专利名称：棉花衰老相关转录因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花衰老相关转录因子及其编 码基因与应用。
背景技术：
植物衰老是指一个器官或整个植物生命功能逐渐衰退的过程，是在自然死 亡前生理上的一系列衰退过程，是长期进化和自然选择的结果(李晴，朱玉贤，分子 植物育种，第1卷，第3期，2003年)。关于植物衰老的研究主要是集中在叶片衰老的 研究上。在叶片衰老过程中，细胞结构、生理生化代谢以及基因表达调控等都发生很 多变化(G印stein S, Genome Biology, 5(3) 212，2004；Chandlee JM, Physiologia Plantarum, 113:1-8，2001; Nam HG, Trends Plant Sci, 8 (6) 272-277，2003)。关于叶片衰 老在生理学，生物化学和分子生物学方面已有不少报道(Yoshida S. Current Opinion in Plant Biology, 6: 79—84，2003; Larry et al, Physiol Plant, 101: 746—753， 1997; Nam HG, Curr Opin Biotech, 8: 200-207, 1997; Smart CM, New Phyto1, 126: 419-448， 1994; Nam HG, Annu Rev Plant Biol, 58:115-36， 2007; Betania et al Trends Plant Sci，5(7) : 278-282. 2000)。NAC是高等植物中所特有的一类转录因子，其命名来源于上世纪90年代发现的 3个基因矮牵牛NAM基因、拟南芥ATAFl /2和CUC2基因(Aida M, et al, Plant Cell, 9 (6) 841 - 857,1997)。NAC转录因子最主要的结构特点是各成员的N端含有高度保守的NAC结构域，整 个N端区域可划分为5个亚结构域(A、B、C、D、E)，其中亚结构域A、C、D高度保守，亚结构 域C、D序列中含有核定位信号(nuclear localization signals, NLS)，可能与转录因子 核定位及启动子上特定顺式元件的识别有关(Kikuchi K, et al, Mol Gen Genet, 262 (6) 1047 - 1051，2000 ；Ooka H，et al, DNA Res, 10 (6) 239 -247，2003)。E 亚结 构域在 NAP、AtNAC3、ATAF 和 0sNAC3 亚家族中高度保守(Ooka H, et al, DNA Res, 10 (6) 239 -247，2003)。C 端是转录激活功能区(transcrip tional activation regions, TARs)，具有高度的多样性，该端的共同特点是一些氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷 氨酸重复出现的频率高。2003年，Ooka等通过全基因组分析，在拟南芥中发现105个NAC 转录因子，在水稻中则发现75个NAC成员。通过比较NAC结构域的氨基酸序列，将它们分 成2个大族，3个亚族(0sNAC3，ATAF，NAM)。根据近几年报道，NAC家族又被划分为为5 个亚族(0sNAC3, ATAF, NAM, AtNAC3, NAP)。NAC转录因子在植物顶端分生组织及花器官分化(Sabl0WSki，et al，Cell, 92 (1) 93 - 103，1998)、侧根形成(Mitsuda N, et al, Plant Cell, 17 (11) 2993 - 3006，2005)、次生壁增厚(Xie Q, et al, Genes Dev, 14 (23) 3024 -3036，2000)等植物特定发育过程以及抵抗生物(Hegedus D, et al, Plant Mol. Biol, 53:383-397，2003)与非生物胁迫过程(Nogueira FT, Plant Science, 169: 93 - 106，2005)中均起着重要作用，NAC转录因子在植物衰老进程也起着重要的调控作用(GU0 YF, GAN S, Plant Journal, 46(4): 601-612,2006)。研究表明，NAC 转录因子在植物的生 长发育、器宫建成、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。相 较于MYB类、bZIP类及WRKY类的转录因子，NAC转录因子的相关研究较少。AtNAP是拟南芥NAC家族中的一种转录因子。Guo等(GUO YF, GAN S, Plant Journal, 46(4): 601-612，2006)研究发现JiUP在调控拟南芥衰老过程中起着重要的作 用diU/M又在衰老叶片中表达，且JiU/7的表达量与叶片的衰老程度成正相关，变化趋势 与衰老标志基因幼似2相一致；拟南芥突变体a to即无论是在自然生长状态下还是在黑暗 诱导状态下均出现叶片衰老滞后表型；诱导似/7过表达时，转基因植株出现明显的提前 衰老现象；进一步研究发现水稻、四季豆的似P皆能异源互补拟南芥突变体atoa/7的滞绿表 型，说明NAP转录因子在调控植物衰老中起着重要的作用。棉花是重要的经济作物之一，为人类提供衣着所必须的棉纤维。随着经济的发展 与生活水平的提高，对棉纤维的需求量不断提高，棉花产需缺口不断扩大。我们的耕地面积 十分有限，因而提高棉花单产成为解决棉花产需缺口的根本办法。棉花每长成一个大铃，需 要两三片叶子进行光合作用，制造营养，才能满足生长需要。大田生产中，即便没有病虫危 害，且水肥供应充足，棉花蕾铃脱落率达6(Γ70%。棉花早衰是限制棉花产量的主要问题，解 决早衰是棉花高产育种的关键之一。以往对棉花衰老的研究多集中于植物生理学层面如激 素水平、清除活性氧酶等。