方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于修饰模板双链多核巧酸的方法，尤其设及一种使用纳米孔测 序进行表征的方法。所述方法从多个修饰的双链多核巧酸模板化而产生。运些修饰的多核 巧酸可W随后被表征。
【背景技术】
[0002] 许多商业情况需要制备核酸文库。运通常使用转座酶而实现。根据制备该文库所 使用的转座酶，在该文库可能需要在使用前，如在测序使用中前，在体外对易位事件 (transposition events)进行修复。
[0003] 目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核巧酸(如DNA或RNA)测序 和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，运主要由于它们依赖于扩增技术W产生大量 的多核巧酸，且需要大量特定的用于信号检测的巧光化学物质。
[0004] 跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很 大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的DNA测序技术的纳米孔得到了许多关注。
[0005] 当跨纳米孔施加电势时，在特定的时间段内，当分析物如核巧酸片刻停留在桶 (barrel)中时，会产生电流的变化。所述核巧酸的纳米孔检测能产生已知特征和持续时间 的电流变化。在链测序方法中，单个多核巧酸链穿过所述孔并能实现对核巧酸的鉴定。链测 序可包括使用多核巧酸结合蛋白，W控制所述多核巧酸穿过所述孔的移动。
【发明内容】
[0006] 本发明已令人惊讶地表明可W修饰模板双链多核巧酸W产生多个较短且修饰的 双链多核巧酸。所述双链多核巧酸可包括，例如，发夹环或单链前导序列。运些修饰可W被 设计，使得修饰的双链多核巧酸各自比原来的模板多核巧酸更易于表征，例如通过链测序。 所述修饰的多核巧酸的随后的表征允许模板多核巧酸的特点更容易被确定。
[0007] 在一个实施例中，修饰方法使用MUA转座酶和MuA底物组，每个底物包含通用核巧 酸突出。通用核巧酸是与模板多核巧酸中的所有核巧酸都有一定程度杂交的核巧酸。MuA转 座酶能够将模板多核巧酸片段化且产生在两端具有突出的片段。MUA转座酶还能够将所述 底物连接到所述双链片段的一端或两端的突出。不具有突出的底物的链通常被连接到具有 突出的片段的链。运使得在得到的双链构建体中有单链缺口。令人惊奇的是，含有通用核巧 酸的底物中的突出能够杂交到所述片段的链中的突出（底物中没有突出的反义链连接其 上），并通过转座酶的作用闭合留下的缺口（见图1)。将所述突出连接到所述片段中相邻的 链，产生了修饰的双链多核巧酸。
[000引因此，本发明提供了用于修饰模板双链多核巧酸的方法，包括：
[0009] (a)将模板多核巧酸与MuA转座酶和双链MuA底物组接触，每个所述底物含有至少 一个通用核巧酸突出，使得所述转座酶将所述模板多核巧酸片段化并将底物连接到双链片 段的一端或两端，并由此制备多个片段/底物构建体;W及
[0010] (b)将所述突出连接到所述构建体中的所述片段，并由此制备多个修饰的双链多 核巧酸。在另一个实施例中，该修饰方法使用MuA转座酶和MuA转座酶底物组，每个底物包括 至少一个突出W及与所述突出在相同的链中的至少一个核巧酸，所述核巧酸包含在所述模 板多核巧酸中不存在的核巧酸。所述MuA转座酶能够将所述模板多核巧酸片段化。还能够将 底物连接到双链片段的一端或两端。使用所述至少一个核巧酸将所述突出从连接的构建体 中特定的除去，所述至少一个核巧酸包含在模板多核巧酸中不存在的核巧酸。运在双链片 段中留下了缺口，且修复运些缺口提供了多个修饰的双链多核巧酸。
[0011] 因此，本发明还提供了用于修饰模板双链多核巧酸的方法，包括：
[0012] (a)将模板多核巧酸与MuA转座酶和双链MuA底物组接触，每个所述底物包含（i)至 少一个突出W及（ii)与所述至少一个突出在相同的链中的至少一个核巧酸，所述至少一个 核巧酸包含在所述模板多核巧酸中不存在的核巧酸，使得所述转座酶将所述模板多核巧酸 片段化并将底物连接到双链片段的一端或两端，并由此制备多个片段/底物构建体；
