提高脂肪酶耐有机溶剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种提高脂肪酶耐有机溶剂性的方法。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(EC 3.1.1.3)是工业生产应用中的常用酶，在水环境中能够催化脂键的水解，当处于有机溶剂环境中能催化酯交换、酯化、转脂和酰胺化等反应，并具有区域选择性、立体选择性、较高的稳定性，尤其是它的立体选择催化特性，可以用于化学法难以进行的消旋化合物的拆分、不对称合成等。而脂肪酶作用的底物往往是水不溶性，在有机相中才有较好的溶解度，但是在有机溶剂中，介电常数会降低，随之增加异性电荷的吸引力，使蛋白质表面的基团离子化程度减弱，使蛋白质变性。大多数酶类在有机溶剂中活力受到抑制甚至失活，所以在生物催化中的应用受到很大的限制。在有机介质中维持较高的脂肪酶活性及脂肪酶催化底物的广泛性是实际生物催化过程中的难题。
[0003]如何提高酶分子在有机溶剂中的稳定性及活性的保持成了工业化应用中的关键瓶颈。天然脂肪酶在反应过程中催化性能容易受到底物、产物等其他因素的影响；在生产过程中一般都需要极端的操作条件，常用的脂肪酶在有机溶剂、高温、高压、极端pH等非天然环境条件下难以保持较高的活性和稳定性。随着脂肪酶在各个领域的应用越来越广，目前已知的种类和性质已经不能满足生产需求。这些不利因素使脂肪酶难以进一步实现规模化的工业应用，因此提高脂肪酶的有机溶剂稳定性及催化反应速率，对整个行业的发展至关重要。
[0004]开发有机溶剂中脂肪酶具有高活性及高稳定性是十分迫切的，可提升生物催化工程的关键理论与技术。现有技术对在有机溶剂中进行酶催化的研宄着重于酶催化介质工程，酶的物理化学修饰及固定化等技术，往往难以高效地改善酶的有机溶剂稳定性及催化反应效率。
[0005](I)固定化酶技术是实现此目标的有效方法之一，在化工领域已经有不少固定化脂肪酶的应用。(见授权中国申请，授权公告号CN 103232992 A)。
[0006](2)基因突变或定向进化改造脂肪酶，获得高催化性能的突变酶。(见授权中国申请，公告号 ZL102978182 A)。
[0007](3)化学修饰，其中聚乙二醇(PEG)是使用最广泛的修饰剂。(见授权中国申请，授权公告号 ZL 102559635 A)。
[0008](4)添加具有保护作用的小分子渗透剂，一般包括氧化三甲胺，甜菜碱，脯氨酸，山梨醇，甘油，糖类等。(见授权中国申请，授权公告号ZL 101225410 A)。
[0009]目前，海藻糖应用于提高脂肪酶耐有机溶剂性的研宄尚未见报道。
【发明内容】
[0010]发明人意外发现，在脂肪酶催化反应的有机溶剂体系中添加海藻糖后，脂肪酶的耐有机溶剂性有所提高，基于此，发明人提出了本发明方案。而本发明也为解决有机溶剂中酶耐受性差、活力低等问题提供了相应的解决方案。
[0011]具体的，本发明的技术方案为:
一种提高脂肪酶耐有机溶剂的方法，以脂肪酶为催化剂，在包含有有机溶剂的体系中对底物进行催化反应，其特征在于，在含有脂肪酶的有机溶剂体系中添加了海藻糖。
[0012]对于本发明中反应体系可以理解为，存在反应的底物，催化剂，S卩脂肪酶，以及反应溶剂；其中包括优选对底物进行乳化的措施和添加物，目的在于提高底物在有机溶剂中与酶的接触面积以及接触效果等。
[0013]在本发明中，只要在反应体系中添加了海藻糖，即可以实现本发明的目的。即可以理解为，在反应的时机，如在反应前、反应开始后或者反应结束前，在反应的各必要组成物，如在底物、催化液或者酶液、有机溶剂或者反应介质、以及三者任一的组合中添加海藻糖均可以实现本发明的目的。
[0014]在优选的一个实施方案中，以最终的酶催化反应体系计，海藻糖在反应体系中添加的浓度为0.25 -1.25 mol/Lo
[0015]在本发明的另一个优选实施方案中，催化体系中，所述有机溶剂体系为含有有机溶剂的乳化体系，脂肪酶存在于所述催化反应的乳化体系中。
