专利名称：一种洋葱假单胞菌基因工程菌的构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及脂肪酶基因工程菌的构建 方法。
背景技术：
在能源危机越演越烈的今天，寻找高效、清洁的可再生能源是一项极 为重要和迫切的任务，而利用废弃动、植物油脂转化生产生物柴油无疑是 最有效、最直接的办法。目前生物柴油转化主要有化学法和酶法两种，其 中化学法能耗高、污染大；酶法则具有反应条件温和、无污染等优点，是 解决能源危机的有效途径。
酶法制备生物柴油的工艺中，脂肪酶的成本最高是制约工艺进一步发 展的主要瓶颈之一，不同来源脂肪酶制备生物柴油的效率和得率也不同。 研究表明洋葱假单胞菌脂肪酶在众多脂肪酶中能够催化的反应类型最多， 反应活性和稳定性最高，对酸、碱、短链醇等物质的耐受性最高(Jaeger K E，Eggert T， lipases for biotechnology. 2002)，是生物柴油制备工艺中 最理想的催化酶。然而，洋葱假单胞菌脂肪酶需要在其本身分子伴侣的帮 助下才能正确表达，它的分泌还和胞内Dsb复合体等十几个蛋白质有密切 关系，由于缺乏相应的表达和分泌机制，洋葱假单胞菌脂肪酶的异源表达 往往没有活性，即便体外复性，效率和产量也非常低。但是脂肪酶产生菌' 本身也存在代谢调控机理不明确、产酶量低、表达不稳定等问题。因此只 有通过分子生物学手段构建洋葱假单胞菌脂肪酶同源表达菌株才能从根本 上解决上述问题。
T7大肠杆菌表达系统是非常成熟的重组蛋白表达系统，它包括T7 RNA 聚合酶和一个能被T7RNA酶驱动的T7启动子。该系统严格依赖T7 RNA聚 合酶对其特有启动子T7启动子的特异选择性，T7启动子完全专一受控于 T7 RNA聚合酶(Tabor and Richardson, 1985)，而高活性的T7 RNA聚合
酶合成mRNA的速度比一般RNA聚合酶快5倍，几乎所有的细胞资源都用于 表达目的蛋白。基于T7RNA聚合酶的专一选择性和优越转录能力，Stidier 等人(Studier,Moffatt, 1986)首先在大肠杆菌BL21 (DE3)中建立起一 套受LacUV5启动子调控的T7表达系统。该系统在世界范围内得到非常广 泛的应用，成为大肠杆菌中高效表达重组蛋白的首选。Elaine等人(Elaine Brunschwig， Aldis Darzins， 1992)在铜绿假单胞菌中利用7ac〃K5/7a79 构建的T7表达系统也得到普遍应用。此外Barnard等人(Barnard et a丄， 2004 )在罗尔斯通氏菌也构建了 T7表达系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种洋葱假单胞菌基因工程菌的构建方法，得 到的基因工程菌具有较高的表达量和催化活力，并且具有较好的低碳醇耐 受性以及耐高温性。
一种洋葱假单胞菌基因工程菌的构建方法，具体如下
(1) 采用同源重组方法去除洋葱假单胞菌G63基因组中原有的脂肪酶 基因及其伴侣基因，同时导入T7 RNA聚合酶基因，获得能够表达T7 RNA 聚合酶的洋葱假单胞菌重组菌；
(2) 将目的基因克隆到含有T7启动子和Lacl阻遏蛋白的表达质粒中；
(3) 将质粒导入洋葱假单胞菌重组菌，得到洋葱假单胞菌基因工程菌。 所述步骤(2)中的目的基因为洋葱假单胞菌脂肪酶及其伴侣基因或者
a淀粉酶基因或者纤维素酶基因。