[0013] (b)通过选择性地除去所述至少一个核巧酸将所述突出从所述构建体中除去，并 由此制备多个包含单链缺口的双链构建体;W及
[0014] (C)修复在所述构建体中所述单链缺口，并由此制备多个修饰的双链多核巧酸。 [001引本发明还提供：
[0016] -使用本发明方法修饰的多个多核巧酸。
[0017] -用于修饰模板多核巧酸的双链多核巧酸底物组，其中所述底物如上文所定义：
[0018] --种表征使用本发明的方法修饰的至少一个多核巧酸的方法，包括a)将所述修 饰的多核巧酸与跨膜孔接触，使得所述多核巧酸的至少一条链移动穿过所述孔；W及b)随 着所述至少一条链相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述 至少一条链的一个或多个特征，并由此表征所述修饰的多核巧酸。
[0019] --种表征模板多核巧酸的方法，包括a)使用本发明的方法修饰所述模板多核巧 酸，W产生多个修饰的多核巧酸;b)将每个修饰的多核巧酸与跨膜孔接触，使得每个多核巧 酸的至少一条链移动穿过所述孔；W及C)随着每个多核巧酸的至少一条链相对于所述孔移 动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表每个多核巧酸的至少一条链的一个或多 个特征，并由此表征所述模板多核巧酸。
[0020] --种用于修饰模板多核巧酸的试剂盒，包含(a)如上定义的MuA底物组W及(b) MuA转座酶。
【附图说明】
[0021] 图1示出了修饰模板双链多核巧酸的链(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a) 的链与MuA转座酶(b)和双链MuA底物组（C)接触。双链MuA底物每个含有5/憐酸（标记为圆 圈）和五个通用核巧酸(标记为矩形KMuA转座酶将模板双链多核巧酸片段化，并在片段化 的位点的每一侧插入MuA底物(步骤1)。在片段化的双链构建体中留下的缺口随后使用DNA 连接酶(d)修复，该连接酶将含有通用核巧酸的链连接到双链构建体(步骤2)。
[0022] 图2示出了修饰模板双链多核巧酸的链(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a) 的链与MuA转座酶(b)和双链发夹形MuA底物组(C)接触。发夹形MuA底物每个含有5/憐酸(标 记为圆圈）和五个通用核巧酸(标记为矩形KMuA转座酶将模板双链多核巧酸片段化，并在 片段化的位点的每一侧插入MuA底物(步骤I)。在片段化的双链构建体中留下的缺口随后使 用DNA连接酶(d)修复，该连接酶将含有通用核巧酸的链连接到双链构建体(步骤2)。
[0023] 图3示出了修饰模板双链多核巧酸的链(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a) 的链与MuA转座酶(b)和Y-形MuA底物组（C)接触。Y-形MuA底物每个含有5/憐酸（标记为圆 圈）和五个通用核巧酸(标记为矩形KMuA转座酶将模板双链多核巧酸片段化，并在片段化 的位点的每一侧插入Y-形MuA底物(步骤1)。在片段化的双链构建体中留下的缺口随后使用 DNA连接酶(d)修复，该连接酶将含有通用核巧酸的链连接到双链构建体(步骤2)。
[0024] 图4示出了修饰模板双链多核巧酸的链(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a) 的链与MuA转座酶(b )、双链发夹形MuA底物(d )、Y-形MuA底物(C)的组接触。两种MuA底物每 个含有5/憐酸(标记为圆圈）和五个通用核巧酸(标记为矩形KMuA转座酶将模板双链多核 巧酸片段化，并在片段化的位点的每一侧插入MuA底物(步骤1)。在片段化的双链构建体中 留下的缺口随后使用DNA连接酶(e)修复，该连接酶将含有通用核巧酸的链连接到双链构建 体(步骤2)。