[0016]在本发明中，催化反应为水解、酯交换、酯化、转脂和酰胺化反应中的一种。其中，对于催化反应的实质可以理解为酶与底物结合并使底物转化为产物，发明人发现了在添加了海藻糖的有机溶剂体系中，脂肪酶结构发生改变的直接证据。因此，对于反应的类型的理解，应理解为海藻糖存在时，或导致酶结构的改变，因此，反应的类型应该包括而不局限于水解反应。
[0017]本发明所述脂肪酶为裙皱假丝酵母脂肪酶rugosa lipase, CRL)、南极假丝酵母脂肪酶(an tare ti calipase B, CALB)、根霉脂肪酶(TSizo/WAs lipase)、洋葱假单胞菌脂肪酶(cepacia lipase, PCL)、猪胰脂肪酶(Porcinepancreas lipase, PPL)或洋葱布克氏菌脂肪酶lipase, BCL)中的一种。
[0018]本发明所述的有机溶剂为乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、环己烷、乙醇、二甲基亚砜中的一种。
[0019]在本发明的一个优选方案中，底物包括甘油三酯，如橄榄油，底物优选用阿拉伯树脂胶与其形成乳化液。
[0020]在本发明的一个优选方案中，所述有机溶液体系中底物浓度为25% (v/v)甘油三酯，脂肪酶用量为4-18 μ g/mL，有机溶剂浓度为1%_60%。
[0021]在本发明的一个优选方案中，脂肪酶占所述脂肪酶酶液的质量分数为400-700μ g/mL。
[0022]在本发明的一个优选方案中，所述催化温度为30-50°C，反应搅拌速率为200-400
转/分钟。
[0023]本发明的有益效果在于:
(I)通过本方案，可以有效提高脂肪酶对有机溶剂的耐受性，因此达到降低酶反应催化成本的目的。
[0024](2)本发明提供的方案相对于化学修饰改造酶的分子结构操作，工艺简单易行，且酶能够保持活力，而在化学修饰过程中酶易在失活；本发明相对于基因突变或定向进化，周期短，具有针对性。本发明相对于分子伴侣作用，不需要添加能量(ATP);而且，不同的蛋白质折叠过程中需要不同类型的分子伴侣，通用性较差。
[0025](3)对于本发明的可能原理，发明在实施例中进行了进一步公开，即通过添加海藻糖，脂肪酶的蛋白结构会发生相应的变化，因此带来了酶耐受性增强的有益效果。
[0026](4)但是对于本发明的原理进一步原理，发明人只能推测，可能原因为(a)海藻糖通过形成玻璃态捕获水分子保护生物膜和蛋白抵抗由于水去除造成最初水合作用受到破坏带来的损伤。(b) “水替代”假说，海藻糖与蛋白质的极性基团形成氢键，替代水化层水分子。(C) “优先排阻”假说，海藻糖具有更大的优先水合数，海藻糖被优先排阻于蛋白质表面，并利用蛋白质与水分子间的相互作用，增强蛋白质稳定性。(d) “化学分子伴侣”假说，海藻糖不仅可以协助分子伴侣稳定蛋白质的结构，降低蛋白质的错误折叠和聚集，而且作为通用持久存在的伴侣，直接辅助蛋白质折叠过程中形成柔性通道结构域，增加非天然构象的灵活性，缓解压力条件下产生的蛋白质错误折叠。
【附图说明】
[0027]图1为CRL在乙腈中的催化稳定性。
[0028]图2为CRL含0，2%，3%乙腈中添加不同浓度海藻糖中的催化稳定性。
[0029]图3为CRL在含有2%乙腈中荧光强度的变化。
[0030]图4为CRL在DMF中的催化稳定性。
[0031]图5为CRL含0，20%，30% DMF中添加不同浓度海藻糖中的催化稳定性。
[0032]图6为CRL在含有20% DMF中荧光强度的变化。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例对本发明做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。
[0034]实施例1
本实施例说明脂肪酶的来源。
[0035]本实施例中所用的脂肪酶均购自于Sigma公司，粉末状。本专利所用的脂肪酶之一为 Candida rugosali^Q (CRL)，含有 549 个氨基酸，分子量约为 59.6 KDa, 36% α -螺旋和14%的β -折叠片