中，由于人类红细胞具有众多的抗原系统，因此可以同时靶向多个抗原系统以增加例如IgG抗体包层的密度。例如，可以选择表达Rh、Kell和Duffy抗原的红细胞并将这些红细胞暴露于对这些血型具有特异性的抗体共混物。因此，通过同时靶向多种血型，可以获得更高的包层密度。本发明的技术还可以降低对洗涤循环的约束。依赖于类型特异性免疫球蛋白(即，抗-IgG抗体)的很多常规测定法要求从系统中移除未结合的抗体19(例如参见图2(b)) 0如果不是这样，抗-IgG抗体22 (见图2 (e))将为“一般”的IgG抗体21所饱和，并且将检测不到特异性结合。这种影响通过使用不含有游离IgG抗体21的溶液洗涤该系统来预防。然而，如果需要超低水平的残留IgG抗体21，这样的洗涤工序可能有点苛刻，因此重要的是要确保抗-IgG抗体22没有被残留IgG抗体21所饱和。这可以通过选择高表达的抗原系统来实现，使得即使一定量的抗-IgG抗体22被饱和(并且因此使得其不具有活性)，仍保留足够数量的抗-IgG抗体22，从而可以检测到特异性结合。在根据本发明的另一个例示性实施方式中，图3(a)在步骤200显示其中将血浆、蛋白等24导入到固相系统，并在37°C温育。使用带有已知抗原谱系的人类红细胞10包被底物25。在步骤201中，需要的特异性抗体21变得特异性地结合至底物25上的红细胞10 (即，Kell系统的K抗原)。在步骤202中，使用溶液26 (例如盐水)洗涤该系统以移除未结合的蛋白。由于血浆24含有大量不同类型的抗体，因此重要的是要具有良好的洗涤步骤以移除在该系统中仍然游离的任何残留的IgG抗体21。在步骤203(请参见图3(c))，向该系统导入具有很多结合位点的指示红细胞23 (上面包被有抗-IgG抗体22的探针红细胞10，由如上所述方法制得)，并且抗-IgG抗体22结合至底物25上的红细胞10上的抗-IgG抗体21。如上所述，如果在该系统中有太多来自血浆24的IgG抗体21，探针红细胞23将被包被并妨碍在底物25处的结合；因此重要的是，要仔细洗涤该系统并且使用带有很多结合位点的探针指示细胞23。本发明还可以在溶液中使用，其中在固相上寻查凝集以确定是否存在结合。应当强调的是，本发明的上述实施方式只是为清楚理解本发明的原理而给出的可行实施例。可以在未偏离本发明的实质和原理的情况下对本发明的上述实施方式进行改变和改进。所有这些改进和改变拟包括在本发明的范围内并通过随后的权利要求书加以保护。·
权利要求
1.一种在固相抗体筛查测定法中纯化抗体以制备密集功能化的指示细胞的方法，所述指示细胞可以用作指示抗体或抗原存在或不存在的测定法的组分，所述方法包括 将预定抗原包被至亲和柱，所述预定抗原为A抗原、B抗原、AB抗原和MNS抗原中的一种抗原； 将人类血浆导入所述亲和柱，使得布置在所述人类血浆中的抗体附接至所述预定抗原； 使用免疫亲和色谱法纯化所述抗体，使得经纯化的所述抗体得以保留而其它不需要的抗体被移除； 将经纯化的所述抗体暴露于红细胞，使得经纯化的所述抗体与所述红细胞结合并包被所述红细胞；和 通过将被包被的所述红细胞暴露于对经纯化的所述抗体具有特异性的另外抗体，使得所述另外抗体附接至经纯化的所述抗体并包被所述红细胞。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述预定抗原是A抗原，并且所述抗体是抗-A抗体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法进一步包括 使用免疫亲和色谱纯化法将所述抗-A抗体分离为IgG抗体或IgM抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述纯化产物是IgG抗体，并且所述另外抗体是抗-IgG抗体。
5.根据权利要求I所述的方法，其中，所述方法进一步包括 在将被包被的所述细胞暴露于所述另外抗体之前洗涤被包被的所述细胞。
6.根据权利要求I所述的方法，其中，所述纯化步骤包括 洗涤所述人类血浆；和 使用缓冲液洗脱所述预定抗体。
7.根据权利要求I所述的方法，其中，在所述亲和柱中使用多于一种抗原以提高包被在所述红细胞上的所述抗体的密度。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述多于一种抗原包括Rh抗原、Kell抗原、Kidd抗原和Duffy抗原。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述洗涤包括不含有游离的预定抗体的溶液。
10.根据权利要求I所述的方法，其中，所述方法进一步包括 将至少血浆和蛋白导入具有底物的固相系统，使得所述预定抗体结合至所述底物上的所述红细胞，所述底物由具有预定抗原谱系的红细胞包被； 使用缓冲溶液洗涤所述系统以移除未结合的蛋白和残留的预定抗体；和导入上面包被有所述另外抗体的所述指示细胞，使得所述另外抗体与结合在所述底物上的所述红细胞上的所述预定抗体结合。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述方法进一步包括 在37°C温育被导入到所述固相系统中的所述至少血浆和蛋白。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，包被在所述指示细胞上的所述另外抗体是抗-IgG抗体,并且所述预定抗体是IgG抗体,并且所述抗-IgG抗体结合至所述IgG抗体。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，寻查凝集以确定什么时间有结合。
14.根据权利要求I所述的方法，其中，所述预定抗原的表达水平为10，OOO抗原/红细胞至30,000抗原/红细胞。
全文摘要
本发明涉及功能化更密集的指示细胞的制备，通过使用具有比常规D抗原更高的表达程度的A、B、AB和MNS抗原来标记带有IgG的指示细胞，可以使用所述指示细胞与其他组分一起来检测抗体或抗原的存在或不存在。本发明抗原系统具有接近100万抗原/细胞的表达水平，这与约10,000至30,000抗原/细胞的常规D抗原位点形成鲜明的对照。抗原系统表达水平中的这种显著增加在指示细胞和固相的结合的动力学和量级中能够形成加强，这改善了测定法的效率。
文档编号C07K1/00GK102892774SQ201180024683
公开日2013年1月23日 申请日期2011年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者克里斯托弗·克努特松, 德里克·戴维·多尔内维尔德 申请人:阿尔利克斯公司