[0025] 图5示出了修饰模板双链多核巧酸的链(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a) 的链与MuA转座酶(b )、双链发夹形MuA底物(d )、Y-形MuA底物(C)的组接触。两种MuA底物每 个含有5/憐酸(标记为圆圈）和五个通用核巧酸(标记为矩形KMuA转座酶将模板双链多核 巧酸片段化，并在片段化的位点的每一侧插入MuA底物(步骤1)。在片段化的双链构建体中 留下的缺口随后使用DNA连接酶(e)修复，该连接酶将含有通用核巧酸的链连接到双链构建 体(步骤2)。
[0026] 图6示出了修饰模板双链多核巧酸(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a)的链 与MuA转座酶(b )、双链发夹形MuA底物组(d )、Y-形MuA底物(C)的组接触。Y-形MuA底物具有 附加的POlyT前导序列(标记为不连续的波浪线）。两种MuA底物每个含有5/憐酸(标记为圆 圈）和五个通用核巧酸(标记为矩形KMuA转座酶将模板双链多核巧酸片段化，并在片段化 的位点的每一侧插入MuA底物(步骤1)。在片段化的双链构建体中留下的缺口随后使用DNA 连接酶(e)修复，该连接酶将含有通用核巧酸的链连接到双链构建体(步骤2)。
[0027] 图7示出了修饰模板双链多核巧酸(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a)的链 与MuA转座酶(b)和双链MuA底物组(C)的组接触。发夹环MuA底物每个含有5/憐酸(标记为圆 圈）和五个通用核巧酸(标记为矩形KMuA转座酶将模板双链多核巧酸片段化，并在片段化 的位点的每一侧插入MuA底物(步骤1)。在片段化的双链构建体中留下的缺口随后使用DNA 连接酶(d)修复，该连接酶将含有通用核巧酸的链连接到双链构建体(步骤2)。
[0028] 图8示出了修饰模板双链多核巧酸(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a)的链 与MuA转座酶(b)和双链MuA底物组(C)接触。双链MuA底物含有标记为S角形的在模板多核 巧酸中不存在的单核巧酸。MuA转座酶将模板双链多核巧酸片段化，并在片段化的位点的每 一侧插入MuA底物(步骤1)。尿喀晚特异性切除试剂化racU-specific Excision Reagent) (USER?)在模板多核巧酸中不存在的该单核巧酸的位置(=角形)产生单核巧酸缺口，使得 含有在模板多核巧酸中不存在的该单核巧酸的DNA片段被除去(步骤2)。留在片段化的双链 构建体中的单链DNA缺口随后使用DNA聚合酶(e)修复，其用合适的互补核巧酸填充了该缺 口，且DNA连接酶(f)将新合成的链连接到含有单一缺口的双链构建体(步骤3)。
[0029] 图9示出了修饰模板双链多核巧酸(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a)的链 与MuA转座酶(b)和双链发夹形MuA底物组(C)接触。双链发夹形MuA底物含有标记为S角形 的在模板多核巧酸中不存在的单核巧酸。MuA转座酶将模板双链多核巧酸片段化，并在片段 化的位点的每一侧插入MuA底物(步骤1)。尿喀晚特异性切除试剂化SER?)在模板多核巧酸 中不存在的该单核巧酸的位置(=角形)产生单核巧酸缺口，使得含有在模板多核巧酸中不 存在的该单核巧酸的DNA片段被除去（步骤2)。留在片段化的双链构建体中的单链DNA缺口 随后使用DNA聚合酶(e)修复，其用合适的互补核巧酸填充该缺口，且DNA连接酶(f)将新合 成的链连接到含有单一缺口的双链构建体(步骤3)。
