而构造的DNA构建体提供增强的表达和琥珀型抑制，如图7和实例2中所例示的。
[0243] 适当地，本发明的DNA构建体包含tRNApyl基因的2至60个重复序列。优选地， 该DNA构建体包含2至30个重复序列，更优选地8个重复序列。
[0244] 在5，启云力子元件下表达的具有基因内polIII启云力子的tRNApyl
[0245] 通过结构性基因内A-盒和B-盒序列的突变来增强功能性tRNApyl的转录，从而 产生功能性琥珀型抑制的成功的缺乏导致本领域的研究者将DNA构建体工程化，其中将仅 使用基因外序列来增加tRNApyl基因的转录，如以上所报道的。
[0246] 发明人现在已经将结合上游启动子元件和基因内启动子元件的新型且改进的启 动子元件工程化。
[0247] 某些真核RNA基因在杂合聚合酶III启动子或4型启动子下表达，这些启动子包 含polIII/3型种类的启动子中典型的上游启动子元件（例如U6或H1启动子中使用的 TATA盒），或还可能包含与3型启动子序列不相关的序列，以及polIII/2型启动子中典型 的基因内启动子元件（例如tRNA启动子中使用的A-盒和B-盒）。
[0248] 适当地，本发明中利用的上游启动子元件选自SEQIDNo12、20、26、57、58、59、 60、61、62、63、64或65中鉴定的7SL(SRP)RNA基因、穹窿体RNA基因、EB病毒编码的小 RNA(EBER)的启动子。
[0249] 适当地，本发明的上游启动子元件分离自哺乳动物基因，优选地人或鼠基因、最优 选地人，如在SEQIDNo12、20或26中。
[0250] 适当地，启动子序列含有募集转录因子的功能性元件，这些转录因子调控由 PolIIIRNA聚合酶进行的转录，如图1E中所示（SEQIDNo:69-71)。
[0251] 因此，7SL启动子含有位于转录起始位点上游43_51bp处的活化转录因子（ATF) 或环AMP应答元件（CRE)结合位点（tgacgtcac)。启动子还含有在TSS上游20-31bp处的 TATA样序列，称为ETAB序列（ttctagtgct)。
[0252] 穹窿体启动子含有位于TSS上游23_53bp处的近侧序列元件（PSE) (tgacgtaggtctttctcaccagtca)(SEQIDNo:75)并且还是环AMP应答元件（CRE)的变体。 此外，穹窿体启动子含有在TSS上游16-22bp处的TATA盒（tataat)。
[0253] EBER启动子含有三个调控区：TSS上游76_55bp处的SP1结合位点 (gcacgcttaaccccgcctaca)(SEQIDNo:76)、TSS上游 55_36bp处的ATF结合序列 (accgtgacgtagctgttta)(SEQID1^〇:77)、以及135上游28-2]^口处的1厶1厶样盒(^3七38&区）。
[0254] 在本发明的上下文中，与仅含有重构的基因内启动子的tRNApyl相比，并且与WT tRNApyl相比，7SUEBER、穹窿体RNA的上游启动子元件与tRNApyl基因内的重构的基因内 启动子（A-盒和/或B-盒）的组合已证明改善这种tRNA的琥泊型抑制功能，如图8和实 例3中所示。
[0255] 适当地，将SEQIDNo12的7SL启动子与SEQIDNo9的B-盒突变组合，如在 SEQIDNo15的构建体中。
[0256] 可替代地，将SEQIDNo12的7SL启动子与SEQIDNo10的A-盒和B-盒突变 组合，如在SEQIDNo18的构建体中。
[0257] 本发明的优选DNA构建体包含通过间隔子与转录起始位点分开的上游启动子元 件。适当地，该间隔子序列含有转录起始位点和从启动子序列的末端至tRNA编码序列起始 点的4-6个核苷酸。
[0258] 本发明的DNA构建体包含置于tRNApyl编码序列3'的下游终止位点，其中所述终 止位点通过小的聚胸腺嘧啶核苷（4-6)序列传导聚合酶III转录终止的信号。本发明的优 选终止子序列列出为SEQIDNo19。
[0259] 在直核tRNA基闵下作为双顺反子信息表汰的tRNApvl
