包含z9cck蛋白的重组大肠杆菌及卵黄抗体与应用的制作方法

专利名称：：包含z9cck蛋白的重组大肠杆菌及卵黄抗体与应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于本发明属于农业养殖动物基因工程
技术领域：
。具体涉及一种经大肠杆菌偏爱密码子优化后的猪胆囊收縮素-33J3)基因多串联体重组质粒的构建，猪CCK-33多串联体重组蛋白在大肠杆菌中的表达，Z9CCK(猪CCK-33九串联体)重组蛋白的纯化及其在制备卵黄抗体制品中的应用。
背景技术：
：胆囊收縮素(CCK)是一种被广泛研究的食欲饱感因子。它广泛分布于消化系统、中枢及外周神经系统、外周血液及一些组织器官中。CCK前体分子经不同酶切作用形成不同大小的CCK分子形式(LiddleRA.Cholecystokinincells.尸^w!'o/,1997,59:221-242)，其中CCK-33和CCK-8是动物体内最具代表性的两类分子形式。CCK羧基端第7位酪氨酸残基硫酸化是CCK是否具有较强生物学活性的的关键因素(WilliamsJA.Cholecystokinin:ahormoneandaneurotransmitter,5/。7weii1982,3:107-121)。il酸f七的CCK-8肽Asp-Tyr(S03H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2具有天然CCK的全部活性(RushakoffRJ,GoldfineID,CarterJD,LiddleRA.Physiologicalconcentrationsofcholecystokininstimulateaminoacid-inducedinsulinreleaseinhumans./C""￡W。c"'o/Me喊1987，65(3):395-401)。CCK-5肽Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2与胃泌素羧基端5个氨基酸序列完全相同，CCK-4同样如此。因此，CCK-4是具有生物活性的最小片段，是保持生物活性所必须的(JensenRT,LempGF,GardnerJD.InteractionofCOOH-terminalfragmentsofcholecystokininwithreceptorsondispersedacinifromguineapigpancreas./5!'o/C&w,1982，257:5554-5559)，而CCK-8则是具有全部生物学活性的最小片段。Pekas禾卩Trout(PekasJC,TroutWE.Stimulationoffoodintakeandgrowthofpigsbycholecystokininimmunization.GrowAZ)ev爿g;"g，1990,54:5卜56)发现，在生长肥育猪的饲养试验中，用化学合成的非硫酸化的CCK-8与人血清球蛋白(hSG)交联物作抗原主动免疫生长肥育猪。结果在试验后期(43-77d),CCK免疫组猪的采食量和增重分别提高了8.2°/。和10.6%(户<0.05)。整个试验期(l-77d)CCK免疫组猪采食量比对照组增加5.4%，差异接近显著(P=0.08),体重增加8.3%，差异极显著(/><0.01)。他们还发现CCK免疫组采食量和日增重显著提高与CCK免疫组猪体内CCK抗体滴度成正相关，相关系数分别为0.20(户=0.14)和0.34CP<0.05)，CCK免疫组猪体内有明显的CCK抗体产生是在试验期第29d，第43dCCK抗体滴度达到峰值，此后检测CCK免疫组猪体内一直存在CCK抗体，直到试验结束。后来的试验进一步证实了CCK主动免疫可以显著提高生长肥育猪的日增重，血液中CCK抗体滴度与体増重成正相关，相关系数为0.44CPO.05),差异显著。同时在青年母猪中也得到了类似的结果(PekasJC，TroutWE.Cholecystokininoctapeptideimmunization:effectongrowthofbarrowsandgilts.Jy4m'/nSd,1993,71:2499-2505)。谭雪梅(谭雪梅.胆囊收縮素主动免疫及其对猪生产性能和胴体品质的影响.[硕士学位论文].雅安四川农业大学图书馆，2003)用化学合成的CCK-8与人血清白蛋白(hSA)主动免疫生长肥育猪后，试验猪的日增重比对照组提高21.23%CP=0,104),日采食量比对照组提高16.24%CP=0.152),料肉比下降4.86°/。(ZMU38),但对营养物质的利用率无影响。这表明CCK主动免疫可以提高猪的生产性能。同时，试验猪的屠宰体重比对照组增加12.68%(P=0.178)。袁中彪(袁中彪.胆囊收缩素主动免疫对猪的营养生理效应及其机制的研究.[博士学位论文].雅安四川农业大学图书馆，2004)第一次试验用化学合成的未硫酸化的CCK-8与hSA(370ugCCK/mL)主动免疫生长肥育猪后，与对照组相比，试验猪全期日增重和采食量分别提高了314.29%(尸=0.23)和9.34%(尸=0.34);第二次试验分别用不同浓度的CCK-8主动免疫主动免疫生长猪，发现250吗CCK-8主动免疫能显著提高猪的全期采食量和日增重，与对照组相比分别提高了11.76%(尸<0.05)和14.62%(P<0.05)。姚康(姚康.利用抗食欲抑制因子卵黄抗体提高母猪泌乳期采食量的研究.[硕士学位论文].武汉华中农业大学图书馆，2005)用化学合成的未硫酸化的CCK-8与牛血清白蛋白(BSA)交联物主动免疫产蛋鸡，与对照组相比高峰期产蛋鸡采食量提高了9.25%(户O.Ol),蛋重提高了4.17%(户o.oi)。Cook等(CookME,MillerCC,PimentelJL.Methodtosuppressappetiteandreduceweightgain.USAPatent,PCT/USO1/00542.1998-10-27)用化学合成的硫酸化的CCK-8和匙孔血蓝蛋白(KLH)交联物免疫产蛋鸡，产蛋鸡经过受精后收集鸡蛋，在鸡蛋中存在CCK抗体，小鸡从鸡蛋中孵化出来，体内带有CCK母源卵黄抗体，母源抗体一般可以存在15-20d，将孵化出的小鸡饲养6个星期发现CCK处理组比对照组釆食量提高了1%，体增重提高了18%，料肉比降低了14%(CookME，MillerCC，PimentelJL.Methodtosuppressappetiteandreduceweightgain.USAPatent,PCT/US01/00542.1998-10-27)。Cook认为，这些试验结果意味着CCK抗体可以中和动物体内内源性的CCK，减少胃肠道蠕动，从而提高饲料转化率。分别将0.5%、1%、5。/。的CCK卵黄粉添加到小鸡日粮中去，添加5WCCK卵黄抗体粉组的采食量比相应对照组提高了8.43。/。，P/。CCK卵黄抗体粉组的料肉比最低，比相应对照组降低了4.18%。Cook分别添加5。/。和10。/。生大豆到小鸡日粮中，研究发现5Q/。生大豆CCK抗体组比对照组料肉比降低了11%,10n/。生大豆CCK抗体组比对照组料肉比降"f氐了190/0(CookME,MillerCC,PimentelJL.Methodtosuppressappetiteandreduceweightgain.USAPatent,PCT/US01/00542.1998-10-27)。丁雪梅(丁雪梅.胆囊收縮素主动免疫产蛋鸡的营养生理效应研究.[硕士学位论文].雅安四川农业大学图书馆，2003)在肉鸡饲料中添加含有CCK抗体的卵黄粉(100mg/g),可显著提高l-42日龄肉鸡的日增重和饲料转化率。张晓萍(张晓萍.胆囊收缩素卵黄抗体的生物学活性及其作用机理初探.[硕士学位论文].南京南京农业大学图书馆，2004)分别在基础日粮中添加O,50,70，90mg/kg的CCK卵黄抗体粉，结果显示添加50，70，90mg/kg的CCK卵黄抗体粉处理，均能显著提高肉鸡体重和体增重(P<0.05)，其中50mg/kg组差异极显著(PO.Ol)。姚康(姚康.利用抗食欲抑制因子卵黄抗体提高母猪泌乳期采食量的研究.[硕士学位论文].武汉华中农业大学图书馆，2005)添加1.2°/。的CCK卵黄抗体粉到母猪泌乳期日粮中使母猪采食量提高了3.8n/。，仔猪窝增重提高了3.9n/。，差异均不显著。刘洁珠(刘洁珠.抗縮胆囊素卵黄抗体的制备及应用研究.[硕士学位论文].广州华南农业大图书馆，2007)在生长肥育猪饲料中添加CCK抗体的卵黄粉，得到试验组釆食量比对照组提高了8。/。。目前大多数的研究者用CCK作抗原调节动物釆食量都是用化学合成的CCK-8(硫酸化或未硫酸化)，其缺点是化学合成的CCK-8无论硫酸化或未硫酸化都很昂贵，而且硫酸化的CCK-8更昂贵，不能用于大规模的生产应用中去。以大肠杆菌表达系统为典型代表的原核表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、可以大规模发酵培养的优点，是现阶段最常用的表达系统(谢磊，孙建波，张世清，黄俊生..大肠杆菌表达系统及其研究进展.华南热带农业大学学报，2004,10(2):16-20)。因此用大肠杆菌表达系统表达CCK重组蛋白，可以替代昂贵的化学合成的CCK-8，为规模化生产CCK蛋白抗原提供新思路。舒鼎铭(舒鼎铭.鸡缩胆囊素基因的表达及免疫原性研究.[博士学位论文].广州华南农业大图书馆，2004)在大肠杆菌中成功表达出了鸡CCK-33多串联体蛋白。曹军(曹军.猪三十九肽胆囊收縮素(CCK39)的基因克隆、表达及其抗体的制备.[硕士学位论文].扬州.扬州大学图书馆，2005)在大肠杆菌中也成功表达出了猪CCK-39与GST(谷光甘肽转运酶)的融合蛋白。刘洁珠(刘洁珠.抗縮胆囊素卵黄抗体的制备及应用研究.[硕士学位论文].广州华南农业大图书馆，2007)分别将编码猪CCK70个氨基酸的功能结构蛋白区和鸡CCK-33四串联体基因与Mj^S基因在大肠杆菌中融合表达，均获得了具有较好抗原性的CCK融合蛋白。基于以上的发现，我们采用基因工程技术外源表达猪的CCK多串联体重组蛋白，旨在寻求一种低成本大量生产具有免疫原性的CCK重组蛋白。通过Z9CCK重组蛋白主动免疫产蛋鸡，制备CCK卵黄抗体粉，并研究其调节泌乳期母猪采食的效果，从而为开发CCK卵黄抗体粉成为一种促食欲、促生长、提高饲料利用率的饲料添加剂提供试验依据。