专利名称：：一种用于筛选定向进化突变酶的快速质粒营救法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及的是生物工程体外定向进化快速筛选技术，特别是一种用于筛选定向进化突变酶的快速质粒营救法，是一种快速高效筛选耐高温和耐酸碱酶的方法。特别适合用于大规模的筛选工业用超高温突变酶基因，能短时间内得到大量的突变基因。
背景技术：
：体外定向进化是近几年新兴起来的一种蛋白质改造新策略，它可以在尚不知道蛋白质的空间结构，或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择),使基因发生大量变异,并定向选择出所需性质或功能,从而使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现。用定向进化的方法改造工业用酶，提高酶在非天然环境(如有机溶剂)中的活性、耐热稳定性、非天然底物的特异性、对映体选择性等方面都有成功。但在构建突变体库的策略日益成熟的今天，如何快速、高通量的筛选出适合工业用途的进化酶的筛选策略成为制约酶定向进化的瓶颈问题。现有技术中常规筛选定向诱变转化子的方法A、将定点诱变和随机诱变的重组质粒转化大肠杆菌；B、构建目的基因的巨大突变文库；C、将转化子进行拷贝；E、对一个拷贝进行高温(60-100'C)处理或酸碱(pH4~10)处理；F、在对应于相应的拷贝中，挑选在高温、酸碱条件下有酶活的转化子；G、对挑取的转化子进行培养(16-18小时)；H、抽提质粒；I、采用快速转化的方法进行转化验证；J、最后对转化子进行鉴定直到获得目的突变子。该方法对转化子必须进行拷贝备份，费工费时，不能快速筛选出突变酶
发明内容本发明的目的是提出一种筛选定向进化突变酶的快速质粒营救法，可直接从加热处理或耐酸处理后再加热处理的平板中回收携带有突变基因的质粒，用于进一步的筛选和基因测序，筛选定向进化突变酶。本发明的步骤为-A、将定点诱变和随机诱变的重组质粒转化大肠杆菌；B、构建目的基因的巨大突变文库；C、高温60-100'C处理(10-30分钟)构建的突变基因文库；或者耐酸pH4"40处理(10-15分钟)再高温60-100'C处理(10-30分钟)构建的突变基因文库；D、直接挑选在高温条件下有酶活的转化子的部分死亡菌体；E、将挑出的少量死亡的菌体和大肠杆菌的高效感受态细胞进行混合，采用快速转化的方法进行转化；F、最后对转化子进行鉴定直到获得目的突变子。本发明具体做法为1.质粒的转化将定点诱变和随机诱变的不同大小重组质粒分别转化到大肠杆菌XL-GOLD，涂布带有氨苄抗性的LB平板Amp50u/ml，37'C培养过夜，到转化子单菌落直径大小约为12mm，选取质粒，构建突变体文库。2.将突变体文库分别置于60~100'C，加热处理10~30min;或者用pH为4.0~10.0的缓冲液分别对文库平板处理10~15min后再分别置于60^100T，加热处理10~30min;3.营救质粒转化从加热处理后的培养基上随机选择3个克隆，用牙签或小枪头刮下菌体，在冰浴条件下，分别混匀于大肠杆菌感受态细胞中。将混合液按照常规转化步骤进行转化。然后分别将转化反应液涂布于含Amp50u/ml的LB培养基，倒置培养至单菌落出现。4.细菌质粒的提取验证挑取转化克隆，接种于1ml含Amp50u/ml的LB培养液，37"C培养过夜，按试剂盒说明抽提细菌质粒，然后用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测转化的质粒分子量。本发明的基本原理和特点本发明打破了常规筛选的方法必须拷贝的思路，不对突变文库进行拷贝，将建库的转化子直接加热，采用转化子游离出的质粒直接转化，节省了大量时间，提高了筛选效益。