本发明构建的同源重组菌染色体上原有的脂肪酶及其伴侣基因被T7 RNA聚合酶基因替换，因此同源重组菌没有任何脂肪酶背景，可以方便应用 于脂肪酶高通量筛选。而表达载体上位于T7启动子后的脂肪酶基因也受到 Ucl阻遏蛋白的负调控。因此认为，本发明的洋葱假单胞菌脂肪酶工程菌 是受双重调控的良好表达系统。
培养该基因工程菌，在菌种密度达到一定程度时，加入相应的诱导物
使脂肪酶基因开始表达并获得洋葱假单胞菌脂肪酶。优选分批发酵方法培 养该工程菌，发酵结果显示工程菌的酶活比原始菌提高4倍以上。
由此可见，本发明构建的工程菌具有较高的表达量和催化活力，并且 具有较好的低碳醇耐受性以及耐高温性，可以用来大量生产脂肪酶，具有 工业实用性。
图1为重组菌的生长曲线示意图。
图2为基因工程菌的质粒稳定性曲线示意图。
具体实施例方式
本发明中的目的基因可以是洋葱假单胞菌脂肪酶及其伴侣基因，或者 a淀粉酶基因或者纤维素酶基因，只要目的基因受T7启动子调节，都可在
本发明构建的洋葱假单胞菌重组菌中进行高效表达。下面结合实施例对本 发明作详细说明。
实例l:脂肪酶基因工程菌的构建。 1、同源重组工程菌的构建 1)相关基因的克隆
采用PCR方法扩增T7RNA聚合酶基因、脂肪酶基因上游区段(同源 重组区段基因1)和脂肪酶基因下游区段(同源重组区段基因2)、 Tmp 抗性基因、脂肪酶及其伴侣基因。 T7 RNA聚合酶基因的引物
上游引物5， CTT CTGCAG ATGAACACGATTAACATCGCT 下游引物5 ， CTTCTGCAG TTACGCGAACGCGAAGTCCGA 同源重组区段基因1的引物
上游引物5， CTTGCGGCCGC AGCATCGCTACGCGCTGAAC
下游引物5， CTTCTGCAG GCATGTTCTCCTGATTATTG
同源重组区段基因2的引物
上游引物5， CTTCTGCAG AGATGTTGCTCGATGGTG
下游引物5， CTTCTCGAG GTGATCTACGTCGGCAGTCT TMP抗性基因的引物
上游引物5， CTTAGATCTCACGAACCCAGTTGACATAAG 下游引物5， CTTAGATCTTTAGGCCACACGTTCAAG
每100uL PCR反应体系为10uL缓冲液，2.5腿ol/L Mg2+ ，上游、 下游引物均为20pmo1， dNTP 0. 2誦ol/L， DNA聚合酶5 U，模板DNA约20 ng (试需要添加5X的DMS0)。
以洋葱假单胞菌(P.c印acia) G63基因组DNA为模板扩增同源重组区 段基因1和2、脂肪酶及其伴侣基因。同源重组区段基因扩增条件95。C预 变性4分钟，94。Cl分钟，53'C45秒，72°C 30秒，30个循环，最后72°C 延伸10分钟。
以大肠杆菌BL21 (DE3)基因组DNA为模版，扩增T7 RNA聚合酶基因。 扩增条件94。C预变性4分钟，94。Cl分钟，54。Cl分钟，72°C3分钟，30 个循环，最后72'C延伸10分钟。
以质粒pBBRlTp为模版，扩增T即抗性基因。扩增条件94力C预变性4 分钟，94。C30秒，54。C30秒，72。C45秒，30个循环，最后72。C延伸10分 钟。
2)自杀质粒PJQUDT7Tp的构建
PCR扩增的片段经凝胶纯化后与PMD18T载体连接，分别得到如下载体 区段l的上游引物加入NotI酶切位点，下游引物加入PstI酶切位点，PCR 扩增后克隆入PMD18simpleT，得到载体PMD叩。