[0260] 向井等人，2008和EP1992698描述了真核tRNA(tRNAval)基因下游的tRNApyl基 因如何导致tRNApyl的次优表达，这并不理想，因为表达水平过低而不能在哺乳动物细胞 中进行最优琥珀型抑制。
[0261] 发明人惊讶地发现，其中tRNApyl编码序列可操作地连接至真核tRNA基因如 tRNAglu或tRNAasp的DNA构建体（图1A)导致最优的tRNApyl基因产物表达以及琥珀型 抑制，如图11和实例4中详细描述的。
[0262] 适当地，本发明的tRNApyl基因在真核宿主细胞中表达为双顺反子信息。
[0263] 适当地，真核tRNA基因缺乏3'终止子序列，从而允许在真核RNA聚合酶III2型 启动子下发生tRNApyl基因的表达。
[0264] 因此，通过间隔子序列将第一tRNA与第二tRNA分开，该间隔子序列由缺乏构成转 录终止信号的胸腺嘧啶核苷核苷酸的序列组成。
[0265] 示例性的间隔子序列在SEQIDNo47和54中示出。
[0266] 优选地，可操作地连接至tRNApyl编码序列的真核tRNA基因为SEQIDNo41、49、 55或56的哺乳动物tRNAglu或tRNAasp基因；更优选地，SEQIDNo41或49的鼠tRNAglu 或tRNAasp。
[0267] 发明人惊讶地发现，当第一tRNA基因前置有5'前导序列时，tRNApyl的表达和琥 珀型抑制是尤其有效的，该5'前导序列含有序列元件如TATA盒、转录起始位点（TSS)、以及 调控前体tRNA的转录后加工以产生成熟tRNA的序列，统称为前导序列。
[0268] 因此，前导序列是转录以产生tRNA前体的一部分的任何哺乳动物tRNA基因的5' 区，该部分将不是成熟tRNA的部分。
[0269] 本发明中使用的尤其优选的前导序列披露于SEQIDNo41和49并且列出为SEQ IDNo44 (tRNAasp)和SEQIDNo52(tRNAglu)。
[0270] 本发明的尤其优选的DNA构建体列出为SEQIDNo42和SEQIDN〇50。
[0271] SEQIDNo42由鼠tRNAglu基因组成，该鼠tRNAglu基因后面跟着缺乏胸腺嘧啶 核苷、连接至tRNApyl基因的间隔区（ccccaaacctc)。因此，SEQIDNo42的构建体转录为 单个整体，该整体经过转录后加工产生成熟tRNApyl。
[0272] SEQIDNo50由鼠tRNAasp基因组成，该鼠tRNAasp基因后面跟着缺乏胸腺嘧啶 核苷、连接至tRNApyl基因的间隔区（tagccccacctc)。因此，SEQIDNo50的构建体转录 为单个整体，该整体经过转录后加工产生成熟tRNApyl。
[0273] 本发明的尤其优选的DNA构建体包括多个拷贝的SEQIDNo42或50的双顺反子 转录单元。
[0274] 因此，尤其优选的DNA构建体包括2、3、4、5、6、7、8个拷贝的SEQIDNo42或50 的转录单元。最优选的DNA构建体为SEQIDNo43,代表3个拷贝的SEQIDNo42的 tRNAglu-pyl双顺反子转录单元，以及SEQIDNo51，代表2个拷贝的SEQIDNo50的 tRNAasp-pyl双顺反子单元。
[0275] 可将本发明的tRNApyl基因引入真核细胞系中。适当地，细胞系为哺乳动物细胞 系。
[0276] 更优选地，细胞系为CH0细胞系，但是也可以是HEK293、PERC6、C0S_l、HeLaVER0、 或小鼠杂交瘤细胞系。
[0277] CH0和HEK293细胞系是尤其适合的。
[0278] PvlRS
[0279] 适当地，将本发明的tRNApyl基因引入到与pylRS基因相关的真核细胞系中。
[0280] 如在此所用，pylRS与氨基酰tRNA合成酶相关，该氨基酰tRNA合成酶将把具有吡 咯赖氨酸或其衍生物的适合的tRNA分子氨基酰化。
[0281] 本发明的pylRS适合地为在真核细胞中正交的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，这些真 核细胞来源于产甲烷古细菌属物种-即，它是产甲烷古细菌属物种中的野生型，或是其突 变体。