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种经大肠杆菌偏爱密码子优化后的猪cc/:-"基因九串联体的重组质粒pRSET-Z9CCK，将重组质粒pRSET-Z9CCK转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得一种能表达Z9CCK蛋白的重组菌。所述重组质粒的核苷酸序列经大肠杆菌偏爱密码子优化后，提高了基因表达目的蛋白Z9CCK的表达量；所述重组质粒自带终止密码子，提高了目的蛋白Z9CCK表达的终止效率，减少了目的蛋白携带的冗余氨基酸序列。本发明的另一个目的是在于提供了一种诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK表达的Z9CCK目的蛋白。所述目的蛋白Z9CCK分子量较大，免疫原性较好，生产成本较低。本发明的再一个目的是利用所述的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK在制备CCK卵黄抗体制品中的应用。本发明的第四个目的是利用所述的Z9CCK重组蛋白在制备CCK卵黄抗体制品中的应用。利用所得到的Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪，以提高猪的采食量。利用所得到的卵黄抗体作为饲料添加剂添加到泌乳期母猪日粮中，以提高母猪的采食量。本发明通过以下技术方案实施一种表达猪CCK-33九串联体(Z9CCK)的重组大肠杆菌Esc^Wcteco/ZBL21(DE3)/pRSET-Z9CCK，已于2008年6月30日递交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO:M208103本发明克隆的重组质粒，是利用多串联体构建技术等基因工程技术和利用SaMHl与Bg/II是一对同尾酶的原理，将9个编码猪CCK-33单体的核苷酸序列和每2个CCK-33单体之间间隔有编码五个氨基酸连接肽的核苷酸序列插入原核表达载体pRSETB中构建而成的。申请人将该重组质粒命名为pRSET-Z9CCK，CCK九串联体(Z9CCK)的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。利用所述的重组质粒pRSET-Z9CCK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过诱导表达得到重组蛋白Z9CCK，它的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，利用该重组蛋白主动免疫产蛋鸡，得到含有CCK抗体的卵黄抗体全蛋粉；将所述的CCK卵黄抗体作为饲料添加剂添加到泌乳期母猪日粮中，从而显著提高了泌乳期饲喂母猪的采食量。一种包含Z9CCK蛋白的重组大肠杆菌及卵黄抗体与应用，本发明的技术方案如下(详细技术步骤参见"具体实施方式"部分)下列具体实施例中未经特别说明的方法均参照[美]J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔(J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)，北京科学出版社，2002年)。一、优化后的猪cai:-33基因九串联体重组质粒的构建(见图i①和图2)根据GenBank中已报道的猪CCK-33基因序列(登录号为NM一214237)和参照大肠杆菌密码子使用数据库(Codonusagedatabase,网址www.kazusa.or.jp/codon)，设计并合成了大肠杆菌表达系统偏爱的猪CCX-1基因优化序列。设计带有限制性内切酶酶切位点的引物对A和引物对B，其中在引物对B的下游引物中引入终止密码子，引物对C中没有内切酶酶切位点。以质粒pRESETB为克隆载体，大肠杆菌DH5a为克隆宿主菌，将合成的猪CC尺-W优化序列通过PCR扩增、酶切、连接、转化克隆至pRSETB质粒上，分别获得不带终止子的CCX-W基因单体pRSET-lCCK的重组质粒和带终止子CCX-W基因单体pRSET-ZlCCK的重组质粒。在此基础上利用限制性内切酶^wzHI和5g/II是同尾酶的原理，经多次克隆构建了含有优化后的猪CC《-W基因九串联体重组质粒。对构建好的CCK-33九串联体基因重组质粒酶切鉴定、测序，证实构建正确，命名为pRSET-Z9CCK。二、CCK-33九串联体(Z9CCK)重组蛋白的诱导表达及提取纯化(见图1①)将测序正确的重组质粒pRSET-Z9CCK,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组菌大肠杆菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK，并利用异丙基-l3-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-D-l-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。通过对大肠杆菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK表达产物的可溶性分析发现BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK诱导表达产物以包涵体形式存在，釆取超声波破碎法提取包涵体，通过包涵体的变性和复性纯化大肠杆菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK表达产物Z9CCK重组蛋白。SDS-PAGE检测提纯后的Z9CCK重组蛋白纯度，Bradford法测定蛋白质浓度。三、Z9CCK重组蛋白的抗原性(见图l②，③，，⑤)禾ll用网址http:〃www.immuneepitope.org/tools/bcell/tutorial.jsp上介纟召的"BepipredLinearEpitopePrediction"方法对Z9CCK重组蛋白进行抗原性预测，初步验证了Z9CCK重组蛋白具有良好的抗原性。以兔抗CCK-8阳性抗血清为一抗，以山羊抗兔抗体为二抗，用Western-blot方法(J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)，北京科学出版社，2002年)证明了Z9CCK重组蛋白具有良好的免疫原性。以化学合成的CCK-8作为包被抗原，用提纯的Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪获得的抗Z9CCK抗体为一抗，以羊抗猪IgG抗体为二抗，用间接ELISA试验证明了Z9CCK重组蛋白具有较好的抗原性。四、利用Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪，研究该重组蛋白对猪生长性能的影响(见图1，⑧)向提纯的Z9CCK重组蛋白溶液中加入灭菌的吐温-80(吐温-80体积比浓度为4%(体积比))，充分混合后再与等体积的白油佐剂(94%(体积比)白油，6°/。(体积比)司本-80，2%(质量体积比)硬脂酸铝)混合，并充分乳化制成蛋白浓度为500pg/mL的油乳苗。用Z9CCK重组蛋白油乳苗主动免疫生长肥育猪，通过生长肥育猪的饲养试验研究Z9CCK重组蛋白对猪的采食量和体增重的调节效果。选择63±3日龄的长新品系生长肥育猪(华中农业大学试验猪场提供)72头，按体重相对一致的原则随机分成2组，每组9个重复，每个重复4头猪，共36头/组。试验组免疫Z9CCK重组蛋白油乳苗2mL(500吗Z9CCK/mL)，左右颈部肌肉各注射lmL;对照组免疫生理盐水，左右颈部肌肉各lmL。免疫程序为试验期第ld进行初次免疫，第29、57d各加强免疫一次。试验结果表明在试验后期(29-70天)，试验组猪体内有较高水平的CCK抗体，试验组猪采食量和日增重比对照组有提高，差异不显著。用Z9CCK重组蛋白油乳苗主动免疫生长肥育猪，通过对猪采食前、采食中、采食后血液的动态釆集，研究Z9CCK主动免疫对血清激素及其它成分的影响。Z9CCK主动免疫生长肥育猪饲养试验结束后，试验组和对照组各选4头健康、体重一致的猪，耳静脉安装留置针，对其实施采食前0min、开始采食后15min、30min、lh、2h连续动态采血，用相关试剂盒测定血浆中CCK、胰岛素、血糖的浓度。试验结果表明Z9CCK重组蛋白主动免疫对生长肥育猪血液中CCK、胰岛素、血糖具有调节作用。五、以Z9CCK重组蛋白为免疫原制备卵黄抗体(见图l⑦)将Z9CCK重组蛋白油乳苗主动免疫28周龄海蓝褐蛋鸡750只，左右胸肌各注射0.5mL/次(500吗Z9CCK/mL)，免疫程序为试验期第ld初次免疫和第15、29d各加强免疫1次。2免后一周开始收集鸡蛋样品，以提纯的Z9CCK重组蛋白作包被抗原，鸡蛋样品倍比稀释后作为一抗，鼠抗鸡IgY为二抗，采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)监测卵黄抗体效价。当CCK抗体效价达到高峰时，收集鸡蛋进行喷雾干燥加工成CCK卵黄抗体全蛋粉，间接ELISA检测卵黄粉样品中的CCK抗体效价。六、CCK卵黄抗体在泌乳期母猪日粮中的应用(见图l，⑦)选择52头妊娠后期健康经产母猪，随机分成2组对照组和处理组，每组26个重复，每个重复l头母猪。在玉米-豆粕型日粮的基础上，处理组添加1X的CCK卵黄抗体全蛋粉；对照组添加1%的对照全蛋粉，泌乳期为21天。泌乳期日粮中添加1^的CCK卵黄抗体粉可显著提高母猪泌乳期采食量，有利于提高仔猪生长性能。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1、根据大肠杆菌偏爱密码子设计基因序列，釆用基因工程的方法表达猪CCK-33多串联体重组蛋白，表达量高、成本低；2、通过3方面的研究证明了Z9CCK重组蛋白具有较好的免疫原性；3、采用基因多串联体构建技术，实现了猪CCK-33多串联体重组蛋白的表达，增加了CCK的分子量，Z9CCK重组蛋白可直接作为抗原免疫，克服了小分子CCK-8和CCK-33不能直接作为免疫原，需要与大分子物质(如牛血清白蛋白，人血清球蛋白等)交联才能作为免疫原的缺点；4、用提纯的Z9CCK蛋白溶液与白油等佐剂充分乳化，制备了成本较低的Z9CCK蛋白油乳苗；5、用Z9CCK蛋白油乳苗主动免疫生长肥育猪，有效地提高了猪的釆食量和日增重；6、用Z9CCK蛋白油乳苗主动免疫产蛋鸡，制备了高效价的CCK卵黄抗体全蛋粉；7、将制备的CCK卵黄抗体粉添加到泌乳期母猪日粮中，显著提高了母猪的采食量，有效地提高了仔猪生长性能。8、制备的CCK卵黄抗体可以作为饲料添加剂大规模应用。