[0030] 图10示出了修饰模板双链多核巧酸(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a)的链 与MuA转座酶(b)和Y-形MuA底物组(C)接触。Y-形MuA底物含有标记为S角形的在模板多核 巧酸中不存在的单核巧酸。MuA转座酶将模板双链多核巧酸片段化，并在片段化的位点的每 一侧插入Y-形MuA底物(步骤1)。尿喀晚特异性切除试剂化SER?)在模板多核巧酸中不存在 的该单核巧酸的位置(=角形)产生单核巧酸缺口，使得含有在模板多核巧酸中不存在的该 单核巧酸的DNA片段被除去（步骤2)。留在片段化的双链构建体中的单链DNA缺口随后使用 DNA聚合酶(e)修复，其用合适的互补核巧酸填充了该缺口，且DNA连接酶(f)将新合成的链 连接到含有单一缺口的双链构建体(步骤3)。
[0031] 图11示出了修饰模板双链多核巧酸(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a)的链 与MuA转座酶(b )、双链发夹形MuA底物(d )、Y-形MuA底物(C)的组接触。两种MuA底物含有标 记为S角形的在模板多核巧酸中不存在的单核巧酸。MuA转座酶将模板双链多核巧酸片段 化，并在片段化的位点的每一侧插入MuA底物(步骤1)。尿喀晚特异性切除试剂化SER?)在模 板多核巧酸中不存在的任何单核巧酸的位置(=角形)产生单核巧酸缺口，使得含有在模板 多核巧酸中不存在的该单核巧酸的DNA片段(e)被除去(步骤2)。留在片段化的双链构建体 中的单链DNA缺口随后使用DNA聚合酶(f)修复，其用合适的互补核巧酸填充了该缺口，且 DNA连接酶(g)将新合成的链连接到含有单一缺口的双链构建体(步骤3)。
[0032] 图12示出了修饰模板双链多核巧酸(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a)的链 与MuA转座酶(b )、双链发夹形MuA底物(d )、Y-形MuA底物(C)的组接触。两种MuA底物含有标 记为S角形的在模板多核巧酸中不存在的单核巧酸。MuA转座酶将模板双链多核巧酸片段 化，并在片段化的位点的每一侧插入MuA底物(步骤1)。尿喀晚特异性切除试剂化SER?)在模 板多核巧酸中不存在的任何单核巧酸的位置(=角形)产生单核巧酸缺口，使得含有在模板 多核巧酸中不存在的该单核巧酸的DNA片段(e)被除去(步骤2)。留在片段化的双链构建体 中的单链DNA缺口随后使用DNA聚合酶(f)修复，其用合适的互补核巧酸填充了该缺口，且 DNA连接酶(g)将新合成的链连接到含有单一缺口的双链构建体(步骤3)。
[0033] 图13示出了修饰模板双链多核巧酸(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a)的链 与MuA转座酶(b )、双链发夹形MuA底物(d )、Y-形MuA底物(C)的组接触。Y-形MuA底物具有附 加的聚T前导序列（显示为不连续的波浪线）。两种MuA底物含有标记为=角形的在模板多核 巧酸中不存在的单核巧酸。MuA转座酶将模板双链多核巧酸片段化，并在片段化的位点的每 一侧插入MuA底物(步骤1)。尿喀晚特异性切除试剂(USER?)在模板多核巧酸中不存在的任 何单核巧酸的位置(=角形)产生单核巧酸缺口，使得含有在模板多核巧酸中不存在的该单 核巧酸的DNA片段(e)被除去(步骤2)。留在片段化的双链构建体中的单链DNA缺口随后使用 DNA聚合酶(f)修复，其用合适的互补核巧酸填充了该缺口，且DNA连接酶(g)将新合成的链 连接到含有单一缺口的双链构建体(步骤3)。
[0034] 图14示出了修饰模板双链多核巧酸(a)的方法，通过将模板双链多核巧酸(a)的链 与MuA转座酶(b)和双链发夹形MuA底物组(C)接触。发夹环MuA底物含有标记为S角形的在 模板多核巧酸中不存在的单核巧酸。MuA转座酶将模板双链多核巧酸片段化，并在片段化的 位点的每一侧插入MuA底物(步骤1)。尿喀晚特异性切除试剂化SER?)在模板多核巧酸中不 存在的任何单核巧酸的位置(=角形)产生单核巧酸缺口，使得含有在模板多核巧酸中不存 在的该单核巧酸的DNA片段(d)被除去(步骤2)。留在片段化的双链构建体中的单链DNA缺口 随后使用DNA聚合酶(f)修复，其用合适的互补核巧酸填充了该缺日，且DNA连接酶(g)将新 合成的链连接到含有单一缺口的双链构建体(步骤3)。