[0282] 优选地，本发明的pylRS为来源于以下中的一个的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶：马 氏甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、哈氏脱硫杆菌、乙酸甲烷八叠球菌、布氏甲烷八叠 球菌、嗜热甲烧八叠球菌、织里甲烧咸菌（Methanosalsumzhilinae)、Methanohalobium evastigatum、马氏甲烧嗜盐菌（Methanohalophilusmahii)、瘤胃脱硫肠状菌 (Desulfotomaculumgibsoniae)、Desulfosporosinusmeridei以及醋酸氧化脱硫肠状菌(Desulfotomaculumacetoxidans)〇
[0283] 更优选地，本发明的pylRS为来源于马氏甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酰tRNA合成酶 (pylRS)〇
[0284] 本发明的pylRS可为野生型合成酶。
[0285] 可替代地，本发明的pylRS可在一个或多个位置处突变，例如以便增加其催化活 性和/或改变其对底物氨基酸的选择性（参见例如柳泽2008)。
[0286] 优选地，本发明的pylRS可在对应于Tyr384或其等效物的位置处突变。更优选 地，Tyr384突变成苯丙氨酸。
[0287] 在一个实施例中，本发明的pylRS可在一个或多个位置处突变，以便改变其底物 特异性并且允许（或提高）吡咯赖氨酸类似物的掺入。
[0288] 另外的突变型PylRS酶描述于W0 09038195和W0 2010114615,每个文档全文通过 引用结合在此。
[0289] 由无2密码子编码的非天然氨基酸的掺入
[0290] 在使用本发明的细胞系制备的蛋白质中，可掺入一个或多个nnAA。适当地，将一 个nnAA掺入蛋白质链中。在蛋白质为抗体的情况下，可将一个nnAA掺入轻链或重链或二 者中。
[0291] 在其他实施例中，可将多于一个，例如最多四个，例如两个（或也许三个）nnAA掺 入蛋白质链中。适当地，所有掺入的nnAA均为相同的。
[0292] nnAA适当地由琥?白密码子编码。
[0293] 可由琥珀密码子编码的用于掺入靶蛋白中的非天然氨基酸
[0294] 用于掺入靶蛋白中的非天然氨基酸
[0295] 使用非天然氨基酸以允许将部分缀合至肽披露于W0 2007/130453中，该专利通 过引用结合在此。
[0296] 如在此所用，"非天然氨基酸"是指任何氨基酸、修饰氨基酸、或除硒代半胱氨酸、 吡咯酪氨酸、以及以下二十种α-氨基酸之外的氨基酸类似物：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、 天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。α-氨基酸的通用结构通过 化学式I示出：
[0297]
[0298] 非天然氨基酸典型地为具有化学式I的任何结构，其中R基团为除了二十种天然 氨基酸中所使用的取代基之外的任何取代基。对于二十种天然氨基酸的结构，参见，例如， 任何生物化学教科书，如L.史塞克（L.Stryer)所著的生物化学（Biochemistry)，第3版， 1988,弗里曼公司（FreemanandCompany)，纽约（NewYork)。应注意，在此披露的非天然 氨基酸可为除以上的二十种α-氨基酸之外的天然存在的化合物。因为在此披露的非天然 氨基酸典型地仅在侧链中不同于天然氨基酸，所以非天然氨基酸与其他氨基酸，例如，天然 或非天然的氨基酸形成酰胺键，其方式与在天然存在的蛋白质中形成酰胺键的方式相同。 然而，非天然氨基酸具有将它们与天然氨基酸区分开的侧链基团。例如，化学式I中的R任 选地包括烷基_、芳基_、芳基卤化物、乙烯基卤化物、烷基卤化物、乙酰基、酮、氮丙啶、腈、 硝基、卤化物、酰基 _、酮基_、叠氮基_、羟基_、餅、氛基_、卤代基 _、酰餅、烯基、炔基、酿、硫 醚、环氧化物、砜、硼酸、硼酸酯（boronateester)、硼烷、苯基硼酸、硫醇、硒基_、磺酰基_、 硼酸盐、硼酸酯（boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基-、吡啶基、萘基、二苯甲酮、环炔如 受限的环如环辛炔、环烯如降冰片烯、反式环烯、环丙烯、四嗪、吡喃酮、硫酯、烯酮、亚胺、 醛、酯、硫代酸、羟基胺、氨基、羧酸、α-酮基羧酸、α或β不饱和酸和酰胺、乙醛酰酰胺、或 有机硅烷基团等或其任何组合。