图1为一种包含Z9CCK蛋白的重组大肠杆菌及卵黄抗体制备与应用的技术路线方框示意图。图2为一种CCK基因及其多串联体重组质粒的构建示意图。图中pRSETB为克隆质粒载体，pRSET-lCCK为插入了CCK-33基因(1CCK)的重组质粒，pRSET-2CCK为插入了CCK-33基因二串联体(2CCK)的重组质粒，pRSET-Z3CCK为插入了CCK-33基因三串联体(Z3CCK)的重组质粒,pRSET-Z5CCK为插入了基因五串联体(Z5CCK)的重组质粒，pRSET-Z7CCK为插入了CCK-33基因七串联体(Z7CCK)的重组质粒，5amHI、i//"dIII、5g/II、Sacl是质粒上的限制性内切酶位点。图3为一种用限制性内切酶5側HI禾B历wdIII分别对CCK多串联体重组质粒pRSET-2CCK、pRSET-Z3CCK、pRSET-Z5CCK、pRSET-Z7CCK和pRSET-Z9CCK进行双酶切电泳鉴定示意图。图中M为DNA分子量标准DL2000;1泳道为pRSET-2CCK质粒酶切产物，外源片段大小为258bp;2泳道为pRSET-Z3CCK质粒酶切产物，外源片段大小为374bp;3泳道为pRSET-Z5CCK质粒酶切产物，外源片段大小为602bp;4泳道为pRSET-Z7CCK质粒酶切产物，外源片段大小为830bp:5泳道为pRSET-Z9CCK质粒酶切产物，外源片段大小为1058bp。图4为一种用lmmol/L的IPTG诱导CCK多串联体重组蛋白表达的表达产物SDS-PAGE检测示意图；图中1泳道为含有CCK-33肽三串联体表达产物的细菌裂解物，2泳道为含有CCK-33肽五串联体表达产物的细菌裂解物，3泳道为含有CCK-33肽七串联体表达产物的细菌裂解物，4泳道为含有CCK-33肽九串联体表达产物的细菌裂解物，M为蛋白质分子量标准；图5为一种提纯的Z9CCK重组蛋白SDS-PAGE检测示意图，图中l泳道为提纯的分子量大小为42.lkD左右的Z9CCK重组蛋白；M为蛋白质分子量标准；图6为一种Z9CCK重组蛋白抗原性预测示意图7为一种含有CCK-33的九串联体诱导表达产物的免疫印迹(Western-blot)分析示意图，图中1泳道为九串联体(Z9CCK)诱导表达产物；M为蛋白质分子量标准。图8为一种Z9CCK重组蛋白主动免疫诱导生长肥育猪血清中的CCK抗体滴度示意图，图中*:显著；**:极显著；图9为_种Z9CCK重组蛋白主动免疫后生长肥育猪血液中CCK浓度的变化规律示意图；图10为一种Z9CCK重组蛋白主动免疫后生长肥育猪血液中胰岛素浓度的变化规律示意图，图中*:显著；图11为一种Z9CCK重组蛋白主动免疫后生长肥育猪血液中血糖浓度的变化规律示意图12为一种Z9CCK重组蛋白主动免疫产蛋鸡后，鸡蛋中CCK卵黄抗体效价的变化规律示意具体实施例方式下列具体实施例中未经特别说明的方法均参照[美]J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔(J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)，北京科学出版社，2002年)。实施例l:优化后的猪COT-W基因九串联体重组质粒的构建(见图l①和图2)1、菌株和质粒载体的选择本实施例使用的质粒载体pRSETB购自美国Invitrogen公司。大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21(DE3)均购自Novagen公司。2、培养基制备LB液体培养基含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH至6.8或7.0或7.2,12rC高压蒸汽灭菌20分钟或25分钟或30分钟，20'C或23'C或25'C保存备用。LB固体培养基含胰蛋白胨10g,酵母提取物5g，NaC110g，加蒸馏水定容至lOOOmL，调pH至6.8或7.0或7.2，另加15g琼脂粉，12rC高压蒸汽灭菌20分钟或25分钟或30分钟，倾倒平板，待培养基凝固后倒置于4'C保存备用。若制备抗性平板，则待培养基温度降至50'C或52'C或55'C时，加终浓度为100ng/mL的氨苄青霉素后倾倒平板即可。3、其他生化试剂制备TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、PCR缓冲液均为美国Fermentas公司产品。DNA分子量标准DL2000、限制性内切酶万側HI、SacI、5g/II和州wi111，T4DNA连接酶等为宝生物工程(大连)有限公司产品。DNA回收试剂盒、氨节青霉素、异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉等均为上海生工生物工程有限公司产品。4、优化后的猪CCX-B基因多串联体重组质粒的构建CCK-33多串联体重组质粒的构建过程见图2。(1)CCK-33基因DNA模板的制备.根据GenBank中已报道的猪CCX-W基因序列(GenBank登录号为NM—214237)和大肠杆菌偏爱性密码子表(参考CodonUsageDatabase)设计优化猪CC"大肠杆菌偏爱密码子表达基因序列，送上海生工生物工程有限公司合成并插入PUC57质粒(购自北京经科宏达生物技术公司)中，命名为PUC57-CCK33,以此作模板，-20汇保存备用。参照猪CCK-33基因原序列(见GenBank，登录号为NM_214237)，其核苷酸序列如下所示aaagcaccttctggccgagtatctatgattaagaatctgcagagectggaccccagecacagaataagtgacegggactacatgggctggatggatttt,设计大肠杆菌偏爱密码子对其序列进行优化。经大肠杆菌偏爱密码子优化后的猪CCK-33核苷酸序列如下，粗体字母为优化后的大肠杆菌偏爱密码子)aaagetccgtctggtcgtgtgtctatgattaaaaacctgcagtctctggacccgtctcatcgtatttctgatcgtgattatatgggttggatggatttt(2)引物设计根据优化后的猪CCK-33基因序列，设计带有限制性内切酶酶切位点的两对引物，分别命名为引物对A和引物对B(见表l),在引物对A和引物对B的上游引物(F)和下游引物(R)中分别引入^wHl和&cI的酶切位点；引物对B中的下游引物(R)带有终止密码子TCA(对应于编码链为反向互补的TGA)。根据载体pRSETB的基因序列设计了另外一对引物，命名为引物对C,该引物对C的上下游引物(F,R)分别位于载体pRSETB的多克隆位点的两端。表1CCK基因PCR扩增的引物设计引物名称引物序列5'-3'退火温度'CF:CZ4GGATCCGAAAGCTCCGTCTGGTC引物对AR:5awHI52C4CGAGCTCCAAAATCCATCCAACCfeciF:C7MGGATCCGAAAGCTCCGTCTGGTC引物对BR:I52C4CGAGCTCTCAAAAATCCATCCAACCSacI引物对CF:AAATGGGTCGGGATCTGT54R:TCCTTTCGGGCTTTGTTA表l的说明带下划线的碱基为引物对的酶切位点，引物对B下游引物中粗体字母TCA碱基为终止密码子(3)优化后的猪cc/:-B基因重组质粒的构建用引物对A，以PUC57-CCK33作模板，经PCR扩增(94°C，4分钟；94'C，30秒；52°C,30秒；72'C，35秒；35个循环；72°C，0分钟；以下相同)、PCR产物纯化后得到的基因片段，命名为1CCK，取10nL1CCK基因片段，用SawHI和&cI限制性内切酶双酶切后再用琼脂糖凝胶电泳回收1CCK，按40nL体系(1CCK，IO;iL;5训HI，2|aL;SacI,2jxL;BSA，化L;10x缓冲液K，2jiL;ddH20,20nL)酶切3小时。质粒载体pRSETB用SawHI和&cI限制性内切酶进行双酶切后再用琼脂糖凝胶电泳回收pRSETB载体片段，按40|aL体系(pRSETB,6pL;SamHI，2piL;SacI，2pL;BSA,化L;10x缓冲液K,2pL;ddH20,24nL)酶切3小时。回收得到的带粘性末端的目的基因片段1CCK和pRSETB酶切片段按20pL体系(1CCK,IO(aL;pRSETB,6.5nL;10xT4缓冲液，2pL;T4缓冲液，1.5pL)进行连接。16°C，连接过夜后，取lOfiL转化DH5a感受态细胞。无菌条件下，在lOOuL的感受态细胞中加入10nL连接产物，混匀后冰浴30分钟。然后42'C水浴热击90s，再迅速冰浴l-2分钟。每管加400nLLB培养基，37'C复苏45分钟。5000转/分钟离心6分钟，弃上清400nL,剩余悬液涂布至含lOO^g/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37'C培养12-16小时。挑取平板上的单菌落于3mL(含100吗/mL氨苄青霉素)LB液体培养基中，37°C300转/分钟振摇培养过夜。取lpL菌液进行PCR检测。将PCR检测为阳性的重组大肠杆菌送北京奥科生物技术有限责任公司测序，对测序正确的阳性克隆子，被命名为pRSET-lCCK，提取阳性克隆pRSET-lCCK质粒，-20°0保存备用。(4)CCK-33二串联体重组质粒的构建用引物对C以重组质粒pRSET-lCCK为模板，PCR扩增(94°C，4分钟；94°C，30秒；54'C，30秒；72'C，35秒；35个循环；72°C,IO分钟)、PCR产物纯化后得到的基因片段，命名为BH1CCK,BH1CCK与前述的1CCK不同，其序列片段更长，其中含有5awHl和/^"dlII酶切位点。用SamHI和历mlin内切酶双酶切BH1CCK后再用琼脂糖凝胶电泳回收得到BH1CCK小片段，按40nL体系(BH1CCK,IOmL;5awHI,2pL;历"dIII,2pL;BSA,化L;10x缓冲液K,2pL;ddH20,20^L)进行酶切3小时。用Sg/II和历^in限制性内切酶双酶切pRSET-〗CCK后，琼脂糖凝胶电泳回收含pRSET-lCCK基因的大片段序列，按40jiL体系(pRSET-lCCK,6pL;2^L;M"dIII,2jxL;BSA，化L;10x缓冲液K，2pL;ddH20,24^L)进行酶切3小时。