用于文库构建、亲和力结合剂筛选和其表达的整合系统的制作方法
【专利说明】用于文库构建、亲和力结合剂筛选和其表达的整合系统
[0001] 发明技术领域
[0002] 本申请涉及展示文库的构建和筛选，特别是其载体的设计和用途。
[0003] 发明背景
[0004] 特异性结合例如抗原的靶标的例如抗体的亲和力结合剂的高通量筛选可以通过 包括噬菌体展示、核糖体/mRNA展示、酵母展示和哺乳动物展示的表面展示技术进行。已 经研发了各种展示载体，从而，在表达后，肽或蛋白质的文库可展示在噬菌体、细菌、酵母或 哺乳动物细胞的表面上。亲和力结合剂因此可经由例如噬菌体淘选或荧光激活细胞分选 (FACS)的文库筛选和选择过程鉴定。因此，对应于亲和力结合剂的克隆必须进一步表征以 确定结合剂的同一性，以及用于下游应用。
[0005] 通常，来自结合克隆的插入物单个地或全体地转移或亚克隆到表达载体中，从而 可表达、纯化或进一步表征插入物。然而，转移来自展示载体的插入物到表达载体的所述亚 克隆过程是耗时、艰巨且低通量的。另外，亚克隆的效率低且无法预测，从约50%到约80% 变化。因此，存在对于快速、廉价且高通量的方法来加速亲和力结合剂鉴定和表征过程的需 要。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明的方面涉及用于例如从展示到表达的高通量转化的载体的设计和用途。在 一些实施方案中，所述设计需要审慎工程改造在具体序列位置处的限制酶位点和采用限制 酶与DNA连接酶的组合来促进所述转化。各种文库可使用本发明的载体来构建，以能够实 现高通量文库筛选、结合剂选择/回收和结合剂表征。在实施所述高通量过程后，已经惊奇 地发现可实现高转化率（例如，超过90 %、超过95%或接近100 % )，由此大大加速结合剂 发现和表征过程。
[0008] -方面，提供适用于构建各种载体的重组多核苷酸。所述重组多核苷酸从5'到 3'包含：编码将在表面上展示的氨基酸序列的第一核酸序列；选自由Xbal、Ncol、Sail和 Xhol位点组成的组的第一限制位点；编码能够展示在所述表面上的表面肽的第二核酸序 列；和选自由XbaI、NcoI、SalI和Xhol组成的组位点的第二限制位点。在各种实施方案中， 所述第一核酸序列与所述第二核酸序列同框工程改造。当通过其相应限制酶裂解时，所述 第一限制位点和所述第二限制位点生成相容性粘性末端。
[0009] 在一些实施方案中，所述第一核酸序列编码例如Fab的抗体片段。所述第二核酸 序列可编码噬菌体外壳蛋白、酵母外壁蛋白、细菌外部膜蛋白、细胞表面系链结构域或衔接 子或其截断或衍生物。例如，所述第二核酸序列可为丝状噬菌体M13的基因III或其截断 或衍生物。所述第二核酸序列也可编码能够结合结合配偶体的衔接子，其中所述结合配偶 体作为融合体表达并直接展示在所述表面上。相应地，所述表面肽可用于噬菌体展示、酵母 展示、细菌展示或哺乳动物展示或在不同宿主之间的穿梭展示（例如，经由衔接子）。在各 种实施方案中，在表达时，所述表面肽和由所述第一核酸序列编码的氨基酸序列作为融合 蛋白展示在所述表面上。
[0010] 在某些实施方案中，所述第一限制位点和所述第二限制位点各自编码不干扰所述 氨基酸序列的结合亲和力和/或所述表面肽或融合蛋白的展示的氨基酸。在一些实施方案 中，所述第一限制位点和/或所述第二限制位点为Xbal位点。
[0011] 另一方面，提供高通量转化成表达载体的展示载体。所述展示载体包含本文所述 的重组多核苷酸和所述第一限制位点的5'或所述第二限制位点的3'的融合标签序列。在 一些实施方案中，当所述融合标签序列在所述第二限制位点的3'时，将其被工程改造以使 得在（a)通过裂解所述第一限制位点和所述第二限制位点除去所述第二核酸序列和（b) 再连接由此生成的相容性粘性末端时，所述第一核酸序列与所述融合标签序列同框。所述 融合标签序列可选自以下标签中的一种或多种：碱性磷酸酶标签、Avi标签、角质酶标签、 halo标签、flag标签、c-myc标签、组氨酸标签、GST标签、绿色荧光蛋白标签、HA标签、E-标 签、Strep标签、Strep标签II和Yol1/34标签。所述展示载体可提供在展示载体的文库 中，其中各个展示载体具有独特的第一核酸序列，由此形成用于选择的文库。
[0012] 另一方面，提供将展示载体转化成表达载体的方法。所述方法包括：提供本文所述 的展示载体；用其相应限制酶裂解所述第一限制位点和所述第二限制位点，由此生成所述 相容性粘性末端；和再连接所述相容性粘性末端以生成表达载体，其中所述第一核酸序列 与所述融合标签序列同框。
[0013] 在一些实施方案中，所述方法可还包括在所述第二核酸序列内裂解以增加在所述 再连接步骤中的再连接效率。在某些实施方案中，在所述再连接步骤之前，可将来自所述裂 解步骤的产物稀释以增加分子内连接。
[0014] 在各种实施方案中，在所述再连接步骤之后，可将由此生成的表达载体引入宿主 中，以进一步表征所述第一核酸序列。示例性进一步表征包括定序所述第一核酸序列和/ 或表达所述第一核酸序列。
[0015] 在各种实施方案中，所述方法为高效率的方法。例如，所述提供、裂解、再连接和引 入步骤可在小于12小时内、在小于8小时内或在小于4小时内完成。
[0016] 所述方法可以高通量方式执行，其中多种展示载体可平行地转化成多种表达载 体。因此，可将所述多种表达载体引入宿主群体中以进一步表征。所述高通量转化可具有 高于90%、高于95 %或高于98 %的转化率（从所述多种展示载体转化到所述多种表达载 体）。
