ctatcagtgatagagacaccaggaaacct^S tcai^tagatcgaatggactctaaatccgttcag ccgggttagattcccggggtttccggacaagtgcggttttttt
[0560] SEQ ID No 38
[0561] HltRNA-A2B构建体
[0562] aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatccctatcagtgatagagac ttataagttccctatcagtgatagagacaccaggaaacct^S tca?i^tagatcgaatggactctaaatccgttcag ccgggt空agattcccggggtttccggacaagtgcggttttttt
[0563] SEQ ID No 39
[0564] Hl-tRNA构建体中使用的终止子序列：
[0565] gacaagtgcggttttttt
[0566] SEQ ID No 40
[0567] 小家鼠tRNAglu编码序列
[0568] tccctggtggtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcggcccgggttcgattctcggtcagg gaa
[0569] SEQ ID No 41
[0570] 具有5'和3'非编码区的小家鼠tRNA Glu :
[0571] Gcctgtagtagtccgccggagcggaggttccaggcgggcaagcagtgtatctgccacggtggcggagag gctgtgtgtctgagtgtctccaggagtcggtagccgtgacctcgggccgacgctccctggtggtctaKtggttagga ttcggcgctctcaccgccgcggcccg^gttcgattctcggtcagggaagcctctcttcttcctctctgcaccctcac ttccccaaacctcgctcctcttccctcgctcacttttgcccaacaccaacgcacacc
[0572] SEQ ID No 42
[0573] 1 X tRNAglu-pyl DNA构建体
[0574] gccgtgacctcgggccgacgctccctggtggtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcggcc cgggttcgattctcggtcagggaagcctctcccccaaacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaa tccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcttcttcctcttttct
[0575] SEQ ID No 43
[0576] 3 X tRNAglu-pyl :包括双顺反子构建体tRNAglu-tRNApyl的3个重复序列的DNA 构建体
[0577] gccgtgacctcgggccgacgctccctggtggtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcggcc cgggttcgattctcggtcagggaagcctctcccccaaacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaa tccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcttcttcctcttttctgcaccctcacttcagctgagccgtgac ctcgggccgacgctccctggtggtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcggcccgggttcgattctcgg tcagggaagcctctcccccaaacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggtt agattcccggggtttccgcttcttcctcttttctgcaccccaatattgccgtgacctcgggccgacgctccctggtg gtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcggcccgggttcgattctcggtcagggaagcctctcccccaaa cctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgtagc gtcctttttggaaagacaagtgggtggcgaattcgatatc
[0578] SEQ ID No 44
[0579] 用于tRNAglu-pyl构建体的5'前导序列
[0580] gccgtgacctcgggccgacgc
[0581] SEQ ID No 45
[0582] tRNAglu-pyl构建体中使用的终止子序列
[0583] tagcgtcctttttg
[0584] SEQ ID No 46
[0585] tRNAglu-pyl构建体中使用的终止子序列
[0586] Cttcttcctcttttct
[0587] SEQ ID No 47
[0588] tRNAglu-pyl构建体中使用的基因间序列
[0589] gcctctcccccaaacctc
[0590] SEQ ID No 48
[0591]小家鼠tRNAasp编码序列
[0592] TcctcRttaRtataRtRRtRaRtatccccRcctRtcacccRCRaRaccRRCRttccattccccRacRRR gag
[0593] SEQ ID No 49
[0594] 具有上游和下游区域的小家鼠tRNA Asp