棉花早衰主要是由棉花自身遗传因素决定的生理生化作用引起 的，而从分子遗传学角度研究和改造棉花早衰问题的研究还不多。本发明提供了一个与棉 花衰老相关的转录因子，对于从分子遗传学角度研究棉花衰老，以及通过遗传工程改良棉 花的衰老特性都具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花衰老调控相关的NAP转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的棉花衰老相关转录因子，来源于陆地棉(Gossypium hirsutum L.)，名称为GhNAC7，是具有SEQ ID NO. 2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO. 2 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与SEQ ID NO. 2的 氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID N0. 2衍生的蛋白质。棉花GhNAC7转录因子的编码基因，是下列核苷酸之一。1) SEQ ID NO. 1 所示的 DNA 序列。2)编码SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的多核苷酸。序列表中，SEQ ID NO. 1由861个碱基组成；SEQ ID N0. 2由286个氨基酸残基组 成。本发明还包括所述棉花衰老相关转录因子GhNAC7的编码基因的表达载体。本发明还包括所述棉花衰老相关转录因子GhNAC7的编码基因的细胞系。本发明还包括所述棉花衰老相关转录因子GhNAC7的编码基因在棉花衰老调控分 子机制中的应用。本发明还包括所述棉花衰老相关转录因子GhNAC7的编码基因在延缓植物衰老性
4状改良中的应用。
图1为GhNAC7编码序列全长扩增产物凝胶电泳图谱。图2为GhNAC7与其它植物衰老相关转录因子的进化树分析。图3为GhNAC7与其它植物衰老相关转录因子序列同源性分析。图4为黑暗处理4天时野生型拟南芥，atnap,互补转基因植株离体叶片表型。图5为正常生长45天的状态下野生型，atnap,互补转基因植株的表型。
具体实施例方式实施例1、棉花衰老相关转录因子编码基因的获得。1.1 RNA 提取
选用陆地棉作为材料，取自然衰老发生黄化的叶片材料约0. Igo液氮充分研磨后，转移 到 1.5ml 离心管，加 ImlTRI
(invitrogen公司)，混勻后，室温放置15分钟，加0. 2ml氯仿异戊醇(24:1 )，剧烈摇动 15秒后室温放置5分钟，13000rpm, 4°C离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小 心混勻，室温放置15分钟，13000rpm, 4°C离心15分钟。70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分 钟。溶解于适量的经0. 1% DEPC处理过的ddH20水中，贮存于_80°C备用。1. 2 cDNA第一链合成和反转录PCR
采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指 南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为2μ g制备的总RNA，0. 5μ 1 RNase inhibitor，加 DEPC 处理过的去离子水至 8. 5 μ 1，2 μ 1 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C，5min,室温放置 lOmin，13000rpm 简短离心5s。再依次加入4μ1 5XFirst-Strand buffer,0.5 μ 1 RNase Inhibitor,2 μ 1 IOOmM DTT, 2μ 1 dNTP, 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase ο小心混勻；37°C反转录1小时，90°C 5分钟；冰上冷却；13000rpm短暂离 心5秒钟，存放于_20°C待用
1. 3 RT-PCR扩增GhNAC7编码序列全长。根据必UC7基因序列，设计了两条引物GhNAC7F(5，ATGGAAACAAAMCCAGCTCTGAC 3，)禾口 GhNAC7R (5' TTACTGAAATTGATACAGCATGGGA 3，) (SEQ ID NO. 3)作为 PCR 反应的引 物。PCR反应体系为50 μ 1，反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s， 72°C延伸60s，循环38次。72°C充分延伸IOmin。将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳 分离获得一段约861bp的片断。回收并且通过TA克隆至TAKARA pMD_19_T载体后，由上海 英骏公司测序，获得GhNAC7编码序列的全长。实施例2 棉花衰老相关转录因子GhNAC7功能分析。2. 1序列比较分析
使用Genedoc软件分析GhNAC7与其他物种的同源性。分析结果表明，GhNAC7不仅具 有NAC家族中保守的5个亚结构域，而且E亚结构域高度保守。拟南芥AtNAP、菜豆PvNAP、 大豆 GmNAP 的 GenBank 登录号分别为NP_564966. 1，AAK84884. 1，AAY46121. 1。为了分析GhNAC7同其他物种衰老相关转录因子NAP的系统发生关系，用MEGA软
5件建立了 GhNAC7同其他物种NAP的系统发生树。结果表明GhNAC7同大豆GmNAP的亲缘关系 最近。菜豆 (kidney bean),截形苜蓿(medicago), 大豆(soybean),拟南芥 (arabidopsis),
