噬菌体的p3融合蛋白作为淀粉样蛋白结合剂的用图
【专利说明】噬菌体的P3融合蛋白作为淀粉样蛋白结合剂的用途
[0001] 本发明涉及包含丝状噬菌体g3p蛋白的淀粉样蛋白结合片段或此类淀粉样蛋白 结合片段的突变体或变体形式的融合蛋白。本发明包括编码此类融合蛋白的核酸分子与构 建体、以此类核酸分子转化的细胞以及以重组方式制备此类融合蛋白的方法。此外，本发明 涉及包含本文所公开的融合蛋白的药物组合物，以及此类组合物治疗性地和预防性地用于 减少与疾病相关联的淀粉样蛋白负荷的用途，所述疾病例如全身性与周边性淀粉样蛋白疾 病、神经退化性疾病包括神经退化性τ病变（tauopathy)和传染性海绵状脑炎变（朊病毒 相关的疾病）。本发明还包括使用此类组合物来预防这些疾病相关联的淀粉样蛋白累积，以 及使用此类组合物作为诊断剂来检测淀粉样蛋白，从而诊断此类疾病。
[0002] 丝状噬菌体M13和相关丝状噬菌体已在蛋白质错误折叠疾病的动物模型中显 示效用，且因此可代表蛋白质错误折叠疾病的潜在治疗剂类型。参见美国专利公开US 2011/0142803,其以引用方式整体并入本文。具体来说，已发现丝状噬菌体具有介导清除大 脑中已形成的淀粉样蛋白的能力。参见例如W02006083795与W02010060073,所述申请以引 用方式整体并入本文。
[0003] M13噬菌体为Ff噬菌体家族成员之一，其具有406个氨基酸的成熟型g3p AenBank Ref Seq NP_510891. 1提供了参考序列，其包含18个残基的氨基端信号序列。相较于公开 的序列具有氨基酸差异的变体很常见。I家族的丝状噬菌体的g3p异于Ff家族成员，但即 便如此，g3p在各家族之间仍为高度保守。Stassen等，J Mol Evol (1992) 34:141-52。
[0004] 已获得 g3p 的晶体结构。Lubkowski 等，Structure (1998) 7 (6) 711-722。所述蛋 白质包含3个折叠结构域，被柔性富含甘氨酸的接头序列分隔开。存在两个氨基端结构域 Nl与N2,其含有262个氨基酸并相互作用以形成N1-N2复合物。羧基端（CT，也称为N3)结 构域含有146个氨基酸且其通过与g8p进行疏水性相互作用使g3p锚泊于噬菌体颗粒中的 g3p〇 Marvin, Current Opin. in Structural Biology (1998)8:150-158。使用 Holliger，J Mol. Biol. (1999)288(4) :649-57中N1-N2结构域融合蛋白2g3p制得的公开可用的带状结 构显示于图1中。
[0005] 不同于多数蛋白质，未折叠的Nl与N2结构域的潜伏性"闭锁"形式为g3p产生其 天然生物活性所必需。Eckert和SchmicU. Mol. Biol. (2007)373:452-461。在感染的初期 步骤中，N2经由其外缘的残基结合于细菌F纤毛。Deng和Perham, 2002。此种N2的初期 结合经由"打开"N1-N2复合物而"开启" g3p，使Nl随后结合于共同受体TolA。在g3p的 N1-N2片段中，初步开启步骤的热转变使N2于48. 1°C的熔融温度（Tm)下发生未折叠。此过 程的一部分涉及Gln212-Pro213肽键的异构化作用。Pro213在开启状态下转化为反式。Nl 仍维持稳定折叠直到第二个步骤，其发生于Tm值60. 2°C。综述于Eckert和Schmid, 2007 中。