[0595] tgggtgagacggaggttgtgggtcgtgtgtgtcgtcgtagacggtcgggcgacggtgcgtcgtagtcgg cgttgtcctcgttagtatagtggtgagtatccccgcctgtcacccgcgagaccggcgttccattccccgacggggag acgtagcgtcctttttggaaagacaagtgggtggcccgcggg
[0596] SEQ ID No 50
[0597] 1XtRNAasp-pyl DNA构建体
[0598] ggtgcgtcgtagtcggcgttgtcctcgttagtatagtggtgagtatccccgcctgtcacccgcga gaccggcgttccattccccgacggggagacgtagccccacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggact ctaaatccgttcagccgggttagattcccgggg七ttccg
[0599] SEQ ID No 51
[0600] 2XtRNAasp-pyl :包括双顺反子构建体tRNAasp-pyl的2个重复序列的DNA构建 体
[0601] tcctcgttagtatagtggtgagtatccccgcctgtcacccgcgagaccggcgttccattccccgacggg gagacgtagccccacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattccc ggggtttccgtagcgtcctttttggaaagacaaggtgcgtcgtagtcggcgttgtcctcgttagtatagtggtgagt atccccgcctgtcacccgcgagaccggcgttccattccccgacggggagacgtagccccacctcggaaacctgatca tgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgtagcgtccttttt
[0602] SEQ ID No 52
[0603] 2XAsp_pyl构建体中使用的前导序列
[0604] Ggtgcgtcgtagtcggcgttg
[0605] SEQ ID No 53
[0606] 2XAsp_pyl构建体中使用的终止子序列
[0607] tagcgtccttttt
[0608] SEQ ID No 54
[0609] tRNAasp-pyl构建体中使用的基因间序列
[0610] acgtagccccacctc
[0611] SEQ ID No 55
[0612] 人tRNAglu编码序列
[0613] TCCCTGGTGGTCTAGTGGCTAGGATTCGGCGCTTTCACCGCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGG AAT
[0614] SEQ ID No 56
[0615] 人tRNAasp编码序列
[0616] TCCTTGTTAGTATAGTGGTGAGTGTTTCTGCCTGTCATGTGGAGACTGGAGTTTGAGTCCCCAACAGG GA
[0617] SEQ ID No 57
[0618] 7SL启动子变体：7SL_1
[0619] CGCTCCCCAATGACGTAACTGCCCTGC-AGCTTCTAGTAGCT-TTTCGCAGCGTCTCCGACCG
[0620] SEQ ID No 58
[0621] 7SL启动子变体：7SL_2
[0622] TCTGGTTGCTACCATGTGTAGCC-TGCAAGCCTCTAGCAGCTCTTTTGCAGCGACGCCGACCG
[0623] SEQ ID No 59
[0624] 7SL启动子变体：SL28
[0625] TAACATTGCTAATGAGTTTTGGGCACACATTGTCATTGATAACATCTTATCAGGAGACAGGG
[0626] SEQ ID No 60
[0627] 7SL启动子变体：7L63
[0628] ACAGAGGAACTACCATAACAAGAACCAAAGAGAAATGGCAtACcTCAGG
[0629] SEQ ID No 61
[0630] 7SL启动子变体：7L23
[0631] CTCCCTCTCAAAACTCAAGGAAATCTAGTGGGCATGGTGCACAT
[0632] SEQ ID No 62
[0633] 7SL启动子变体：7L7
[0634] AGGTACTACCCAATGGTTTTCTAAAATACTTGCATC-TGCACATGCCATG
[0635] SEQ ID No 63
[0636] EBER启动子变体：EBER1
[0637] GATCCAAACTTTTGTTTTAG GATTTATGCA TCCATTATCC CGCAGTTCCA CCTAAACGGG GCTTAACGTT GCATCCCAGA AGATGCACGC TTAACCCCGC CTACAACCGT GACGTAGCTG TTTACCAGCA TGTATAGAGT TACGGTTCGC TACATCAAAC
[0638] SEQ ID No 64
[0639]穹窿体启动子变体：Hvg3
[0640] aggtcgctgagtcaagctaaagcaccgttgttttgactcactctttgtgacgtaggtctttctcaccag tcaagaaaatacaatccgaaagcaacctctg
[0641] SEQ ID No 65
[0642]穹窿体启动子变体：Hvg2
[0643] Tggttgctgagtcatgctaaaacactgttgttttgactcactttgtgacgtaggtctttctcaccagtc aagaaaatataatccggagatagcctctg
[0644] SEQ ID No 66
[0645]马氏甲焼八叠球菌pylRS aa序列