马铃薯野生种(nightshade)，杨树(populus)，小麦(wheat)，水稻(rice)，番茄(tomato)， 矮牵牛(petunia)，马铃薯(potato)的NAP序列登录号分别为AAK84884，AC140030_19. 1， AAY46121, NP_564966. 1，AAU90314, gwl. Χ.1066. 1，AAU08785, NP_912423, AAU43923, AAM34773, AAU12055。2. 2 GhNAC7 的功能分析。2. 2. 1互补拟南芥atoa/7植物表达载体构建
以一对正反向引物NOS-F和N0S-R，以带有NOS终止子的pCAMBIA1301载体为模板，将 231bp的NOS终止子PCR扩增出来，加A后连入pMD19_T载体，测序验证序列准确无误。再 用PstI和HindIII酶将NOS终止子片段酶切下来，亚克隆到双元载体pPZP221的多克隆位 点中的相应酶切位点中，得到的工程载体命名为PPZP221-N0S。将GhNAC7的完整编码区用分别添加了 EcoRI和SalI酶切位点的引物Ghl-F和 Ghl-R通过PCR扩增出来，用相应的限制性内切酶酶切PCR产物，连接到pBluescript II KS(+)克隆载体后测序验证序列的正确性，得到的工程载体命名为pSK-GhNAC7。以一对正反向引物Gh2_F和Gh2_R扩增Ji似/^基因ATG上游约2K的启动子片段， 加A后连入pMD19-T载体，测序验证。用SacI和EcoRI内切酶将启动子片段酶切下来，连 接到用相同酶酶切的pSK-GhNAC7载体上，得到pSK-pAtNAP-GhNAC7工程载体。用SacI 和 SalI 酶将 pSK_pAtNAP_GhNAC7 上的 VAtNAP·. \GhNAC7 片段酶 切下来，克隆到用相同的两种酶同时酶切的PPZP221-N0S载体上，得到最终的 pPZP22l-P^#^-GhNAC7-N0S 互补载体。NOS-F 5' TCACTGCAGGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTT 3'
NOS-R 5' CTCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC 3' (SEQ ID N0. 4)
Ghl-F 5' GAGGAATTCATGGAAACAAAAACCAGCTCTGAC 3'
Ghl-R 5' GCGTCGACTTACTGAAATTGATACAGCATGGGA 3' (SEQ ID N0. 5)
Gh2-F 5' ACGAGCTCCGTCATCTCATCCTAATCCTCAT 3'
Gh2-R 5' GCGAATTCGATTTTCAGACAATTTAGAAAACAATC 3，(SEQ ID Ν0· 6)。2.2.2农杆菌转化。2. 2. 2. 1 LBA4404农杆菌感受态细胞制备
1)在含利福霉素40yg/ml，链霉素100yg/ml的YEB固体培养基上划线，28°C培养 48h-72h ；
2)挑单菌落到含利福霉素40μ g/ml，链霉素100yg/ml的YEB液体培养基中28 °C培 养至 OD6tltl 0. 5 ；
3)冰上冷却菌液，5000rpm，4°C10分钟收集菌体；
4)ImM Hepes pH 7. 0洗涤3次，再用10%甘油洗涤一次；
5)悬浮菌体于3ml10%甘油中，分装到1.5ml离心管中，每管40 μ 1。2. 2. 2农杆菌转化
1) 200ng质粒DNA，W 40 μ 1农杆菌感受态细胞混勻后按以下条件进行电转化 U 1. 8 KV2)电击后添加800μ 1 SOC液体培养基，280C培养Ih ；
3)4000rpm，10分钟收集菌体，悬浮于200μ1 SOC中，涂在含100 yg/ml壮观霉素，利 福平40 μ g/ml,链霉素100 μ g/ml LB固体培养基上，28°C倒置培养48h_72h。2. 2. 3农杆菌介导的拟南芥转化。2. 2. 3. 1拟南芥基质培养
权利要求
一种棉花衰老相关转录因子，其特征在于是SEQ ID NO: 2所示氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO: 2衍生的蛋白质。
2.棉花衰老相关转录因子GhNAC7的编码基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQID NO: 1所示的核苷酸序列，或者为编码SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。
3.含有如权利要求2所述棉花衰老相关转录因子GhNAC7的编码基因的表达载体。
4.含有如权利要求2所述棉花衰老相关转录因子GhNAC7的编码基因的细胞系。
5.如权利要求2所述棉花衰老相关转录因子GhNAC7的编码基因在延缓植物叶片衰老 性状改良中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花衰老相关转录因子及其编码基因与应用。本发明提供的棉花衰老相关的转录因子，来源于陆地棉，名称为GhNAC7,其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。棉花衰老相关转录因子的编码基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，或者为；编码SEQIDNO.2氨基酸序列的多核苷酸。本发明的基因可用于棉花抗衰老分子机制研究，并可用于延缓植物叶片衰老性状改良，为今后通过基因工程延缓棉花叶片衰老从而提高棉花产量提供理论依据。
文档编号C07K14/415GK101979408SQ20101052384
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者梁宁菁, 蒯本科, 邱凯, 魏强 申请人:复旦大学