区段2的上游引物加入Pstl酶切位点，下游加入Xhol酶切位点，PCR 扩增后克隆入PMD18si即leT，得到载体PMDdown。
T7RNA聚合酶基因的上游和下游扩增引物都加入Pstl酶切位点，PCR 扩增后克隆入PMD18si即leT，得到载体PMDT7。
Tmp抗性基因上游和下游扩增引物都加入BglII酶切位点，PCR扩增后 克隆入PMD18si即leT载体，得到载体PMDtp。
将载体PMDup用Notl、 Pstl同时酶切后回收500bp的小片段，同样PMDdown用Pstl酶、Xho1酶同时酶切回收500bp片段，把得到的两个500bp 片段用T4 DNA连接酶连接过夜。
取连接产物做模版，同源重组区段基因1上游引物作为上游引物，同 源重组区段基因2下游引物作为下游引物PCR。然后把lOOObp的产物克隆 到PMD18simpleT载体上，得到载体PMDUD。 PMDUD通过Notl酶、Xhol酶同 时酶切后连入自杀质粒PJQ200sk，得到载体PJQUD。用Pstl酶切PMDT7回 收2.7Kb的片段，并将该片段克隆到PJQUD相应的酶切位点中，通过测序 挑选出T7RNA聚合酶基因正向插入的克隆子命名为PJQUDT7。将PMDTp载体 用BglII酶切后，回收纯化700bp的片段克隆到PJQUDT7的BglII位点上， 得到PJQUDT7Tp。通过上面的步骤我们把同源重组区段基因1、 T7RNA聚合 酶基因、同源重组区段基因2依次放入PJQ200sk自杀质粒的多克隆位点中 并将质粒的抗性改为Tmp。
3)利用同源重组构建含T7RNA聚合酶基因的洋葱假单胞菌菌株。 将PJQUDT7Tp导入洋葱假单胞菌，在抗生素Tmp的作用下只有抗性基 因整合到基因组上的菌株才能存活。然后用10%蔗糖进行第二次筛选，最 终得到两次交换的T7脂A替换整合型洋葱假单胞菌。
2、 表达载体的构建
以P. c印acia G63 genome DNA为模板，通过PCR扩增获得脂肪酶及其 伴侣基因基因。 引物为
上游引物5， AAA GGATCCAGCCAAATCGATGCGTTCCAG
下游引物5， CTTAAGCTTACGCGGCGACACCCGGGTCA
上游引物加入Xbal酶切位点，下游引物加入HindIII酶切位点，PCR 扩增产物用Xbal、 HindIII同时酶切后克隆到表达载体PBBR22b中，得到 PBBR22LipAB。
3、 表达载体转化洋葱假单胞菌。
采用电穿孔法，将PBBR22Lipab表达质粒导入含T7RNA聚合酶基因的
洋葱假单胞菌菌株中，得到脂肪酶表达工程菌。 详细步骤如下
(1)制备洋葱假单胞菌感受态细胞-
① 取7ml过夜培养的洋葱假单胞菌菌液接种于50ml LB—培养基，30 °C培养至0D600二0.8后离心收集菌体。
② 用lmMMgcl2+lraMHEPES溶液清洗菌体2次。
③ 把菌体重悬在0. 8毫升冰冷的lraMMgcl2+lmMHEPES溶液，放置于冰上。
(2)电穿孔细胞
< I >取5 u 1质粒PBBR22Lipab (lug)加到100 u 1洋葱假单 胞菌感受态细胞中用移液器轻轻地搅拌，并将混合物转移至0.2 mm的电转 化杯中。
(II) 把电转杯上的水分擦掉后放入插槽，然后将插槽转入电转化仪。
(III) 选择模式原核生物，设置参数电压2400 v ，时间5ns后进行 电击。电击后立即添加lml电转液温浴2小时。
(IV) 取IOOp 1细胞涂布于氯霉素抗性的平板上28。C培养至有菌落长出。