[0006] N1-N2片段的突变已被用于研宄多种突变体的稳定性与感染力。Eckert和 Schmid，2007。一种被命名为"3A"的变体会破坏纤毛结合并降低N2结构域的稳定性。在此 突变中，Tm值降至42. 6°C。3A携带下列突变：W181A、F190A以及F194A。N2中另一突变体 G153D会使N2不稳定，使Tm值降至44. 4°C。突变体Q129H会稳定N2,使T M值升至51. 4°C。 Π 变体于铰链区含有突变TlOlI与D209Y并增加 N1-N2片段的稳定性（Tm= 56. 5°C )。 IHY 含有突变 T101I、Q129H 和 D209Y(TM= 60. 1°C )。IIHY 含有突变 T13I、T101I、Q129H 和 D209Y(TM= 61. 8°C )。突变Q129Y与T13I两者皆具有稳定性，而加入这些突变会进一步增 加熔融温度（Tm)。噬菌体感染力的变化与g3p内结构域相互作用的强度成反比。Eckert和 Schmid, 2007。删除N2结构域（噬菌体fd ( Δ N2))因解除N2结构域对Nl与TolA之间结 合的阻断效应而增加感染力。请参照同上。
[0007] 近来，g3p还介导丝状噬菌体与淀粉样蛋白的结合，其作用方式类似于噬菌体感染 细菌的过程。WO 2013/082114公开了噬菌体g3p可直接结合于淀粉样蛋白纤维，而所述噬 菌体介导的去凝集取决于此初始结合步骤。认识到g3p负责丝状噬菌体介导的淀粉样蛋白 的结合，这为新类型的治疗剂与诊断剂提供了基础。本发明提供此类治疗与诊断组合物，以 及使用其检测、诊断、治疗、预防或延迟淀粉样蛋白凝集相关联的疾病与病症的发生。
[0008] 本发明的其它目的和优点是部分于下面的说明中列出，且自说明显而易见，或可 通过本发明的实践而习得。本发明的目的和优点将借助在所附权利要求书中特别指出的要 素和组合来实现和达到。应理解，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且不限 制要求保护的本发明。
[0009] 附图简述
[0010] 图1显示g3p的Nl与N2结构域和铰链区的带状结构。
[0011] 图2A-2C显示不同来源的g3p的比对。图2A为噬菌体M13(SEQ ID N0:l)、fd(SEQ ID N0:2)和fl(SEQ ID N0:3)的g3p的比对，包括共同序列（SEQ ID N0:4)在内。图2B显 示噬菌体12-2 (SEQ ID NO: 5)和Ike (SEQ ID NO:6)的g3p的比对，以及12-2与Ike之间 的共同序列（SEQ ID N0:7)。图2C显示噬菌体If的g3p氨基酸序列（SEQ ID N0:8)。
[0012] 图3A和3B显示噬菌体结合作用的表面等离子共振（SPR)研宄。利用IO14个噬菌 体/mL流经生物传感器芯片来进行结合于A β原纤维与结合于A β单体的比较。图3B显 示从图3Α中所示的SPR数据计算出的Ka、Kd和K D。
[0013] 图4A和4B显示结合作用的研宄。图4A显示随着fA0 42摩尔量的增加，两个噬 菌体剂量（1011个/mL和10 12个/mL)的直接结合测定。图4B是结合竞争研宄，并提供了测 定M13结合的Kd值的备选方式。其使用构建体1。
[0014] 图5显示在淀粉样蛋白纤维结合竞争测定中使用热变性（方形；于90°C下10分 钟）与天然构象（圆形）的M13(构建体1)的结合竞争作用的结果。
[0015] 图6显示使用在存在或不存在2个浓度的M13噬菌体（构建体1)时孵育的fAf3 42 的硫代黄素 T(ThT)荧光测定。
[0016] 图7A和7B显示于ThT去凝集测定中改变个别测定参数的影响。图7A显示于两 个盐浓度（0. 15M与I. 5M)存在下的去凝集百分比。图7B显示于两个温度（4°C与37°C ) 下fAf3的剩余百分比。其使用构建体1。