[0035] 图15示出在实施例1中使用用于两个MuA底物的DNA底物的设计(MuA底物1标记为 A，MuA底物2标记为B)。沈Q ID N0:26中的dUMP高亮为星型，C3间隔区显示为x's。
[0036] 图16示出与W下样品相关的凝胶中的泳道-泳道1 =适当的DNA梯(DNA标记物的单 位为化），泳道2与样品1对应(对照，显示由未修饰的SEQ ID N0:29产生的带），泳道3与样品 2对应（野生型MuA底物(MUA底物1，通过4个C3间隔区单元连接到SEQ ID NO: 24的SEQ ID N0:27,与SEQ ID N0:28杂交)不含在模板多核巧酸(SEQ ID N0:29)中不存在的至少一个核 巧酸），泳道4与样品3对应(含有加 MP的MuA底物(MuA底物2,通过4个C3间隔区单元连接到 沈Q ID N0:24的SEQ ID N0:27,与沈Q ID N0:26杂交），其在模板多核巧酸(SEQ ID N0:29) 中不存在），泳道5与样品4对应(在凝胶上的宽带表明MuA转座酶能够将野生型MuA底物(通 过4个C3间隔区单元连接于沈Q ID N0:24的沈Q ID N0:27,与沈Q ID N0:28杂交)插入到模 板多核巧酸(SEQ ID NO: 29)中），泳道6与样品5对应(在凝胶上的宽带表明MuA转座酶能够 将含有加 MP的MuA底物（SEQ ID N0:27通过4个C3间隔区单元连接到SEQ ID N0:24,与SEQ ID N0:26杂交)插入到模板多核巧酸（SEQ ID N0:29))。泳道3和泳道4作为额外的对照运 行，在凝胶的底部产生模糊的带。
[0037] 图17A)部分显示出实施例2中描述的样品制备方法。在步骤1中的多个ssDNA片段 退火W形成模型构建体(X)。步骤2示出使用USER?从构建体X(标记为S角形）中除去dUMP。 最后，在步骤帥构建体X中的缺口使用DNA聚合酶和连接酶修复，W产生ds-DNA多核巧酸， B)部分示出对照链，其中SEQ ID NO:30退火到其互补链SEQ ID NO:33。
[003引图18示出安捷伦1000忍片，具有包含在泳道1-9如下样品，-泳道1=合适的DNA梯， 泳道2 =对照样品a(含构建体Y，未消化），泳道3 =对照样品b(含消化后的构建体Y)，泳道4 =对照样品C(含未暴露于聚合酶或连接酶的构建体X，未消化），泳道5 =对照样品d(含在消 化后未暴露于聚合酶或连接酶的构建体X)，泳道6 =对照样品e(含仅暴露于聚合酶的构建 体X，未消化），泳道7 =对照样品f(含仅暴露于聚合酶的构建体X，消化后），泳道8 =对照样 品g(含暴露于聚合酶和连接酶的构建体X，未消化），泳道9 =对照样品h(包含未暴露于聚合 酶和连接酶的构建体X，消化后）。用星号标记的条带对应于未消化的dsDNA构建体，用正方 形标记的条带对应于消化的DNA。
[0039]图19示出在实施例3中使用的样品制备过程的卡通表示。在步骤1中所述双链是A DNA(SEQ ID NO: 29,标记为a)与MuA转座酶(b)、双链发夹形MuA底物组(d)和Y-形MuA底物 (C)接触。两种类型的MuA底物含有标记为S角形的单dUMP。该MuA转座酶将ADNA片段化为5-IOkB的片段，并将MuA底物插入到片段化的位点的每侧（步骤1)。尿喀晚特异性切除试剂 USERTM在任何加 MPs(S角形）的位置处产生单核巧酸缺口，运使含有加 MP(e)的DNA片段被 除去(步骤2)。留在片段化的双链构建体中的单链DNA缺口随后使用DNA聚合酶(f)修复，用 合适的互补核巧酸填充了该缺口，且DNA连接酶(g)将新合成的链连接到含有单一链缺口的 双链构建体(步骤3)。在步骤4中，得到的ADNA构建体化)然后在解旋酶(j)的控制下易位穿 过纳米孔(i)。