利用5a肌Hl和5g/II是一对同尾酶的原理，将BH1CCK酶切后回收得到的BH1CCK小片段和pRSET-lCCK基因大片段在T4连接酶的作用下连接过夜，按20nL体系(BHCCK，lOpL;pRSET-lCCK大片段，6.5pL;10xT4缓冲液,2pL;T4缓冲液，1.5pL)进行连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，将PCR检测为阳性的重组大肠杆菌测序，对测序正确的阳性克隆子，被命名pRSET-2CCK,提取阳性克隆pRSET-2CCK质粒，.2(TC保存备用。(5)CCK-33三串联体重组质粒的构建用引物对B以pUC57-CCK33质粒为模板，经PCR扩增、PCR产物纯化后得到得到带终止密码子的基因片段，命名为Z1CCK。对ZlCCK用SawHl和SacI双酶切后、回收Z1CCK,再与pRSETB载体经S^"HI和Sacl双酶切后，回收pRSETB大片段进行连接，连接产物经转化、检测、测序，最后获得pRSET-ZlCCK阳性克隆。其构建方法与构建pRSET-lCCK方法相同。用引物对C以重组质粒pRSET-ZlCCK为模板，经PCR扩增(94°C，4分钟；94°C,30秒；54°C,30秒；72°C,35秒；35个循环；72°C,IO分钟)、PCR产物纯化后得到带终止密码子的基因片段，命名为BHZ1CCK，BHZ1CCK序列中含有SamHI和州力dIII酶切位点。用5amHI和招"dIII内切酶双酶切BHZ1CCK后琼脂糖凝胶电泳回收BHZ1CCK片段，按体系(BHZ1CCK,10nL;AamHI，2|iL;历'"dIII,2pL;BSA,化L;10x缓冲液K,2|iL;ddH20,20nL)进行酶切3小时。用Sg/II和历"^III限制性内切酶双酶切保存的阳性克隆质粒pRSET-2CCK后琼脂塘凝胶电泳回收pRSET-2CCK大片段，按40|_iL体系(pRSET-2CCK，6|iL;2^L;7/Z"dl11,2pL;BSA,4pL;10x缓冲液K,2jiL;ddH20,24|jL)进行酶切3小时。将pRSET-2CCK回收大片段与BHZ1CCK回收片段连接，按20nL体系(BHZlCCK,lOpL;pRSET-2CCK大片段,6.5nL;10xT4缓冲液,2pL;T4缓冲液，1.5pL)进行连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5cx感受态细胞中，将PCR检测为阳性的重组大肠杆菌送北京奥科生物技术有限责任公司测序，对测序正确的阳性克隆子，命名为pRSET-Z3CCK,提取阳性克隆pRSET-Z3CCK质粒，-2(TC保存备用。(6)CCK-33五串联体重组质粒的构建将重组质粒pRSET-2CCK用5gZII和州wdIII限制性内切酶双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收得到pRSET-2CCK大片段基因序列，按40|aL体系(pRSET-2CCK，6|iL;5g/II，2|JL;i//"dIII,2|iL;BSA,4pL;10x缓冲液K,2nL;ddH20,2化L)进行酶切3小时。用5a/nHI和ffindin限制性内切酶双酶切pRSET-Z3CCK后，琼脂糖凝胶电泳，回收小片段基因序列，命名为Z3CCK，按40|iL体系(pRSET-Z3CCK,6|iL;SawHi,2pL;殆VzdIII,2^L;BSA,4(jL;10x缓冲液K,2nL;ddH20,2化L)进行酶切3小时。将pRSET-2CCK酶切回收大片段与pRSET-Z3CCK酶切回收小片段Z3CCK连接，按20pL体系(pRSET-2CCK大片段，6.5^L;Z3CCK小片段，lOpL;10xT4缓冲液，2pL;T4缓冲液，1.5^)进行连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，将PCR检测为阳性的重组大肠杆菌送北京奥科生物技术有限责任公司测序，对测序正确的阳性克隆子，命名为pRSET-Z5CCK,提取阳性克隆pRSET-Z5CCK质粒，-20匸保存备用。(7)CCK-33七串联体重组质粒的构建用Bg/II和历ndni限制性内切酶双酶切pRSET-2CCK回收pRSET-2CCK大片段基因序列。用SawHI和州'"dlII限制性内切酶双酶切pRSET-Z5CCK，回收的小片段基因序列，命名为Z5CCK，将pRSET-2CCK酶切回收大片段与酶切回收的Z5CCK小片段连接，按20nL体系(pRSET-2CCK大片段，6.5^iL;Z5CCK小片段，lOpL;10xT4缓冲液，2nL;T4缓冲液，1.5pL)进行连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，将PCR检测为阳性的重组大肠杆菌送北京奥科生物技术有限责任公司测序，对测序正确的阳性克隆子，命名为pRSET-Z7CCK,提取阳性克隆pRSET-Z7CCK质粒，-20匸保存备用。(8)CCK-33九串联体重组质粒的构建用5gni禾卩//!力cffll限制性内切酶双酶切pRSET-2CCK回收pRSET-2CCK大片段基因序列。用5awHI和历wdIII限制性内切酶双酶切pRSET-Z7CCK,回收小片段基因序列，命名为Z7CCK，将pRSET-2CCK酶切回收大片段与Z7CCK酶切回收小片段连接，按20jiL体系(pRSET-2CCK大片段，6.5|aL;Z7CCK小片段，10|iL;10xT4缓冲液,2pL;T4缓冲液，1.5pL)进行连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，将PCR检测为阳性的重组大肠杆菌送北京奥科生物技术有限责任公司测序，对测序正确的阳性克隆子，命名为pRSET-Z9CCK，提取阳性克隆pRSET-Z9CCK质粒，-20匸保存备用。用召amHl禾DffiKdIII限制性内切酶双酶切CCK多串联体重组质粒(pRSET-2CCK、pRSET-Z3CCK、pRSET國Z5CCK、pRSET-Z7CCK、pRSET-Z9CCK)，结果见图3。本发明获得的CCK-33九串联体(命名为Z9CCK)重组质粒酶切产物经0.8%(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳后，观察到约1058bp与2845bp左右两条带(见图3),表明重组质粒构建正确。将PCR检测为阳性的pRSET-Z9CCK重组大肠杆菌测序，将测序结果与目的基因序列在NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上进行BLAST比对，结果显示与预期一致，CCK九串联体(Z9CCK)核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。实施例2:cck-33九串联体(z9cck)重组蛋白的诱导表达及提取纯化(见图1①)1、试剂制备胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、P-巯基乙醇、十二烷基肌氨酸钠(SKL)、聚乙二醇4000(PEG4000)、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽均为上海生工生物工程有限公司的产品。2、缓冲液配制缓冲液A:50mol/LTris，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠，50mol/LNaCl，5%(体积比)甘油，调节pH至8.0，使用时添加0.5mmol/L的二硫苏糖醇。TE缓冲液(pH8.0):lOmmol/LTris.Cl,lmmol/L乙二胺四乙酸二钠。磷酸盐缓冲液(pH7.4):称取8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04，0.24gKH2PO4,溶于800mLddH20中，调pH至7.2,定容至1000mL。3、Z9CCK重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测将重组质粒pRSET-Z9CCK转化至大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中，挑取单菌落接种到装有3mLLB(含100吗/mL氨苄青霉素)液体培养基的细菌瓶中，37'C振荡培养10-14小时。将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pRSTE-Z9CCK的培养物以1%(体积比)量分别接种到两个装有3mLLB(含100pg/mL氨苄青霉素)液体培养基的细菌瓶中。其中一个37'C振荡培养7小时，作为未诱导的对照，另一个37'C振荡培养3小时后开始诱导，添加IPTG至终浓度lmmol/L，继续37'C振荡培养4小时。结束后各取出500pL菌液于新的1.5mL离心管中，12000转/分钟离心30s。去上清，加入50pL样品溶解液，用枪吹打均匀。100'C水浴5分钟，12000转/分钟离心5分钟，取10^上清进行SDS-PAGE检测。4、Z9CCK重组蛋白可溶性分析将上述诱导表达的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK培养物以1%(体积比)量接种到一个装有5mLLB(含100吗/mL氨节青霉素)培养基的细菌瓶中，37'C振荡培养8小时，4'C放置过夜。将菌液倒入装有50mLLB(含100ng/mL氨苄青霉素)培养基的盐水瓶中，在37'C诱导表达。将菌液转入两个50mL离心管中，4'C，8G00转/分钟离心5分钟。弃上清，菌体用1/10(体积比)缓冲液A重悬，180w超声波处理8次，间隔10s/次。4'C,12000转/分钟离心10分钟，将上清转入另一新的50mL离心管中，沉淀用等体积的缓冲液A重悬。从上清和沉淀中各取50^L加入等体积的样品溶解液,处理好样品进行SDS-PAGE检测。5、Z9CCK重组蛋白的提取纯化将200mL的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK培养物5000转/分钟离心10分钟收集菌体，再将菌体重悬于20mL的缓冲液A中，并添加0.05%(质量体积比)的溶菌酶，37'C温育15分钟，然后进行超声波破碎。超声强度设为180W，冰浴超声破碎10次左右，每次20秒-30秒，间隔2分钟，直至溶液变为清亮为佳。将破碎后的混合液12000转/分钟离心10分钟，去上清，磷酸盐缓冲液缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀3次，收集沉淀。