(V) 用PCR的方法检测脂肪酶基因是否导入洋葱假单胞菌中，由此 得到的菌种称为P.cG63 (T7)。
4、 质粒稳定性检测
图1为重组菌的生长曲线，在30。C下重组菌在LB培养基中生物的代时 (G)为30. 3分钟；从延滞期到稳定期的时间约为9小时。图2为基因工程 菌的质粒稳定性曲线，重组工程菌经过5次连续转接培养(每次转接间隔9 h) 后，质粒保持率为82.6%。可见，该工程菌能够耐受连续转接放大培养， 适于规模化生产。
5、 工程菌的摇瓶发酵与酶活测定
将活化后的工程菌接种到种子培养基中制备种子液，然后转接到发酵 培养基中摇瓶发酵，测定工程菌的发酵酶活力。
以水解橄榄油每分钟产生1 umol游离脂肪酸所需的酶定义为一个活
力单位(U)。测定采用碱式滴定法测定发酵酶活力。结果显示，12小时后工
程菌发酵液中即可明显检测出酶活，48小时后酶活增加迅速，60小时后脂 肪酶酶活达到最大达到96. 35与原始菌21. 3相比提高4. 5倍。 实例2:重组菌适合于受T7启动子调节的a -淀粉酶基因的表达
1、 a-淀粉酶基因的获取
引物
上游引物5， AAAGGATCC ACC ATC CTT CAT GCC TGGA 下游引物5， CTTAAGCTT TTA ATG AGG AAG AGA ACC CGCT 以枯草芽孢杆菌XL-15 genome DNA为模板，经PCR扩增获得a-淀粉 酶基因。上游引物加入XbaI酶切位点，下游引物加入Hindin酶切位点， PCR扩增产物用Xbal、 HindIII同时酶切后克隆到表达载体pBBR22b中，得 到pBBR22 AMY。
2、 a-淀粉酶表达载体转化洋葱假单胞菌。
将pBBR22 AMY表达质粒导入构建的含T7RNA聚合酶基因的洋葱假单胞 菌菌株中，得到a-淀粉酶表达工程菌。详细步骤与实例1步骤类似。
经发酵液a -淀粉酶酶活测定，10小时后工程菌发酵液中即可明显检测 出酶活，50小时后脂肪酶酶活达到最大达到66. 5与原始菌30. 3相比提高 2倍多。
权利要求
1、一种洋葱假单胞菌基因工程菌的构建方法，具体如下(1)采用同源重组方法去除洋葱假单胞菌G63基因组中原有的脂肪酶基因及其伴侣基因，同时导入T7 RNA聚合酶基因，获得能够表达T7 RNA聚合酶的洋葱假单胞菌重组菌；(2)将目的基因克隆到含有T7启动子和LacI阻遏蛋白的表达质粒中；(3)将表达质粒导入洋葱假单胞菌重组菌，得到洋葱假单胞菌基因工程菌。
2、如权利要求1所述的一种洋葱假单胞菌基因工程菌的构建方法， 其特征在于，所述步骤(2)中的目的基因为洋葱假单胞菌脂肪酶及其伴l 基因或者a淀粉酶基因或者纤维素酶基因。
全文摘要
本发明提供一种洋葱假单胞菌基因工程菌的构建方法，将T7 RNA聚合酶基因替换洋葱假单胞菌G63基因组中脂肪酶及其伴侣基因，使T7 RNA聚合酶基因整合到洋葱假单胞菌基因组中并位于脂肪酶启动子的调控之下。然后将洋葱假单胞菌脂肪酶及其伴侣基因克隆到含有T7启动子和LacI阻遏蛋白的表达质粒中，最后把质粒导入洋葱假单胞菌重组菌中得到洋葱假单胞菌脂肪脂肪酶超级工程菌。本发明对洋葱假单胞菌G63进行基因改造，获得了的超级工程菌基具有较高的表达量和催化活力，并且具有较好的低碳醇耐受性以及耐高温性。
文档编号C12N15/56GK101358195SQ20081004812
公开日2009年2月4日 申请日期2008年6月23日 优先权日2008年6月23日
发明者云 刘, 莉 徐, 杨江科, 彬 贾, 闫云君 申请人:华中科技大学