[0299] 除了含有新型侧链的非天然氨基酸之外，非天然氨基酸还任选地包含经过修饰的 骨架结构，例如，如通过化学式II和III的结构所示：
[0300]
[0301] 其中Ζ典型地包括OH、ΝΗ.sub. 2、SH、ΝΗ.sub. 20-、NH-R'、R'ΝΗ-、R'S-、或 S-R'一 ；X和Y，可以是相同或不同的，典型地包括S、N、或0,并且R和R'，任选地是相同或 不同的，典型地选自以上针对具有化学式I的非天然氨基酸所述的R基团的成分的相同列 表以及氢或（CH.sub. 2).sub.X或天然氨基酸侧链。
[0302] 氨基酸类似物的其他例子包括（但不限于）包括以下官能团中的一个的赖氨酸 或吡咯赖氨酸氨基酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、腈、卤代基、肼、酰肼、羟 基、烯基、环烯、炔基、环炔、环炔如受限的环如环辛炔、环烯如降冰片烯、反式环烯、环丙烯、 芳基卤化物、乙烯基卤化物、烷基卤化物、氮丙啶、硝基、羟基、醚、环氧化物、乙烯基醚、甲硅 烷基烯醇醚、硫醇、硫醚、磺酰胺、磺酰基、砜、硒基、酯、硫代酸、硼酸、硼酸酯、硼烷、膦酰基、 膦、杂环基、吡啶基、萘基、二苯甲酮、四嗪、吡喃酮、烯酮、亚胺、醛、羟基胺、酮基、硫酯、酯、 硫代酸、有机硅烷基团、氨基、可光活化的交联剂；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；与另一 个分子共价或非共价地相互作用的氨基酸；金属结合氨基酸；含金属氨基酸；放射性氨基 酸；光笼蔽氨基酸；可光致异构化的氨基酸；含有生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化 或碳水化合物修饰的氨基酸；含酮基氨基酸；包含聚乙二醇的氨基酸；包含聚醚的氨基酸； 重原子取代的氨基酸；可化学裂解或可光裂解的氨基酸；具有伸长侧链的氨基酸；含有毒 性基团的氨基酸。
[0303] 在本发明的一个实施例中，具有以下通用结构的非天然氨基酸（nnAA)用于蛋白 质的生产：
[0305] 优选地，X基团可为亚甲基、烯烃、芳烃、氧、硫、磷、氮、酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸 酯、醚、胺、硫醚、炔、以及杂环。
[0306] 优选地，Y基团可为亚甲基、烯烃、芳烃、氧、硫、磷、氮、酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸 酯、醚、胺、硫醚、炔、以及杂环。
[0307] 优选地，Z基团可为氮、氧、硫、磷、α-亚甲基氨基、α-羟基氨基、α-亚甲基叠氮 基。
[0308] FG基团可为烷基叠氮化物、烷基-炔烃、烷基-烯烃、烷基环己烯、烷基环炔、烷 基芳基卤化物、芳基卤化物、氨基环炔、氨基环烯、反式环烯、环丙烯、四嗪类、吡喃酮类、降 冰片稀、芳基叠氮化物、叠氮基、羟基胺、酰肼、乙烯基卤化物、芳基卤化物、四嗪、吡喃酮、亚 胺、硼酸酯或酸、氰基、羰基如醛或酮。
[0309] 在一个优选的实施例中，具有以上通用结构的非天然氨基酸（nnAA)可具有长度 可变的亚甲基，其中η= 1-12。优选地，具有以上通用结构的非天然氨基酸（nnAA)可含有 环烷烃和芳环作为连接结构的部分。