，将上述收集的沉淀重悬于含0.3。/。SKL的缓沖液A中，充分振荡混匀后室温静置30分钟-2小时。将溶液分装至透析袋内，加入终浓度为0.2%(质量体积比)的PEG4000与lmmol/L氧化型:还原型谷胱甘肽(摩尔比为:4)帮助变性的蛋白质复性即恢复天然构象，用大于20倍体积的TE缓冲液(pH8.0)进行4'C搅拌透析复性、纯化，每4小时换液一次，换液6次后收集蛋白溶液，过滤除菌后分装置-2(TC冻存。用SDS-PAGE检测提纯后的菌毛蛋白纯度，Bradford法测定蛋白质浓度。IPTG诱导CCK多串联体重组大肠杆菌BL21(DE3)/(pRSET-Z3CCK、pRSET-Z5CCK、pRSET-Z7CCK、pRSET-Z9CCK)表达，结果见图4。将重组质粒pRSET-Z9CCK转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导后，SDS-PAGE检测发现，与在42.1kDa左右处出现一条明显的蛋白带，与预测的分子量大小一致，其表达量占大肠杆菌菌体总蛋白的35.6%(见图4)。申请人将该目的蛋白命名为Z9CCK重组蛋白。在本发明中，Z9CCK重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中主要以包涵体形式存在。本发明构建的Z9CCK重组蛋白的氨基酸序列如下(同时可见序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列)显示了Z9CCK重组蛋白的全部氨基酸序列，其中用下划线表示的为猪CCK-33单体，斜体为连接两个CCK-33单体的由5个氨基酸组成的连接肽)，共370个氨基酸。用下划线表示的为已报道的猪CCK-33单体(GenBank，登录号为NP—999402.1)，斜体为连接两个CCK-33单体的连接肽。SGRVSMIKNLOSLDPSHRISDRDYMGWMDFZ9CCK重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中主要以包涵体的形式存在，包涵体经洗涤、变性、复性、透析之后可以得到比较纯的Z9CCK重组蛋白，分子量大小为42.1kD,与预期一致，见图5实施例3:Z9CCK重组蛋白的抗原性(见图1②，③，，)1、Westernblot缓冲液配制电转缓冲液称取2.9g甘氨酸，5.8gTris，0.37gSDS，加200mL甲醇，最后定容至1000mL。Tris缓冲生理盐水(TBS):在95mLddH20中加入1.21gTris碱，8.77gNaCl，充分溶解，调pH至8.0后，定容至1000mL。TBST缓冲液含0.05%(体积比)Tween-20的TBS。封闭液含1。/。(体积比)牛血清白蛋白(BSA)的TBST。底物液9mL0.01mol/LTris-Cl(pH7.6)溶解6mg二氨基联苯氨(DAB)，加入lmL0.3%(质量体积比)NiCl2或CoCl2，再加35|^30%(质量体积比)11202,8mLTBS，现配现用。2、Z9CCK重组蛋白抗原性预测(见图l③)参照网址http:〃tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb一input上介绍的"BepipredLinearEpitopePrediction"预测方法，将Z9CCK重组蛋白氨基酸序列输入B细胞线性表位预测栏里，对Z9CCK重组蛋白进行抗原性预测。3、Westernblot检测Z9CCK重组蛋白的免疫原性(见图1)(1)电转化将Z9CCK重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，当电泳将结束时，用蒸馏水淋洗石墨板，用吸水纸擦干。戴上手套，切6张3MM滤纸和1张硝酸纤维素滤膜。滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶，否则滤纸边缘的接触会造成电流短路。将硝酸纤维素滤膜悬浮于去离子水表面，借毛细作用使膜从下往上润湿后，将膜完全浸没于水中，浸泡5分钟以除去滤膜上残留的气泡，用软铅笔在滤膜一角做标记。另外，将6张滤纸浸泡于少量电转缓冲液。戴上手套安装转移装置，平放底部电极(阳极)，石墨一边朝上，在这一电极上放置3张浸泡过的滤纸，准确对齐，赶尽气泡，同样方法将硝酸纤维素滤膜放在滤纸上，确保对齐无气泡。从电泳槽上取下凝胶，转移到去离子水中略为漂后，平放于硝酸纤维素滤膜上，凝胶左下角与滤膜标记对齐，同样对齐并去除气泡。最后再将另外3张滤纸放在凝胶上方，同样确准精确对齐无气泡。将靠上方的电极(阴极)放于夹层物上，石墨一边朝下，接通电源，根据凝胶面积按0.65-1.0mA/cm2调整电流，电转2小时左右。13(2)染色SDS-PAGE结束后，切下带有分子量标准的凝胶直接进行染色脱色，作为分子量对照。电转后的凝胶放入SDS-PAGE染色液中，染色4小时后置于脱色液中振荡，每隔一段时间换一次脱色液，直至背景很浅为止，以此判断电转的效率。(3)封闭把硝酸纤维素滤膜放入可加热封接的塑料袋中，以滤膜面积0.1-0.15mL/cm2的量加入封闭液(含1%(质量体积比)BSA的TBST),尽可能排除气泡后密闭袋口，平放于摇床上室温(20°C-25'C，以下相同)温育0.5-1小时，剪开塑料袋，弃去封闭液。(4)第一抗体和靶蛋白结合把硝酸纤维素滤膜放入一新的塑料袋中，按0.1-0.15mL/cn^的量加入用TBST以1:100稀释的HisTag标签抗体，排除气泡后密闭袋口，平放于摇床上室温温育1小时。剪开塑料袋口，将硝酸纤维素滤膜用TBST洗3遍，每次5-10分钟。(5)酶标二抗与硝酸纤维素滤膜的温育把硝酸纤维素滤膜放入一新的塑料袋中，按0.1-0.15mL/cm2的量加入用TBST以1:2500稀释的辣根过氧化物酶标记的二级抗体，排除气泡后密闭袋口，平放于摇床上室温温育0.5-1小时。剪开塑料袋口，将硝酸纤维素滤膜用TBST洗3遍，每次5-10分钟。再用TBS洗2遍，每次5-10分钟。(6)加入底物显色把硝酸纤维素滤膜放入10mL底物液中，显色1-15分钟，一旦出现蛋白带，立即用去离子水终止，即可观察拍照。根据网上在线预测Z9CCK抗原性分析结果(见图6)，本发明制备的Z9CCK重组蛋白在第48-56,67-77,86-94,105-115,124-132,143-153,162-170,181-191,200-208，219-229,238-246,257-267，276-284,295-305，314-322,333-343,352-360氨基酸序列处具有连续的线性抗原性表位。对于CCK-33单体分子来说，本身具有两个表位(l-6:PKAPSGR;16-24:SLDPSHRIS),其中1-6的线性表位是和连接每两个CCK-33单体的由5个氨基酸组成的linker—起组成的抗原表位。每增加一个CCK-33串联体，就增加两个抗原决定簇，Z9CCK具有由CCK分子多串联体提供的18个连续线性抗原表位。另外，在第14-39氨基酸序列位置为与Z9CCK蛋白一起融合表达的蛋白提供的连续线性表位。由此说明Z9CCK重组蛋白经过抗原性预测证明其具有较好的免疫原性。以兔抗CCK-8阳性抗血清(美国sigma公司产品)为一抗，以山羊抗兔抗体(美国SBA公司产品)为二抗，对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK诱导表达后的全菌总蛋白产物进行Westernblot检测(见图7)，在重组大肠杆菌中检测到大小约为42kD的阳性反应特异性条带，无其它杂带，表明BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK诱导表达的Z9CCK重组蛋白能被CCK-8抗体所识别，确证Z9CCK在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，所表达产物即为本发明的目的蛋白(Z9CCK重组蛋白)。从而完成了用标准抗体来验证Z9CCK重组蛋白的免疫原性。4、ELISA检测验证Z9CCK重组蛋白的抗原性(见图1)用化学合成的CCK-8标准品作包被抗原，ELISA检测Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪产生的抗体滴度的结果见实施例4，此方法用标准抗原来检测Z9CCK抗体，反过来验证Z9CCK重组蛋白的抗原性。实施例4:利用Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪，研究该重组蛋白对猪生长性能的影响(见图l，⑧)1、试验设计试验于2007年11月到2008年1月在华中农业大学试验猪场进行。选择63日龄左右、平均体重22.8kg左右的"长新"二元杂交去势公猪72头，按体重日龄基本一致的原则随机分为两组，每组9个重复，每个重复4头猪，共36头/组，在同一栋猪舍进行试验，试验组免疫Z9CCK重组蛋白油乳苗，对照组免疫生理盐水，饲养试验为期70d。2、试验日粮试验日粮根据NRCU998)各阶段猪营养需要配置。试验组和对照组日粮完全相同，配方见表2。表2试验日粮组成(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2的说明1)预混料提供每千克日粮维生素A8400IU，维生素D31800IU，维生素E150mg,维生素K1.9mg;维生素B11.9mg,维生素B24.5mg，烟酸19mg，D-泛酸6mg,维生素B62.3mg，维生素B120.06mg，D-生物素0.08mg,叶酸9.4mg，钙5.8g，磷3.4g，钠0.8g，氯0.6g，铜15mg,铁38mg，锰23mg,锌60mg，碘0.6mg。2)预混料提供每千克日粮维生素A9700IU,维生素D32100IU,维生素E160mg，维生素K0.9mg;维生素B11.9mg，维生素824.50^，烟酸13mg,D陽泛酸4mg，维生素B62.0mg,维生素B120.03mg，D-生物素0.04mg，叶酸5.6mg，钙5.4g，磷2.8g，钠0.8g,氯0.6g，铜17mg，铁43mg，锰23mg,锌68mg，碘0.6mg。3)上述营养水平是计算值。3、饲喂管理饲养试验期间，日喂猪2次，分别于早上8:00和下午4:00饲喂，每次以吃饱略剩料为限，试验期间猪自由采食和饮水，猪舍保持清洁卫生及消毒。4、猪生长性能指标测定以栏为单位(4头猪)记录每次喂料量，并于第二天早上喂料前对前一天的剩余料称重。记录每栏4头猪的总体日采食量，日采食量=上午喂料量+下午喂料量-剩余饲料量。