本发明实验过程简单，易操作。可把一轮的筛选过程縮短1-2天。大大减少人力、物力和财力的支出。本发明适合于质粒大小在3-IOKB范围的载体，筛选作用温度60-100'C、PH范围为4-IO的突变体酶。本发明和常规的方法如影印法和拷贝法相比，减少了影印和拷贝过程中的操作及培养菌体和抽提质粒的操作，最少节约时间l-2天；同时还能避免影印法造成的混乱，不能正确挑取对应菌落的不良现象。本发明和直接涂板加碘检验透明圈后，然后刮取可以产生透明圈的那部分菌进行质粒的抽提相比，避免了由于菌体太少抽不到质粒，以及在操作过程中造成污染的不良现象。图1是不同条件对质粒营救效率的影响A:不同处理温度对快速营救的转化子的影响，从60度到100度，温度越高转化子数越少。B:在70度的温度条件下，高温处理从10分钟到30分钟对快速营救的转化子的影响。C:经PH4-10的处理，然后采用70度处理30分钟，对快速营救的转化子的影响，结果显示随pH升高，转化子数量增加。D:不同大小质粒对对快速营救的转化子的影响，结果显示质粒从3-lOKb，质粒越大转化子越小。图2是转化子质粒抽提电泳图，它是对图1D的验证，显示我们确实得到了从3-10Kb大小的质粒。图3是耐高温淀粉酶突变基因的筛选平板，A加热前淀粉酶基因的转化平板；B加热后显示水解圈的转化平板。从B看出，经高温处理后，转化子显示出的酶活，我们直接挑取有酶活的转化子进行下一步的验证研究。具体实施方式A材料l.菌种和质粒大肠杆菌菌株XL10"COLD，本发明所用质粒(见表l)均由实验室保存和构建。pBluescriptKS是原始质粒，在TaKaRa等公司有售，其他质粒是本实验室按常规方法构建。高效感受态细胞XL10"GOLD的制备方法参考分子克隆手册方法(1989)。2.试剂0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.0)，磷酸缓冲液(pH6.0)，磷酸缓冲液(pH8.0)，和NaOH-磷酸缓冲液(pH10.0)，LB培养基用于五.//的生长和保存。耐高温琼脂(Phytage,Sigma)，氨苄青霉素(Amp)，DNAMaiker，质粒抽提试剂盒、感受态制备试剂等分别购自TaKaRa、Sigma等公司，其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。表l本发明用的菌株和质粒<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例1筛选耐高温的酶A高温处理选取质粒大小为6.0kb的pGEX-amy为材料，构建突变体文库，将文库平板分别置于60"C，70。C，80°C，90°C，100°C，加热处理10~30min。B.营救质粒转化从加热处理后的培养基上对每个处理选择3个酶活有变化的克隆(见图3显示处理后的结果)，用牙签或小枪头刮下菌体，在冰浴条件下，分别混匀于大肠杆菌感受态细胞中。将混合液按照常规转化步骤进行转化。然后分别将转化反应液涂布于含Amp50u/ml的LB培养基，倒置培养至单菌落出现。C.处理结果处理温度越高，转化子越少(见说明书附图1A);但不影响我们对获得的转化子的下一步研究。能够迅速的筛选到编码耐高温的基因。D.结果验证最后对转化子进行鉴定直到获得目的突变子。实施例2筛选耐酸和碱酶的编码基因A.pH条件对质粒营救效率的影响选取质粒大小为4.0kb的pET23A-h3e为材料，构建突变体文库；用pH为4.0，6.0，8.0，10.0的缓冲液分别对文库平板处理lOmin，倒掉多余的缓冲液。B.高温处理将经不同pH处理过的文库置于70"C，加热处理l(^30min。c:.营救质粒转化从加热处理后的培养基上随机选择3个克隆，用牙签或小枪头刮下菌体，在冰浴条件下，分别混匀于大肠杆菌感受态细胞中。