[0310] 适当地，本发明的nnAA衍生自赖氨酸，如以下结构表中所列出的。不可商购获得 的那些任选地如US2004/138106A1 (通过引用结合在此）的实例中所提供或使用本领域 技术人员已知的标准方法合成。对于有机合成技术，参见，例如，费森登（Fessendon)和 费森登的有机化学（OrganicChemistry) (1982,第二版，威拉德格兰特出版社（Willard GrantPress)，麻萨诸塞州波士顿（BostonMass));玛奇（March)的高级有机化学 (AdvancedOrganicChemistry)(第三版，1985,约翰?威利父子出版公司（Wileyand Sons)，纽约（NewYork));以及凯里（Carey)和桑德博格（Sundberg)的高级有机化学（第 三版，部分A和B，1990,Plenum出版社（PlenumPress)，纽约）、以及W0 02/085923,所用 文献特此通过引用结合。
[0311] 本发明的nnAA可通过所公开的方法合成。例如，（S) -2-氨基-6 ((丙-2-炔基氧 基）羰基氨基）己酸和S)-2-氨基-6 ((2叠氮基乙氧基）羰基氨基）己酸的合成公开于通 过引用结合在此的W0 2010139948和阮（Nguyen)等人2009中。
[0312] 适当地，本发明的nnAA衍生自赖氨酸，如下表中所示，如W0 2010139948中部分地 描述，该专利通过引用结合在此。
[0313] 基于赖氨酸的类似物
[0314]
[0315] 适当地，本发明的nnAA衍生自（2S)-2-氨基-6-羟基己酸，如下表中所列出的。
[0316] 基于6-羟基亮氨酰的类似物
[0317]
[0319] 适当地，本发明的nnAA衍生以包括下表中列出的不同的官能团。这些官能团中的 一些部分地描述于W0 20110442255A1，该专利通过引用结合在此。
[0320] 吡咯赖氨酸类似物
[0321]
[0322] 适当地，推导本发明的nnAA包括适用于无金属环加成化学的不同官能团并且部 分地描述于WO2012104422A1且在下表中列出。
[0323] 吡咯赖氨酸类似物
[0325]
[0326] 具有掺入的非天然氨基酸的蛋白质的位点特异性缀合
[0327] 具有使用根据本发明的方法掺入的非天然氨基酸的蛋白质可用于制备官能化的 蛋白质缀合物。可缀合至具有掺入的非天然氨基酸的蛋白质的分子包括（i)其他蛋白质， 例如，抗体，尤其是单克隆抗体，以及（ii)可导致在系统中的半衰期延长的PEG基团或其他 基团。此外，这些修饰蛋白可缀合至药物或核苷酸，用于这些蛋白质化合物的定向递送。
[0328] 某些实施例的更多细节在抗体药物缀合物的论述中在下文给出。
[0329] 非天然氨基酸可合宜地含有独特的化学基团，从而允许以定向方式缀合，而没有 与其他氨基酸发生副反应的风险。例如，非天然氨基酸合宜地含有叠氮或炔基，从而允许使 用胡伊斯根1，3-偶极环加成反应与有待缀合的分子反应，该分子含有相应的炔烃或叠氮 基团。
[0330] 本发明的另一个方面是一种用于制备化学修饰的靶蛋白的方法，该方法包括根据 本发明的一个方面的方法制备靶蛋白并且对所得靶蛋白化学修饰。
[0331] 本发明的优选缀合化学包括与天然的二十种氨基酸正交的反应。此类反应不相互 作用或导致与天然的20种氨基酸的副反应，它们对于与反应相关的官能团是特异性的。适 当地，通过nnAA将必要的官能团掺入革E1蛋白中。
[0332] 此外，所述反应在对该蛋白质没有破坏性的条件，例如水性条件下进行，其中pH 范围对于该蛋白质是可接受的且维持其溶解度，所处的温度不导致对该蛋白质的有害作 用。
[0333] 增加在该蛋白质与接头之间的附接部分的稳定性可为有利的。常规方法通过与马 来酰亚胺反应形成硫醇醚来缀合至半胱氨酸的硫醇基团。硫醇醚可发生逆反应，从而释放 衍生自抗体的接头药物。在本发明的一个实施例中，在叠氮化物与炔烃之间采用的缀合化 学产生芳族三唑，芳族三唑是显著更稳定的且不那么容易产生可逆性。
[0334] 此外，反应的产物，即在蛋白质与有效载荷之间的键联应为稳定的，等于或大于与 常规键联（酰胺、硫醇醚）相关的稳定性。虽然不是缀合的障碍，但是如果缀合反应可以在 天然条件下进行的话，通常是有利的，因为这将消除额外的重折叠加工步骤。