以栏为单位计算每栏4头猪的2周内的平均日采食量，为1个重复。每个重复的平均日釆食量-4头猪2周的总采食量/4头猪/14d;每2周对所有猪称一次体重，每次对每个栏4头猪随机一头一头地称，记录每头猪的体重，称完一个栏的4头猪后，再称下一栏。以栏为单位，每栏为l个重复，计算每栏4头猪的2周的平均日增重，平均日增重=每栏4头猪2周的总增重/4头猪/14d;料肉比以栏为单位，每栏为l个重复，料肉比=每栏4头猪2周的总体采食量/每栏4头猪2周的总增重。试验组和对照组各9个重复统计。5、Z9CCK重组蛋白油乳苗的制备向提纯后的Z9CCK重组蛋白溶液中加入吐温-80(吐温80终浓度为4%(体积比)，已经过121'C高压灭菌30分钟)，与等体积的白油佐剂(配制方法94mL白油，6mL司本-80，2g硬脂酸铝，混合均匀后，12rC高压灭菌30分钟，冷却至室温备用)，充分混合后乳化制成浓度为50(Hig/mL的重组蛋白油乳苗。6、免疫程序及血液样品采集分别于试验期第一天进行初次免疫试验猪，第29、57d两次加强免疫。试验组免疫Z9CCK重组蛋白疫苗，免疫剂量为2mL/头/次，对照组用免疫2mL生理盐水代替。试验期间分别于试验期第1、15、29、43、57、71d，试验组、对照组各选取10头猪前腔静脉采血一次，3500转/分钟离心IO分钟分离血清，-2(TC保存，用于测定血清中CCK抗体滴度。7、用CCK-8作包被抗原对血清中CCK抗体效价的测定抗原包被聚苯乙烯酶标板先经紫外线照射后，再将含有体积比为0.125%(体积比)戊二醛的磷酸盐缓冲液(pH7.0)加入酶标板中，反应数小时，洗涤，干燥，逐孔加入CCK-8溶液(10ng/mL,100nL/孔)，室温放置过夜，洗涤液洗涤三次，用0.33mol/L的乙醇胺溶液封闭处理后，用洗涤液洗涤3次，再加入用保温液按l:20稀释后的待测血清，在37'C孵育2小时，洗涤3次，加入羊抗猪二抗(购自美国SBA公司)，37'C孵育30分钟，洗涤后加入TMB底物溶液，37'C反应15分钟左右，每孔加入50nL终止液，在酶标仪以450nm波长测定吸光值，从而确定血液中CCK抗体滴度。8、动态采血及血液指标测定留置针温州华利医疗器械有限公司生产，产品型号为16G蝴蝶型，套管外径1.6mm,套管长度51mrn，流量2140ml。饲养试验结束后，对照组和试验组各随机选取体重一致的4头猪，于限位栏里单独饲养。适应3天后，在8头猪的耳静脉中安装留置针，分别于采食前O分钟采血一次，给足词料量，让猪自由采食，再分别于给料后15分钟、30分钟、1小时、2小时各采血一次，每次釆血3mL,每次采完血液之后立即注入2%(质量体积比)的肝素钠2mL,盖好肝素帽。采集的血液装在预先加入10%(质量体积比)乙二胺四乙酸二钠和20nl抑肽酶(500KIU)的离心管中混匀，4'C，3500转/分钟离心10分钟，分离血浆，-SO'C保存，用于测定血液中CCK、胰岛素、血糖含量。9、CCK、胰岛素和血糖含量的测定均用相关试剂盒测定。CC1^浓度测定用美国ADL公司生产的猪胆囊收縮素ELISA试剂盒分析，操作步骤按试剂盒上的说明书介绍的方法进行。胰岛素浓度测定用北京科美东雅生物技术有限公司生产的放免试剂盒分析，操作步骤按试剂盒上的说明书介绍的方法进行。血糖浓度测定用上海名典生物工程有限公司生产的葡萄糖测定试剂盒分析，操作幾骤按试剂盒上的说明书介绍的方法进行。10、试验结果分析平均日采食量、平均日增重、料肉比、血液中CCK、胰岛素、血糖浓度等数据用歹土SD表示，采用SAS8.1统计分析软件ttest程序进行T检验。(1)Z9CCK重组蛋白主动免疫对猪生长性能的影响1-4周，试验组和对照组采食量和日增重都没有显著差异。5-6周，随着试验组猪体内CCK抗体的增加，试验组采食量和日增重与对照组相比又提高的趋势，分别比对照组提高了3.72%(/M).10)和5.89%(P=0.07)。7-8周试验组猪体内存在大量CCK抗体，中和了部分内源性的CCK,CCK主动免疫调节动物食欲的效果逐渐明显。试验组采食量和日增重分别比对照组提高了5.02%(尸=0.31)和6.38%(尸=0.34)。9-10周试验组采食量比对照组提高了7.22%(/>=0.09),日增重比对照组提高了3.80%,差异不显著。全期试验组采食量比对照组提高了2.23%(尸=0.23)，日增重比对照组提高了2.03%,差异不显著(见表3)。由此表明Z9CCK重组蛋白主动免疫能提高生长肥育猪的采食量和日增重。表3猪Z9CCK重组蛋白主动免疫对生长肥育猪生长性能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(2)Z9CCK主动免疫对生长猪血清中CCK抗体滴度的影响试验期15d之后，在试验组猪体内才有CCK抗体产生，此后抗体含量一直上升，试验期第29d在猪体内可以明显地检测到CCK抗体，CCK抗体滴度与对照组相比差异显著(尸<0.05)。第29d之后，猪体内CCK抗体继续上升，并在试验期第43d,CCK抗体滴度达到峰值，与对照组相比差异极显著(户O.Ol)。第43d之后，试验组猪体内CCK抗体水平缓慢下降，但是，第57d、71d试验组的CCK抗体水平与对照组相比差异仍极显著(户<0.01)(见图8)。(3)Z9CCK主动免疫对猪部分血液生化指标的影响1)对血液中CCK含量的影响对照组采食前O分钟血液中CCK含量比试验组低，差异不显著。随着采食过程的进行和饱感的逐步产生，试验组体内CCK含量可能受到CCK抗体的中和作用而降低，对照组采食后CCK升高，15分钟试验组血浆中CCK含量比对照组略低一些，差异不显著。30分钟时，试验组血液中CCK比对照组低10.49%差异不显著(尸=0.22)。1小时时，试验组血液中CCK仍比对照组分别低4.73。/。(i^0.13)。2小时时，对照组血液中CCK达到峰值，试验组比对照组低32.65%,差异不显著(见图9)。2)Z9CCK主动免疫对胰岛素的影响采食前O分钟时，试验组和对照组猪都处于饥饿状态，血液中胰岛素没有显著差异。喂料后15分钟，对照组体内胰岛素含量上升，试验组却下降了一些，试验组猪体内胰岛素含量显著低于对照组(户<0.05)，比对照组低31.62%。采食后30分钟，随着猪采食饱感的增加，胰岛素可能主要受食糜或血糖等其它因素的调节影响，试验组和对照组体内胰岛素都迅速增加，差异不显著。1小时后，两组猪都完成了采食，血液中胰岛素含量达到顶峰，2小时后开始下降，两者胰岛素浓度差异不显著(见图IO)。3)Z9CCK主动免疫对血糖的影响采食前Omin时，试验组和对照组猪都处于饥饿状态，体内血糖含量都较低，采食15分钟后，试验组猪体内血糖有所上升，对照组上升不明显，两组血糖水平没有显著差异。釆食30分钟后，两组猪体内血糖进一步升高，直到1小时后，两组猪都结束了采食，体内血糖水平达到顶峰，试验组比对照血糖浓度高17.35%CP=0.19)。2小时后，两组血糖浓度都有所下降，试验组比对照组高10.81%(户=0.23)(见图11)。由血糖与胰岛素浓度的测定结果可以看出，除了采食后15分钟时，血糖浓度与胰岛素浓度成反比，其它时间点试验组和对照组相比，血糖浓度和胰岛素浓度成正比，这可能是因为血液中胰岛素浓度和血糖浓度主要受采食后食物的影响而都升高的原因。实施例5:以Z9CCK重组蛋白为免疫原制备卵黄抗体(见图l⑦)1、缓冲液配制磷酸盐缓冲液II:NaC18.0g，KH2PO40.2g，Na2HP04'12H202.9g,KC10.2g,溶于卯OmL蒸馏水中，lmol/LHCl调pH至7.4，用蒸馏水定容至1000mL,于121'C高压灭菌15-20分钟备用。磷酸盐缓冲液III缓冲液NaC18.0g，KH2PO40.2g，Na2HP04'12H202.9g，KC1，0.2g，溶于400mL蒸馏水中，lmol/LHCl调pH至7.2,用蒸馏水定容至500mL，于121'C高压灭菌15-20分钟备用。包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液)NaHC032.93g;Na2C031.95g;溶于900mL蒸馏水中，10mol/LNaOH调pH至9.6，用蒸馏水定容至1000mL洗涤液(磷酸盐缓冲液-T):含0.05%(体积比)吐温-20的磷酸盐缓冲液II保温液(磷酸盐缓沖液-BSA):含3%(质量体积比)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液II底物液邻苯二胺40mg，溶于100mLpH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液(0.2mol/LNa2HP0451.4mL，0.1mol/L柠檬酸48.6mL，蒸馏水100mL混匀即可)，再加入30%(质量体积比)H2020.15mL即可，现配现用。终止液2mol/LH2S04溶液(浓硫酸22.2mL，蒸馏水177.8mL，混匀即可)，2、Z9CCK重组蛋白油乳苗的制备向提纯后的Z9CCK重组蛋白溶液中加入吐温-80(吐温80终浓度为4%(体积比)，已经过121'C高压灭菌30分钟)，与等体积的白油佐剂(配制方法94mL白油，6mL司本-80，2g硬脂酸铝，混合均匀后，12rC高压灭菌30分钟，冷却至室温备用)，充分混合后乳化制成浓度为50(Hig/mL的重组蛋白油乳苗。3、蛋鸡的免疫选择950只28周龄左右高产海兰褐蛋鸡随机分为两组，空白组200只，试验组Z9CCK组750只、对照组每只鸡分别胸肌注射lmL(两侧各500nL)生理盐水；试验组Z9CCK则胸肌注射lmL浓度为500呢/mL重组蛋白与白油佐剂等体积混合的油乳苗。首免2周后，各组分别用与白油佐剂等体积混合的500pg/mL抗原加强免疫1次；间隔2周再采用同样方式进行第三次免疫。2免后每周各组均采集30枚鸡蛋样品，ELISA监测卵黄抗体效价的变化。4、CCK卵黄抗体全蛋粉的制备当ELISA方法(见下描述)监测经Z9CCK重组蛋白油乳苗主动免疫的产蛋鸡鸡蛋中CCK卵黄抗体效价达到高峰后开始收集鸡蛋500kg，按照程学慧(2003)的方法进行喷雾干燥(14CrC进气，65'C出气)加工成全蛋粉。分别采取喷雾干燥加工过程中卵黄粉出来的前、中、后不同时期的样品，检测卵黄粉中CCK抗体效价。收集对照组免疫生理盐水的产蛋鸡产下的鸡蛋500kg，按照程学慧(2003)的方法进行喷雾干燥(140'C进气，65'C出气)加工成全蛋粉，作为实施例6中对照组母猪日粮添加用。5、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价(1)卵黄样品的处理鸡蛋处理鸡蛋打破后，除去卵白和卵黄膜，取lmL卵黄液，用lmL磷酸缓冲液m混合，再加入4mL氯仿，室温放置l小时，然后以3000xg离心20min，取上清用磷酸缓冲液III稀释20倍，-20°0保存待测。