[0646] Mdkkplntlisatglwmsrtgtihkikhhevsrskiyiemacgdhlvvnnsrssrtaralrhhkyrktc krcrvsdedlnkfltkanedqtsvkvkvvsaptrtkkampksvarapkplenteaaqaqpsgskfspaipvstqesv svpasvstsissistgatasalvkgntnpitsmsapvqasapaltksqtdrlevllnpkdeislnsgkpfrelesel lsrrkkdlqqiyaeerenylgklereitrffvdrgfleikspilipleyiermgidndtelskqifrvdknfclrpm lapnlynylrkldralpdpikifeigpcyrkesdgkehleeftmlnfcqmgsgctrenlesiitdflnhlgidfkiv gdscmvygdtldvmhgdlelssavvgpipldrewgidkpwigagfglerllkvkhdfknikraarsesyyngistnl
[0647] SEQ ID No 67
[0648]马氏甲烷八叠球菌pylRS核苷酸序列
[0649] atggataaaaaaccattgaatacgctcattagcgcaactgggctgtggatgagccgtacgggaacgatt cataaaatcaagcaccacgaagtatctcgtagcaaaatctatatcgagatggcttgcggcgaccatctcgtggtaaa caatagcaggtcctcacggaccgcccgtgccttgcgccaccacaaatatcgtaaaacttgtaagagatgtagagtga gcgacgaggatctgaacaagtttcttacaaaggccaacgaggaccaaaccagcgtcaaagtcaaggttgtgagcgcc ccaacacgcaccaagaaggccatgcccaagtctgttgcgcgggcaccgaaacctctggagaatactgaggccgctca ggcccagcccagcggttcaaaattctctcctgccattccagttagcactcaagagtcagtcagcgtgcccgcctctg tgtctacatccatcagctctatctccaccggcgcaacagcctctgccctggtgaagggtaatacgaaccctatcacg agtatgtccgcacccgtgcaagcaagtgctcccgcactcactaaatcccaaacggaccggctggaggtcctgcttaa ccctaaggatgaaatcagcctgaacagtggaaaaccgtttcgagaactggaatccgagctcttaagccggcgaaaga aagatttgcaacagatttacgccgaagaacgggaaaattatctgggcaagctggagagagaaatcactaggttcttt gtagataggggctttctggagattaagagtcccatattgatccctctcgaatacattgagcgtatgggcatcgacaa cgacacagaacttagcaagcagatctttcgggtggacaaaaacttctgcctcaggcctatgctggctccaaatctgt acaactatcttaggaaactcgaccgggccctgcccgatcccattaaaatcttcgaaattggaccttgctatagaaag gagagcgatggcaaggagcacctggaggagtttactatgctcaatttctgtcaaatgggctccggctgcacacgtga gaacctcgaatccattataaccgacttcctgaatcacctggggattgatttcaagatcgtgggcgactcctgcatgg tgtttggtgatacgttggatgtgatgcacggagatttggaattgtcaagcgctgtggtaggccccattcctctcgac agggagtggggtattgacaagccctggatcggcgcaggttttggact-ggagcgcctgttgaaggttaagcatgact tcaaaaacataaagagagccgcacgcagcgaatcctattataatggaatcaqcactaacttqtaa
[0650]在本说明书通篇和随后的权利要求书中，除非上下文另外要求，词语'包括 (comprise)'、以及变型如'包括（comprises)'和'包括（comprising)'将理解为意味着 包括所陈述的整数、步骤、整数组或步骤组，但是不排除任何其他整数、步骤、整数组或步骤 组。
[0651]由本说明书和权利要求书部分构成的申请可以用作任何后续申请的优先权基础。 这种后续申请的权利要求书可以涉及在此所述的任何特征或特征组合。它们可以是产品、 组合物、方法、或用途权利要求的形式，并且可以无限制地通过实例包括下列【主权项】
【主权项】
1. 一种DNA构建体，该DNA构建体包含一个tRNApyl编码序列和一个RNA聚合酶III 启动子序列，该DNA构建体能够在真核表达系统中起作用以表达足以支持无义抑制的功能 性 tRNApyl〇2. 根据权利要求1所述的DNA构建体，其中该无义抑制是琥珀型抑制。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的DNA构建体，该构建体包含在该tRNApyl编码 序列下游的终止子序列。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的DNA构建体，其中该构建体包含tRNApyl基因， 该基因包含该tRNApyl编码序列，以及功能性基因内RNA聚合酶III启动子。5. 根据权利要求4所述的DNA构建体，其中该tRNApyl基因含有在该基因内RNA聚合 酶III启动子的推测性A盒和/或推测性B盒中的1或2个核苷酸位置上的突变。6. 根据权利要求5所述的DNA构建体，其中该tRNApyl基因含有在该推测性B盒中的 1或2个核苷酸位置（例如1个位置）上的突变。7. 