[0335] 对于本发明的缀合物的产生优选的化学缀合包括：3+2炔-叠氮环加成反 应；3+2偶极环加成反应；基于钯的偶联，包括赫克反应（Heckreaction);菌头偶联 反应（Sonogashirareaction);铃木反应（Suzukireaction);施蒂勒偶耳关(Stille coupling);桧山偶联反应（Hiyama/Denmarkreaction);稀经复分解；狄尔斯-阿尔德反 应（Diels-alderreaction);与肼、酰肼、烷氧基胺或羟基胺的羰基缩合；应变促进的环 加成反应（strainpromotedcycloaddition)，包括应变促进的叠氮-炔环加成反应；金 属促进的叠氮-炔环加成反应；电子促进的环加成反应；片段挤出环加成反应（fragment extrusioncycloaddition);稀经环加成反应，之后进行b-消除反应。
[0336] 根据一个优选实施例，所掺入的氨基酸含有叠氮或炔基并且化学修饰的过程包括 使所述叠氮或炔基与包含炔或叠氮基的试剂反应。设想的反应是胡伊斯根1，3-偶极环加 成反应，该反应导致产生三唑键联。包含炔或叠氮基的试剂可为蛋白质（例如抗体）或毒 素或细胞毒性药物或适用于半衰期延长的物质（例如PEG基团），该试剂任选地通过接头携 带炔或叠氮基。
[0337] 在所述反应中使用的炔基为例如端炔、环辛炔如双环[6. 1. 0]壬-4-炔、二苯并环 辛炔、以及二氟环辛炔部分。
[0338] 在一个变型反应中，所掺入的氨基酸含有叠氮或烯基并且化学修饰的过程包括使 所述叠氮或烯基与包含烯或叠氮基的试剂反应。包含烯或叠氮基的试剂可为蛋白质（例如 抗体）或毒素或适用于半衰期延长的物质（例如PEG基团），该试剂任选地通过接头携带炔 或烯基。
[0339] 当将多于一个nnAA掺入到靶蛋白（例如抗体）中时，化学修饰可为相同或不同 的。例如，如果掺入两个nnAA，那么一个可以被修饰以缀合至药物部分并且一个可以被修饰 以缀合至PEG部分。
[0340] 在一个实施例中，本发明的缀合化学用于制备抗体药物缀合物。
[0341] 靶蛋白
[0342] 靶蛋白包括抗体。
[0343] 本发明的抗体包括针对以下的全长抗体和包括Fab、Fab2的抗体片段、以及 单链抗体片段（scFvs) :TR0P-2、SSTR3、B7Sl/B7x、PSMA、STEAP2、PSCA、PDGF、RaSL、 C3OT3、EpCam、TMCC1、VEGF/R、连接蛋白-30、CA125(Mucl6)、信号素-5B、ENPP3、EPHB2、SLC45A3 (PCANAP)、ABCC4 (MOAT-1)、TSPAN1、PSGRD-GPCR、⑶2、EGFR(Herl)、TMEFF2、CD74、 CD174(leY)、Muc-1、CD340(Her2)、Mucl6、GPNMB、Cripto、EphA2、5T4、间皮素、TAG-72、 CA9 (IX)、a-v-整联蛋白、FAP、Tim-1、NCAM/CD56、α叶酸受体、CD44v6、硫酸软骨素蛋白聚 糖、CD20、CA55. 1、SLC44A4、RON、CD40、HML24、CS-1、β2 微球蛋白、CD56、CD105、CD138、 LewisY、GRNMP、Tomoregulin、CD33、FAP、CAIX、FasL受体、ΜΜΡ基质金属蛋白酶。
[0344] 在本发明的一个优选的实施例中，将针对肿瘤靶标的本发明的抗体缀合至选自 以下的蛋白质部分：免疫刺激性和促凋亡蛋白，尤其是免疫刺激物如IL-la、IL-Ιβ、其 他IL-1家族成员，白细胞介素中的任一个，包括但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-12、IL-13、IL-15、IL-17 家族、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-28,或共刺激配体如Β7· 1 和B7. 2、TACI;干扰素，如I型IFN家族（IFNa和β以及λ)或II型IFNy中的任一个；造 血生长因子，如GM-CSF;趋化因子，包括CXCL-1、CXCL-2、CXCL-5、CXCL-6、CXCL-8、CXCL-9、 CXCL-10、以及CXCL-11