卵黄抗体全蛋粉的处理取lg卵黄粉，用4mL磷酸缓沖液HI混合，再加入8mL氯仿，室温放置1小时，然后3000xg离心20min,取上清用磷酸缓冲液III稀释20倍，-20'C保存待测。〔2)卵黄抗体效价的测定用方阵滴定法(吴仁蔚等，2006)确定最佳Z9CCK重组蛋白抗原包被量与抗体稀释度。取酶标板(8x12孔)，横排将抗原从l:20倍比稀释到1:2560,竖排将抗体从l:20倍比稀释至1:640,进行ELISA试验。整个实验重复三次，综合三次试验结果，以OD42Q值大幅度降低时抗原稀释度的前一稀释度对应的蛋白含量为最佳抗原包被浓度，以最佳抗原包被浓度下阳性抗体OD45。值大幅度降低时血清稀释度的前一稀释度对应的为抗体最佳稀释度。用lOO^L最佳包被浓度的包被抗原溶液包被96孔聚乙烯板，4'C过夜(18小时-24小时)，弃去，用洗涤液沖洗3次，每次3min，弃去，然后用150pL的保温液37'C温育1小时，弃去，如前洗涤3次，每孔加入100nL待测抗体(l:10、1:20.......用磷酸缓冲液II稀释)37'C温育1小时，弃去，如前洗漆5次，每孔加入100nL辣根过氧化物酶标记的酶标二抗稀释液(l:15000,洗涤液稀释)，25'C包被30min，弃去，如前洗涤5次，最后每孔加入100nL底物液，显色后用50|_iL终止液终止反应，酶标仪检测OD45o值。样品OD450值与阴性值之比大于2.1判为阳性，并以出现阳性反应的最高稀释度为抗体滴度(效价)。2免1周后开始收集鸡蛋，每周随机从试验组750只蛋鸡的产蛋中收集鸡蛋30枚，鸡蛋样品处理后，用提纯的Z9CCK重组蛋白作为包被抗原，间接ELISA方法检测2免1,3,5,7,11，15,22周鸡蛋中卵黄抗体的效价。用CCK-8(购自Sigma公司)和牛血清白蛋白交联物作包被抗原，随机选取2免15周的24个鸡蛋样品，检测CCK抗体效价。分别采取喷雾干燥加工过程中卵黄粉出来的前、中、后不同时期的样品，共12个，用提纯的Z9CCK重组蛋白作为包被抗原，间接ELISA方法检测抗体效价。从12个样品中随机选取3个卵黄粉样品，用CCK-8和BSA交联物作包被抗原，检测卵黄中CCK抗体效价。通过蛋鸡免疫试验证明Z9CCK重组蛋白具有免疫原性，能够引起蛋鸡免疫应答反应，并可以诱导产生抗CCK8特异性卵黄抗体。在首免后第3周，CCK卵黄抗体的平均效价已达到103以上，2免后第5周，也即是3免后1周，CCK抗体水平达到高峰，此后开々台出现缓慢下降的趋势。CCK卵黄抗体全蛋粉的平均效价为22627.42(见表4和,12)。_表4复性Z9CCK包涵体导产生的卵黄抗体平均效价抗原2免后时间(周)1357111522Z9CCK2827.454787.4673516.6932000.0017148.3816387.038900.25_±2.09_±2.09_±1.70_±2.34_±2.82_41.70_±1.95用未硫酸化的化学合成的CCK-8与BSA交联物作包被抗原，ELISA抽样检测2免15周CCK抗体效价为3591.88。2免5周之后开始收集鸡蛋500kg进行喷雾干燥，对喷雾干燥全蛋粉抽样进行ELISA效价测定(用提纯的Z9CCK重组蛋白作包被抗原)，结果表明CCK卵黄抗体全蛋粉的平均效价为22627.42。用CCK-8与BSA交联物作包被抗原，ELISA抽样检测卵黄粉中CCK抗体效价为2000.00。实施例6:CCK卵黄抗体在泌乳期母猪日粮中的应用(见图l,⑦)1、试验动物及分组本试验于2007年9月-10月在武汉中粮公司江夏猪场进行。选取52头妊娠后期健康经产母猪(3-6胎)，按胎次、体况、体重、往胎产仔数和预产期相近的原则，随机分成2组，每组26个重复栏，每栏一头母猪。2、试验设计与日粮配方试验采用单因素设计，泌乳期21天。基础日粮根据美国NRC(1998)猪饲养标准母猪泌乳期营养需要配制玉米-豆粕型日粮。试验中，处理组和对照组分别在基础饲粮中添加1X的猪CCK-33多串联体卵黄抗体全蛋粉和1%的对照全蛋粉，日粮配方和营养水平见表5。3、饲养管理试验母猪于妊娠期第110天统一称重、消毒后转入分娩舍内。母猪每日8:00和16:00各喂料一次，分娩后的前三天适当限制饲养，根据食欲分别饲喂2.0kg、2.5kg、3.0kg左右；第四天起自由釆食(以次日料槽内略有剩料为准)；仔猪从出生后的第7d开始自由采食代乳料，母猪和仔猪均采用鸭嘴式饮水器自由饮水。观察并记录母猪乳房炎、便秘和哺乳仔猪的疾病情况并及时治疗。其他饲养管理和免疫程序均按规模化猪场统一执行。4、测定指标(1)母猪称重及体况评分母猪进入分娩舍及断奶时统一对每头母猪分别称重，计算泌乳期失重；观察并评判记录母猪体况评分，计算母猪泌乳期体况评分之差。评分采用5分制，其标准为5分为过肥；4分为偏肥；3分为膘情适中；2分为偏瘦；l分为过瘦。(2)母猪生产性能与仔猪生长性能分娩之初，根据母猪产活仔数和乳房情况调整母猪带仔数，使其在11头左右。记录每头母猪的带仔数、所带仔猪个体重、断奶仔猪数、断奶仔猪个体重、哺乳日龄、断奶时间和断奶后母猪首次发情时间。计算母猪的带仔窝重、带仔均重、断奶窝重、断奶仔猪个体均重、泌乳期仔猪平均日增重、仔猪断奶育成率(断奶仔猪数/带仔数)、和发情间隔。(3)母猪采食量记录每头母猪每日采食量，按周分别统计每头母猪的平均日采食量和哺乳全期平均日采食量。表5泌乳期日粮组成与营养水平(风干基础)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表5的说明:1)泌乳期每千克全价料含铜21mg,碘0.84mg，铁119mg，锰56mg，硒0.3mg,锌140mg，维生素A18000IU，维生素D3000IU,维生素E40IU，维生素K6mg，维生素B12.5mg，维生素B29mg,维生素B64.5mg，维生素B120.0315mg，生物素0.6mg,叶酸5mg,烟酸50mg。2)营养水平数据为计算值。5、统计分析所有试验数据均采用SAS8.0软件进行统计分析，处理间的差异采用t检验，百分数数据采用卡方检验。除百分数以外，所有数据均以平均数i标准差表示，PO.01为差异极显著，PO.05为差异显著。试验过程中，处理组中1头母猪产后无乳，1头母猪不吃粉料，1头母猪多次连续高烧，淘汰后剩下23头；对照组中l头母猪早产，l头母猪临产前后高烧、不采食而淘汰后，剩下24头。共剩下47头母猪参与统计分析。(1)日粮中添加CCK卵黄抗体对母猪采食量的影响试验中添加1XCCK卵黄抗体粉的处理组与对照组相比，母猪的平均日釆食量在泌乳期的第一周和第二周分别提高5.卯％、4.74%，但均差异不显著(P>0.05):第三周和整个泌乳期，处理组采食量分别提高7,63%、7.00%,且均差异显著(PO.05)(见表6)。表6母猪泌乳期各阶段平均采食量项目对照组处理组P值1-7天3.99±0.764.22±0.550.22968-14天6.20±1.066.49士0.850.299515-21天6.05±0.816.51±0.690.04121-21天5.41±0.735.79±0.520.0466(2)日粮中添加CCK卵黄抗体对母猪生产性能的影响与对照组相比，添加1%CCK卵黄抗体粉的处理组母猪泌乳期失重、体况评分损失分别降低了10.14%和27.76%，但均差异不显著(P>0.05);母猪发情间隔处理组要比对照组延长0.22天,但差异不显著(P>0.05)(见表7)表7CCK卵黄抗体对母猪体重、体况和发情间隔的影响项目对照组处理组P值母猪初始重1)257.22±31.39257.06±22.910.9693母猪断奶重247.04±28.55247.9]±26.960.8768母猪体重变化-10.18±14.67-9,15±12.320.7956入试时体况评分3.42±0.883.26±0.860.5437断奶时体况评分2.88±0.612.87±0.630.9761泌乳期吋体况评分之差-0.54±0.66-0.39士0.720.4592发情间隔(天)4.76±0.834.98±0.730.3500表7的说明1)母猪初始重=母猪入试重一胎衣重一所产仔猪重(活仔、死胎和木乃伊)。(3)日粮中添加CCK卵黄抗体对仔猪生长性能的影响与对照组相比，添加1XCCK卵黄抗体粉的处理组仔猪21日龄平均日增重、21日龄断奶仔猪均重分别提高了1.82%和1.37%,差异不显著(PX).05);处理组仔猪21日龄窝增重、21日龄断奶窝重分别比照组提高了6.58%(P>0.05)和5.96%(P>0.05)，；仔猪断奶育成率，处理组较对照组提高1.44%(P>0.05)(见表8)。试验中，仔猪断奶窝重提高了3.63kg，窝断奶仔猪数提高了0.51头，表明添加CCK卵黄抗体有利于母猪生产性能的发挥。表8日粮中添加CCK卵黄抗体对仔猪生长性能的影响项目对照组处理组P值母猪带仔数11.29±1.0411.65±1.110.2573带仔窝重(kg)16.38±2.7417.08±2.84.-0.3959带仔均重(kg)1.47±0.351.47±0.330.9064断奶仔猪数10.71±1.3011.22±1.170.1654断奶窝重l)(kg)62.61±8.1566.34±8.210.1251断奶均重l)(kg)5.85±1.485.93±1.280.4915平均日增重(g)208.61±62.32212.41±53.810.4595窝增重(kg)46.23±6.7349.27±7.500.1513断奶育成率(％)94.8396.270.4399表8的说明1)断奶日龄调整为21d后的数据。