[0040] 图20(a)显示了实施例3中使用的发夹形MuA底物和Y-形MuA底物的设计。SEQ ID NO: 36中的dUMP被突出显示为S角形且所述iSpC3间隔区显示为S。图20(b)显示了实施例 3中详述的样品制备过程中制备的ADNA构建体。ADNA构建体的5-lOkB片段标记为X，由聚合 酶插入并由连接酶结合到该构建体的其余部分的DNA片段标记为y(且W点线示出），且所述 iSpC3间隔区显示为X。连接体序列（tether sequence) (SEQ ID NO: 39)与所示DNA构建体杂 交。在SEQ ID NO: 39的y末端连接6个i Sp 18间隔区，该6个i Sp 18间隔区连接到2个胸腺喀晚 残基和y胆固醇TEG(显示为灰色圆圈）。
[0041 ] 图21显示了当解旋酶(Trwc Cba(SEQ ID NO:40,由标记A)控制的ADNA构建体(如 图20(b)中所示）穿过纳米孔(MS(Bl-G75S/G77S/L88N/Q126R)8MspA(具有突变G75S/G77S/ L88N/Q126R的SEQ ID NO: 2))的易位时的示例电流轨迹(厂轴坐标=电流(pA)，X-轴坐标= 时间（S)，对于上轨迹和下轨迹）。上轨迹显示了由解旋酶控制的整个ADNA构建体穿过纳米 孔的DNA移动，标记为Xl的第一个iSpC3间隔区产生的标记为1的电流的尖峰，标记为X2的第 二个iSpC3间隔区产生的标记为2的电流的尖峰。下轨迹显示了由解旋酶控制的DNA移动穿 过纳米孔的终点的放大的区域，标记为X3的第S个iSpC3产生的标记为3的电流的尖峰。
[0042] 图22示出在实施例3中使用的样品制备过程的卡通表示。在步骤1中所述双链是A DNA(SEQ ID NO: 29，标记为a)与MuA转座酶(b)、双链发夹形2MuA底物组(d)和Y-形2MuA底物 (C)接触。两种类型的MuA底物含有5'憐酸(标记为圆形)和5个肌巧(标记为矩形KMuA转座 酶将ADNA片段化为5-lOkB的片段，并将MuA底物插入到片段化的位点的每侧（步骤1)。留在 片段化的双链构建体中的缺口随后使用DNA连接酶(e)修复，该连接酶将包含肌巧的链连接 到双链ADNA构建体(步骤2)。在步骤帥，得到的ADNA构建体(f)在解旋酶(g)的控制下易位 穿过纳米孔化）。
[0043] 图23(a)显示了在实施例4中使用的发夹形2和Y-形MuA底物设计。5/憐酸标记为圆 形，SEQ ID N0:41中的肌巧突出显示为矩形，iSpC3间隔区显示为X。图23(b)显示了实施例4 中所述的样品制备过程中制备的WNA构建体。ADNA构建体的5-1 OkB片段标记为X，已被连接 至Ijx的肌巧标记为矩形，iSpC3间隔区显示为X。连接体序列（SEQ ID N0:39)与所示DNA构建 体杂交。SEQ ID N0:39的y末端连接6个iSpl8间隔区，该6个iSpl8间隔区连接到2个胸腺喀 晚残基和y胆固醇TEG(显示为灰色圆圈）。
[0044] 图24显示了当解旋酶(Trwc化a(SEQ ID N0:40,由标记的A)控制的ADNA构建体穿 过纳米孔(MS(B1-G75S/G77S/L88N/Q126R)8的MspA(SEQ ID ^:2具有突变6755/6775/ L88N/Q126R))易位时的示例电流轨迹(厂轴坐标=电流(pA)，X-轴坐标=时间（S)，对于上 轨迹和下轨迹）。上轨迹显示了由解旋酶控制的整个ADNA构建体穿过纳米孔的DNA移动，标 记为Xl的第一个iSpC3间隔区产生标记为1的电流的尖峰，标记为X2的第二个iSpC3间隔区 产生的标记为2电流中的尖峰，标记为X3的第S个iSpC3间隔区产生的标记为3的电流的尖 峰。下轨迹显示了由解旋酶控制的DNA移动穿过纳米孔的后半部分放大的区域，标记为X2的 第二个iSpC3间隔区产生标记为2的电流的尖峰，标记为X3的第S个iSpC3间隔区产生的标 记为3的电流的尖峰。
[0045] 序列表的说明
[0046] SEQ ID NO: 1显示了编码MS-Bl突变体MspA单体的密码子优化的多核巧酸序列。该 突变体缺少信号序列，并包含下列突变:D90N，D91N，D93N，D118R，D134R和E139K。
[0047] SEQ ID N0:2显示了由MspA单体的MS-Bl突变体的成熟形式的氨基酸序列。该突变 体缺少信号序列，并包含下列突