[0017] 图8A和8B显示使用fA|3 42的M13淀粉样蛋白结合测定。在图8A中，使用18°C 至58°C的孵育温度达3小时以报告M13结合作用。图8B显示在37°C与50°C下孵育的结合 动力学。
[0018] 图9A-9C显示以蛋白水解方式移除g3p对噬菌体-淀粉样蛋白相互作用的影响。 利用蛋白酶Arg C自Ml3噬菌体剪去g3p (Ml3 Λ g3p)。图9A显示使用Ml3 Λ g3p噬菌体相 较于天然（其处理方式与经Arg C处理的噬菌体相同，但未进行蛋白酶处理）噬菌体的Αβ 结合竞争研宄的结果。图9Β显示相较于天然·菌体，Arg C处理对于Μ13 Δ g3p 菌体感 染力的影响。图9C在去凝集测定中比较Arg C处理的噬菌体与天然噬菌体。
[0019] 图IOA和IOB显示使用g3p的N1-N2片段（此处称为重组可溶性 NlN2(rs-g3p(NlN2)构建体 3"））、M13Ag3p (经 Arg C 处理）和 M13 作为经标记的 M13 的竞争剂结合至fAf3 42的结合竞争测定结果。图IOB显示竞争测定的重复结果。
[0020] 图11显示噬菌体fd、IIHY、AAA和M13的竞争作用数据。噬菌体fd、AAA和IIHY 在50°C下经预活化1. 5小时，随后在37°C下孵育45分钟期间比较了经活化与未经活化的 FcU AAA与IIHY竞争经标记的M13结合A β的能力。
[0021] 图12Α显示rs-g3p(NlN2)(构建体3)的示意图。图12Β显示rs-g3p(NlN2)的离 子交换谱图。图12C显示使用Sephacryl S-300和rs-g3p(NlN2)的凝胶过滤测定的结果。 图12D显示rs-g3p (N1N2)以及g3p和g8p对照的蛋白质印迹。使M13噬菌体在泳道1和2 中运行作为阳性对照，并以多克隆抗-M13抗体检测，其可检测g8p和g3p。经纯化的rs-g3p 在泳道3和4中运行，并以相同的多克隆抗-M13抗体检测。
[0022] 图13显示使用rs-g3p (N1N2)(构建体3)的SPR数据。rs-g3p (N1N2)可有效结合 fA β 42, Kd为约160nM，但不与单体结合。
[0023] 图14显示用于测量指定样本中存在的淀粉样蛋白的ThT荧光测定。在存在或不 存在5种浓度的rs-g3p(NlN2)(构建体3)时，将ΙΟμΜ Αβ42单体在37°C下孵育3天。，通 过将结合后的ThT荧光量化来测量在3天结束时所形成的纤维量。IC5tl为约20nM，这表明 rs-g3p(NlN2)可有效抑制Αβ42纤维的形成。本图还表明，结合作用具有剂量依赖性。重 复的实验显示，IC5tl介于20ηΜ与IOOnM之间。
[0024] 图15Α显示在存在或不存在rs-g3p(NlN2)(构建体3)时孵育fA0 42的透射电子 显微照相（TEM)结果。图15B显示使用于37°C下孵育7天的Αβ 42和2 μΜ rs-g3p(NlN2) (构建体3)的ThT荧光测定结果。rs-g3p(NlN2)阻断fAf3 42的形成。
[0025] 图16证实rs_g3p (N1N2)(构建体3)可有效抑制α -突触核蛋白纤维的形成。通 过在37°C下以300rpm搅拌4天以使25μΜ的α-突触核蛋白聚集（参见，条柱1)。图上 的条柱2代表于37°C下振荡3天的α -突触核蛋白单体加上lx KT13的五聚Μ13噬菌体。 条柱2中所示的结果表明，五聚Μ13可阻断α-突触核蛋白纤维聚集。图上的条柱3代表 α -突触核蛋白单体+83nMrsg3p单体。条柱3中所示的结果表明，在抑制α -突触核蛋白纤 维形成方面，单体的功效较五聚Μ13差。条柱4为阴性对照，其显示时间点为零时的α-突 触核蛋白单体。在条