根据权利要求4至6中任一项所述的DNA构建体，其中该tRNApyl基因具有或包含 来源于马氏甲烷八叠球菌的SEQ ID No 7、8、9、10、或11的序列或具有或包含来源于另一个 细菌物种的类似tRNApyl基因的序列，其中在SEQ ID No 7、8、9、10、或11中通过粗体指示 的突变发生在等效位置。8. 根据权利要求1至6中任一项所述的DNA构建体，其中该tRNApyl编码序列可操作 地连接至RNA聚合酶III启动子，其中所述启动子置于该tRNApyl编码序列的5'。9. 根据权利要求7所述的DNA构建体，其中该5'启动子和该tRNApyl编码序列通过含 有转录起始位点的间隔子序列分开。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的DNA构建体，该构建体包含基因内启动子元件 和5'启动子元件，该5'启动子元件为置于该tRNApyl编码序列5'的RNA聚合酶III启动 子元件，这样使得所述基因内启动子元件和所述5'启动子元件的组合构成杂合启动子。11. 根据权利要求10所述的DNA构建体，其中所述5'启动子元件为4型RNA聚合酶 III启动子的5'元件。12. 根据权利要求11所述的DNA构建体，其中4型RNA聚合酶III启动子的该5'启 动子元件选自EBER RNA基因启动子、7SL RNA基因启动子以及穹窿体RNA基因启动子的5 ' 启动子元件。13. 根据权利要求11所述的DNA构建体，其中该5'启动子元件选自SEQ ID No 12、20、 26、57、58、59、60、61、62、63、64 以及 65。14. 根据权利要求11所述的DNA构建体，其中4型RNA聚合酶III启动子的该5'启动 子元件是7SL RNA基因启动子。15. 根据权利要求10至14中任一项所述的DNA构建体，其中该5'启动子元件和该 tRNApyl编码序列通过含有转录起始位点的间隔子序列分开。16. 根据权利要求14所述的DNA构建体，其中该间隔子序列选自SEQ ID NO 13、21以 及27。17. -种多聚体DNA构建体，该构建体包含多个拷贝（例如2至60个拷贝）的根据权 利要求1至16中任一项所述的DNA构建体。18. -种DNA构建体，该构建体包含在tRNApyl基因5'的一个真核tRNAglu基因或一 个真核tRNAasp基因，所述tRNAglu基因或tRNAasp基因被去除终止序列，因此在转录时产 生双顺反子信息。19. 根据权利要求13所述的DNA构建体，其中该tRNApyl基因是野生型基因。20. 根据权利要求13所述的DNA构建体，其中该tRNApyl基因含有在该推测性A盒和 /或该推测性B盒中的1或2个核苷酸位置上的突变。21. 根据权利要求1至15中任一项所述的DNA构建体，该构建体还包含PylRS编码序 列或基因。22. -种真核宿主细胞，该细胞用包含根据权利要求1至16中任一项所述的DNA构建 体的载体转化。23. 根据权利要求17所述的真核宿主细胞，该细胞用包含编码靶蛋白的基因的载体转 化，该靶蛋白含有由无义密码子编码的一个或多个非天然氨基酸。24.-种真核细胞系，该真核细胞系表达或能够表达功能性PylRS和功能性tRNApyl， 其中功能性tRNApyl表达发生在一个基因内启动子元件和一个5'启动子元件的控制下，该 5'启动子元件为置于该tRNApyl编码序列5'的RNA聚合酶III启动子元件，这样使得所述 基因内启动子元件和所述5 '启动子元件的组合构成一个足以支持无义抑制的杂合启动子。25. 根据权利要求19所述的真核细胞系，其中该无义抑制是琥珀型抑制。26. 根据权利要求17至20中任一项所述的真核宿主细胞，其中该宿主细胞是哺乳动物 细胞。27. -种用于制备含有由无义密码子编码的一个或多个非天然氨基酸的靶蛋白的方 法，该方法包括在真核细胞系中表达所述靶蛋白，该真核细胞系用编码含有由无义密码子 编码的一个或多个非天然氨基酸的靶蛋白的基因转化并且该真核细胞系还用编码PylRS 和tRNApyl的基因转化，这样使得PylRS和tRNApyl被表达并且充分起作用以支持无义抑 制。28. 根据权利要求27所述的方法，其中该细胞系用根据权利要求1至21中任一项所述 的DNA构建体转化。29. -种用于制备化学修饰的靶蛋白的方法，该方法包括根据权利要求27或28所述的 方法制备靶蛋白并且对所得靶蛋白化学修饰。30. 根据权利要求22至29中任一项所述的细胞、细胞系或方法，其中该无义密码子是 琥珀密码子。31. 根据权利要求22至30中任一项所述的细胞、细胞系或方法，其中这些非天然氨基 酸中的至少一个包含炔或叠氮部分。32. -种使用根据权利要求27至31中任一项所述的方法制备的如抗体缀合物的蛋白 质缀合物，其中如抗体的该蛋白质通过包含三唑部分的接头缀合至选自蛋白质、药物以及 PEG部分的一个或多个其他部分。33. -种用于增加稳定转化以表达含有一个或多个非天然氨基酸的靶蛋白且表达 PylRS和tRNApyl的真核细胞系的活力的方法，该方法包括用编码PylRS和tRNApyl的基因 转化该真核细胞系，这样使得PylRS和tRNApyl被表达并且充分起作用以支持无义抑制。34. 根据权利要求33所述的方法，其中该无义抑制是琥珀型抑制。35. 根据权利要求1至34中任一项所述的DNA构建体、细胞、细胞系、方法或蛋白质缀 合物，其中该tRNApyl不是来源于巴氏甲烧八叠球菌的tRNApyl。
【专利摘要】在此尤其提供了一种DNA构建体，该构建体包含一个tRNApyl编码序列和一个RNA聚合酶III启动子序列，该构建体能够在真核表达系统中起作用，以表达足以支持无义抑制的功能性tRNApyl。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/09
【公开号】CN105247049
【申请号】CN201480019597
【发明人】G·迪西, M·马瑞利, K·H·格拉布斯坦
【申请人】米迪缪尼有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2906292A1, EP2970949A2, US20160024522, WO2014140347A2, WO2014140347A3