SEQUENCELISTING<110〉<120><130〉<160><170〉<210><211〉<212>〈213〉<220〉<221〉<222><223><400〉3tgegg华中农业大学包含Z9CCK蛋白的重组大肠杆菌及卵黄抗体与应用2Patentlnversion3.111110DNA猪胆囊收縮素-33(CCK-33)九串联体(Z9CCK)CDS(1).1(mo)Met1ggtGlyccgProctgLeugatAsp65attliegatAsptctSercatHiscgaArgArgggaGlyaaaLysgacAsp50tttPheaaaLystatTyrggtGlycgtArg130AspggtGlyGingetAla35ccgProggaGlyaacAsnatgMetcgtArg115attlieccgProtctSerc肪Gin20ccgProtctSergetAlactgLeuggtGly100gtgValtctSer3朋LyscatHis5￡itgMettctSercatHiscgaArgcagGin85tggTrptctSergatAspgetAlacatHisggtGlyggtGlycgtArggatAsp70tctSerMetatgMetcgtArgccgProC3tHiseggArgcgtArgattlie55ccgProctgLeugatAspattliegatAsp135tctSercatHisgatAspgtgVal40tctSeraaaLysgacAsptttPheaaaLys120tatTyrggtGlycatHisctgLeu25tctSergatAspgetAlaccgProggaGly105犯cAsnatgMetcgtcatHis10tacTyratgMetcgtArgccgProtctSer90getAlactgLeuggtGlygtgValGlygacAspattliegatAsptctSer75catHiscgsArgcagGintggTrptctSera>tgMetgatAspaaaLystatTyr60ggtGlycgtArggatAsptctSeratgMet140atgMetgetAlagacAsp肌cAsn45￡ltgMetcgtArgattlieccgProctgLeu125g￡ltAsplieageSerga>tAsp30ctgLeuatgMet15犯g匕yscagGinactThrgatAsptctSerggttgga_tgGlyTrpMetgtgValtctSeraaaLys110gacAsptctSergstAsp95getAlaccgProatgMet80cgtArgccgProtctSertttggagetPheGlyAlaaaaaacctgLysAsnLeu4896144192240288336384432■23145cagtctGinSerctgLeutggatggatTrpMetAsptctatgSerMetgatcgtAspArg210attlie195gatAspg￡LCAsptttPhe180a犯LysccgPro165g印Glyaa_cAsn150tctSercatHiscgtArggetcgagatAlaArgAsptata_tgTyrMetctg3LeuggtGlycagGintggTrp215tctSer200已tgMetattlieccgPro185ctgLeugatAsptctSer170aaa匕ysgacAspUtPhe155gatAspgetAlaccgProggaGlycgtArgccgProtctSergetAla220gattstAspTyrtctSercatHis205cgaArgggtGly190cgtArgAspatgMet175cgtArg160ggtGlygtgValatttctlieSerccg犯3ProLys528576624672getccgAlaPro225ccgtctProSerggagetGlyAlaaacctgAsnLeuatgggtMetGly290cgtgtgArgValatttctlieSerccg犯3ProLysctggacLeuAspgattttAspPhe370tctSercatHiscgaC3gGin275tggTrpggtGlycgtArggatAsp260tctSeratgMetgetAlaccgPro355ccgPro340tctSercgtArgattlie245ccgProgtgVal230tctSer犯a匕ysctggscLeuAspgattttAspPhetctatgSerMetgatcgtAspArgattliegatAsp325tctSercatHisLys310tatTyrggtGlycgtArgtctSergatAspgetAlaccgProggaGly295a_acAsnatgMetcgtArgattlieatgMetcgtArgccgProtctSer280getAlactgLeuggtGlygtgValtctSer360liegatAsptctSer265catHis犯aLystatTyr250ggtGlycgtArgAsn235atgMetcgtArgattliecgagatccgArgAspProcagGintggTrptctSer345gatAsptctSeratgMet3303tgMetcgtctgLeu315gfitAspattliegatAspctgLeuggtGlygtgValtctSeraaaLys300gacAspcagGintggTrptctSergatAsp285getAlaccgProtctSeratgMetatgMet270cgtLystatTyrAsnatgMet365ctgLeug￡LtAsp255attliegatAspgacAsp240tttPhea肌LystatTyrccgtctggtProSerGlytttggaPheGlytctSergetAlactgLeu350ggtGlycatHiscgaArg335cagGintggTrpcgtArg320gatAsptctSeratgMet7207688168649129601008105611041110<210>2<211〉370<212〉PRT<213〉猪胆囊收縮素-33(CCK-33)<400>2SerHisHisHisHisMetArg1GlyGlyProLysLeuAsp50AspPhe65lieLysAspTyrSerGlyHisArg130ArgAsp145GinSerTrpMetSerMetAspArg210AlaPro225ProSerGlyAlaAsnLeuMetGly290ArgValGlyGinAla35ProGlyAsnMetArg115lieProLeuAsplie195AspSerHisArgGin275TrpSerGin20ProSerAlaLeuGly100ValSerLysAspPhe180LysTyrGlyArgAsp260SerMetMet5MetSerHisArgGin85TrpSerAspAlaPro165GlyAsnMetArglie245ProLeuAsplieGlyGlyArgAsp70SerMetMetArgPro150SerAlaLeuGlyVal230SerLysAspPheLysArgArglie55ProLeuAsplieAsp135SerHisArgGinTrp215SerAspAlaProGly295AsnAspVal40SerLysAspPheLys120TyrGlyArgAspSer200MetMetArgProSer280AlaLeu九串联体(Z9CCK)HisHisGlyMetAlaAspAsplieLysAspLeu25SerHis10TyrAspAlaProGly105AsnMetArgliePro185LeuAsplieAspSer265HisArgGinMetArgProSer90AlaLeuGlyValSer170LysAspPheLysTyr250GlyArgAspSerSer75HisArgGinTrpSer155AspAlaProGlyAsn235MetArglieProLeuTyr60GlyArgAspSerMet140MetArgProSerAla220LeuGlyValSerLys300AspAspAsn45MetArglieProLeu125AsplieAspSerHis205ArgGinTrpSerAsp285AlaProSerMetThr15AspLysAsp30LeuGinSerGlyTrpMetValSerMet80SerAspArg95LysAlaPro110AspProSerPheGlyAlaLysAsnLeu160TyrMetGly175GlyArgVal190ArglieSerAspProLysSerLeuAsp240MetAspPhe255MetlieLys270ArgAspTyrProSerGlySerHisArg305310315320lieSerAspArgAspTyrMetGlyTrpMetAspPheGlyAlaArgAsp325330335ProLysAlaProSerGlyArgValSerMetlieLysAsnLeuGinSer340345350LeuAspProSerHisArglieSerAspArgAspTyrMetGlyTrpMet355360365AspPhe370权利要求1、一种分离的重组蛋白，其序列为SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2、一种表达Z9CCK重组蛋白的大肠杆菌五^/^n'c/n'aco/z'BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK，含有权利要求1所述的核苷酸序列，CCTCCNO:M208103。3、一种分离的重组蛋白，其序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。4、权利要求2所述的重组大肠杆菌在制备卵黄抗体制品中的应用。5、权利要求3所述的重组蛋白在制备卵黄抗体制品中的应用。全文摘要本发明公开了一种包含Z9CCK蛋白的重组大肠杆菌及卵黄抗体与应用，一种经大肠杆菌偏爱密码子优化后的猪胆囊收缩素-33(CCK-33)基因多串联体重组质粒的构建，猪CCK-33多串联体重组蛋白在大肠杆菌中的表达，Z9CCK(猪CCK-33九串联体)重组蛋白的纯化及其在制备卵黄抗体制品中的应用。利用多串联体构建技术等基因工程技术构建了重组质粒pRSET-Z9CCK，将所述的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导重组大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)/pRSET-Z9CCK表达Z9CCK蛋白，从3个方面验证了Z9CCK重组蛋白具有良好的抗原性。利用所述的Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪，研究了其对猪生长性能及部分血液生化指标的影响；利用所述的Z9CCK重组蛋白主动免疫产蛋鸡，制备了CCK卵黄抗体全蛋粉，利用所述的CCK卵黄抗体提高哺乳期母猪的采食量、仔猪的生长性能。文档编号C12N1/21GK101307104SQ200810048379公开日2008年11月19日申请日期2008年7月11日优先权日2008年7月11日发明者健彭,罗何峰,苟钟勇,蒋思文申请人:华中农业大学