[0017] 又一方面，提供鉴定对于靶标的亲和力结合剂的方法。所述方法包括：筛选各自含 有本文所述的展示载体的第一宿主的群体，以获得对于靶标具有结合亲和力的第一宿主的 亚群，其中各第一宿主在所述第一宿主的表面上展示由在所述展示载体中的独特第一核酸 序列编码的氨基酸序列，并且其中所述第一宿主的亚群各自展示对于所述靶标的亲和力结 合剂；从所述第一宿主的亚群中分离的展示载体通过裂解所述第一限制位点和所述第二限 制位点以除去所述第二核酸序列并再连接由此生成的相容性粘性末端而转化成表达载体； 和将所述表达载体引入第二宿主的群体中，以进一步表征所述亲和力结合剂。在各种实施 方案中，所述方法可以高通量方式执行，其中所述转化步骤可具有高于90%、高于95%或 高于98 %的转化率。
[0018] 还提供了使用本文所述的载体构建且用于进行本文所述的方法的文库和试剂盒。 进一步提供在筛选过程期间产生的子文库和由本文所述的方法获得的亲和力结合剂。
[0019] 附图简述
[0020] 图1提供示出本发明的示例性载体的示意性限制酶图谱。
[0021] 图2提供示出示例性载体在不同浓度下的转化率的凝胶电泳图像。使用一种限制 酶Xbal。
[0022] 图3提供示出示例性载体在不同浓度下的转化率的凝胶电泳图像。使用两种限制 酶Xbal和XmnI。
[0023] 发明详述
[0024] 本发明涉及整合亲和力结合剂发现与其下游表征的高通量方法。已经惊人地显示 所述高通量方法节约大量的时间和工作。因此，从文库筛选、结合剂选择到结合剂表征的整 个过程可为流线型的，同时显著加速亲和力结合剂发现和表征的步伐。在实践中，本发明的 高通量方法在商业上在亲和力试剂发现方面是符合需要的，并且可应用到各种展示平台， 包括菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示以和其他展示系统。
[0025] 应理解，上述一般描述和以下详细描述均仅为示例性和解释性的并且不限制本 文描述的组合物和方法。在本申请中，除非另外明确陈述，否则使用单数包括复数。同 样地，除非另外陈述，否则使用"或"意指"和/或"。类似地，"包含（comprise) "、"包含 (comprises) "、"包含（comprising) "、"包括（include) "、"包括（includes)" 和"包括 (including) "并不旨在限制性的。应理解，本文中描述的本发明的方面和实施方案包括由 方面和实施方案组成和/或主要由方面和实施方案组成。
[0026]
[0027] 为了方便起见，在此集中了在说明书、实施例和附加权利要求书中采用的某些术 语。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域一般 技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0028] 本文所使用的下列术语和措辞旨在具有下列含义：
[0029] 冠词"一（a/an) "在本文中用来指代冠词的语法对象中的一个或一个以上（即， "至少一个"）。举例来说，"要素"意指一个要素或多于一个要素。
[0030] "宿主群体"意指可向其中引入多核苷酸的文库并将其展示的一组宿主。所述宿主 可为噬菌体、酵母、细菌或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，可使用来自单一培养物的细 胞群体，即其中在所述群体中的各个细胞具有相同细胞类型。供选地，也可使用细胞的混合 培养物。细胞可为粘附物，即，细胞生长附着到固体底物，或供选地，细胞可处于悬浮中。哺 乳动物细胞可为来源于原发肿瘤的细胞、来源于转移性肿瘤的细胞、原代细胞、已经丧失接 触抑制作用的细胞、转换的原代细胞、不朽的原代细胞、可经历细胞凋亡的细胞及来源于其 的细胞系。
[0031] 本文使用的术语"约"意指在20%内，更优选在10%内且最优选在5%内。
[0032] 术语"亲和力结合剂"、"结合剂"和"结合蛋白"可互换地用以指与另一蛋白或分 子具有特异性或一般亲和力的肽链。在结合可行时，使蛋白质接触以形成复合物。在宿主 的表面上表达的本发明的亲和力结合剂可优选为抗体、抗体的片段或衍生物、蛋白质或肽。 如果抗体或肽在与其结合其他物质相比以更大的亲和力、亲和力、更容易地和/或以更久 的持续时间结合抗原或靶标，则所述抗体或肽"亲和力结合"、"特异性结合"或"优先"结合 所述抗原或靶标。通过阅读这个定义应理解，例如，特异性或优先结合第一靶标的抗体或肽 可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。因此，"亲和力结合"、"特异性结合"或"优先 结合"并不一定需要（尽管其可包括）排外的结合。在一些实施方案中，"特异性结合"意 指蛋白对于特定的抗原或表位表现出明显的亲和力，并且通常没有表现出显著的交叉反应 性。结合"没有表现出显著的交叉反应性"的蛋白的抗原为不会可观地结合除其靶标外的 实体（例如，不同表位或不同分子）的抗原。对特定表位具有特异性的抗原特异性蛋白例 如将不会与在相同蛋白或肽上的远距表位显著地交叉反应。特异性结合可根据用于测定所 述结合的任何本领域认可的方法测定。优选地，特异性结合根据Scatchard分析和/或竞 争性结合测定