将混合液按照常规转化步骤进行转化。然后分别将转化反应液涂布于含Amp50u/ml的LB培养基，倒置培养至单菌落出现。D.处理结果随酸碱度不一样，转化子数量有变化(见说明书附图l-C);但不影响我们对获得的转化子的下一步研究。能够迅速的筛选到编码耐酸碱的酶的基因。E.结果验证最后对转化子进行鉴定直到获得目的突变子。实施例3筛选不同大小的质粒A质粒大小为研究质粒大小对质粒营救转化效率的影响，选取单菌落分散良好的pBluescriptKs(2.9kb)，pET23A(4.0kb)，pGEX-amy(6.0kb)，pYES2/NTA(8.0kb)，pPIC9K-xamy(10.0kb)转化平板，B高温处理70'C，加热处理30min。C.营救质粒转化从加热处理后的培养基上分别随机选择3个克隆，用牙签或小枪头刮下菌体，在冰浴条件下，分别混匀于大肠杆菌感受态细胞中。将混合液按照常规转化步骤进行转化。然后分别将转化反应液涂布于含Amp50u/ml的LB培养基，倒置培养至单菌落出现。D.处理结果质粒大小不一样，转化子数量有变化，(见说明书附图l-D);但不影响我们对获得的转化子的下一步研究。能够迅速的筛选到分子量大小从3-10KB的质粒(见说明书附图2)。E.结果验证最后对转化子进行鉴定直到获得目的突变子。权利要求1.一种用于筛选定向进化突变酶的快速质粒营救法，其特征在于步骤为A、将定点诱变和随机诱变的重组质粒转化大肠杆菌；B、构建目的基因的巨大突变文库；C、高温60-100℃处理(10-30分钟)构建的突变基因文库；或者酸碱pH4～10处理(10-15分钟)后，再高温60-100℃处理(10-30分钟)构建的突变基因文库；D、直接挑选在高温条件下有酶活的转化子的部分死亡菌体；E、将挑出的少量死亡的菌体和大肠杆菌的高效感受态细胞进行混合，采用快速转化的方法进行转化；F、最后对转化子进行鉴定直到获得目的突变子。2、根据权利要求1所述的一种用于筛选定向进化突变酶的快速质粒营救法，其特征在于步骤为1.质粒的转化将定点诱变和随机诱变的不同大小重组质粒分别转化到大肠杆菌XL-GOLD,涂布带有氨苄抗性的LB平板Amp50u/ml，37"C培养过夜，到转化子单菌落直径大小约为l2mm，选取质粒，构建突变体文库；2.将突变体文库分别置于60~100'C，加热处理10~30min;或者用pH为4.0~10.0的缓冲液分别对文库平板处理10~l5min后，再高温60-100'C处理(10-30分钟)；3.营救质粒转化从加热处理后的培养基上随机选择3个克隆，用牙签或小枪头刮下菌体，在冰浴条件下，分别混匀于大肠杆菌感受态细胞液中，进行快速转化，然后分别将转化反应液涂布于含Amp50u/nd的LB培养基，倒置培养至单菌落出现J4.细菌质粒的提取验证挑取转化克隆，接种于1ml含Amp50u/ml的LB培养液，37'C培养过夜，按试剂盒说明抽提细菌质粒，然后用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测转化的质粒分子量。全文摘要本发明提出了一种筛选定向进化突变酶的快速质粒营救法，可直接从加热处理或酸碱处理后再加热处理的平板中回收携带有突变基因的质粒，用于进一步的筛选和基因测序，筛选出定向进化突变酶。本发明实验过程简单，易操作。可把一轮的筛选过程缩短1-2天。大大减少人力、物力和财力的支出。本发明适合于质粒大小在3-10KB范围的载体，筛选作用温度60-100℃、pH4-10。快速定向筛选出耐高温和耐酸碱酶进化突变酶。文档编号C12Q1/02GK101302559SQ200810047900公开日2008年11月12日申请日期2008年6月3日优先权日2008年6月3日发明者涛柯,马向东申请人:湖北大学