植物冷诱导表达启动子POsCold9及其衍生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻 冷诱导表达启动子P〇sCold9及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中有条件地 驱动目标基因的表达。
【背景技术】
[0002] 水稻是重要的粮食作物，冷害是影响水稻生产的重要限制因子之一。芽期、苗期和 孕穗开花期遭遇冷害，将导致水稻幼苗生长迟缓、分蘖减少，最终造成水稻产量的大幅度降 低。水稻低温冷害是指水稻遭遇发育所需最低临界温度以下的温度，造成水稻的生理损伤， 导致水稻不能正常生长发育而使产量降低。水稻生育期中有4个时期最易受冷害影响，分 别是芽期、苗期、孕穗期和开花灌浆期，其中孕穗期冷害与水稻产量具有密切的关系。孕穗 期冷害是指水稻进入生殖生长到开始抽穗开花期间受到低温的影响，导致花粉发育不正 常继而影响正常开花授粉形成空壳的一种冷害。这类冷害常在日本东北部及北海道、菲律 宾北部、印度北部山区、印度尼西亚山区、尼泊尔、美国加利福尼亚州和我国的东北、云贵高 原粳稻区及长江中下游地区的晚稻中发生。
[0003] 低温冷害对水稻的危害是多方面的。水稻对温度、光照等都有一个界限要求，当超 出忍受的高低温限度时，轻则受害，重则坏死。水稻在春季遇到低温不但降低秧苗质量推迟 插秧期，更大的问题是延迟返青分蘖和穗分化，对抽穗影响最大。营养生长期内受低温冷 害，穗原始体分化一般推迟5-10d，晚抽穗7d左右。障碍型冷害的危害在水稻生殖生长期遭 受低温危害，成为不育空粒以致明显减产。水稻孕穗期对低温敏感，容易造成不孕；抽穗开 花期受到低温危害，颖壳不张开花药不开裂，花粉不发育，所以造成不育粒。混合型冷害一 般对水稻的危害最大。低温冷害也可造成稻瘟病、水稻鞘腐败病等的发生。
[0004] 另外，温度也是影响水稻籽粒品质的一个重要的环境因素。因此，解决水稻冷害问 题对于世界食物安全、促进水稻产区的经济发展具有十分重要的现实意义。
[0005] 植物中存在着一个复杂的低温胁迫信号应答网络系统。植物在受到低温胁迫后能 通过该系统进行一系列的基因遗传修饰，对自身的代谢和生长进行调节以适应该不利因素 对其造成的影响。利用这一应答网络中关键基因，可以有效提高植物对低温的耐受性。
[0006] 仲康等（2007)将锌指蛋白类似蛋白OsCOIN基因在水稻中过量表达使转基因水稻 中脯氨酸含量升高，提高植物的耐冷性。张红生等（2009)将水稻锌指蛋白ZFP245基因在水 稻中过量表达，发现超量表达ZFP245基因水稻在冷胁近下使脯氨酸积累相关基因0sP5CS 和脯氨酸转运基因OsProT基因的表达量提高，促使脯氨酸的量增加，增强植物的耐冷性。 余淑美等（2010)发现MYBS3超量表达水稻能在4°C下处理以后可以存活，且不影响其主要 农艺性状。另外，对一些包括DREB/CBF、NAC等转录因子的过量表达可以提高水稻的耐冷 性。
[0007] 我国水稻资源丰富，从水稻中发掘、定位、克隆耐冷相关基因及其冷诱导启动子将 对水稻耐冷品种的选育具有重要的理论及实际意义，在农业领域将具有广阔的应用和市场 前景。因此，人们迫切希望找到更多的特异性启动子，用于提高水稻的耐冷性。
【发明内容】
[0008] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种分离鉴定本底信号低、诱导性高的新型 启动子，这种启动子对作物基因工程，尤其是水稻冷害耐受方面将有着重要的意义。
[0009] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻冷诱导表达启动子P0sCold9,所 述水稻冷诱导表达启动子P〇sCold9能够驱动目标基因在冷诱导条件下特异性表达。
[0010] 优选地，所述水稻冷诱导表达启动子P〇sCold9包含：
[0011] (a) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列；或者
[0012] (b)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够驱动目 标基因在冷诱导条件下特异性表达的核苷酸序列；或者
[0013] (c)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够驱动目 标基因在冷诱导条件下特异性表达的核苷酸序列；或者
[0014] (d)SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够驱动目标基 因在冷诱导条件下特异性表达的核苷酸序列；或者
[0015] (e)与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且能够驱动目标 基因在冷诱导条件下特异性表达的核苷酸序列；或者
[0016] (f)在严格条件下与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列杂交且能够驱动目标基因 在冷诱导条件下特异性表达的核苷酸序列；
[0017] (g)SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列；或者
[0018] (h)与SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的且能够驱动目标 基因在冷诱导条件下特异性表达的核苷酸序列；或者
[0019] (i)在SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够驱动目 标基因在冷诱导条件下特异性表达的核苷酸序列；或者
[0020] (j)在SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够驱动目 标基因在冷诱导条件下特异性表达的核苷酸序列；或者
[0021] (k)在SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够驱动目标 基因在冷诱导条件下特异性表达的核苷酸序列；或者
[0022] (1)在严格条件下与SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列杂交且能够驱动目标基因 在冷诱导条件下特异性表达的核苷酸序列。
[0023] 这些水稻冷诱导表达启动子序列与SEQ ID No: 1和2所示的DNA序列具有相同的 功能，即驱动目标基因在冷诱导条件下在植物中表达。
[0024] 序列表中SEQ ID No: 1和2所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)的水稻冷诱导表达启动子，本文中称为P0sCold9或启动子P0sCold9。具 体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括 转录起始位点在内的2015bp的DNA序列，具有驱动目标基因在冷诱导条件下表达的功能， 并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。
[0025] 另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻冷诱导表达启动子P0sCold9的表达 盒。
[0026] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水 稻冷诱导表达启动子P〇sCold9,在所述重组表达载体中，所述水稻冷诱导表达启动子 P0sCold9连接于待表达的基因序列的上游；优选的，所述待表达的基因为Gus基因，所述 重组表达载体为pCAMBIA1391-P0sCold9,该重组表达载体为将SEQ ID No:l所示的序列 即P0sCold9或启动子P0sCold9构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为 pCAMBIA1391-P0sCold9〇
[0027] 再一方面，本发明提供上述水稻冷诱导表达启动子在培育转基因植物中的应用。 所述应用包括将本发明提供的上述水稻冷诱导表达启动子连接于载体的待表达的基因序 列上游（例如，将所述启动子序列插入目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所述重 组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0028] 并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如 水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0029] 本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No: 1中相同）：
[0030] A GGGCTTCTTTA TGA CA TGGTAGATGGTTATTGACGTGTACGTCTATATATGAACG CCCCTCATATTTGTATCCCCAGCTGTGAGAGATCAGCGTCGAGAGGGTTCTCGTGGTCCATAGTGGCGGAAGAGAAG AGAAGGGAGCCGATGAGCTCAAGCTCACCAAGCATGTGCGAGAAGGAGGCGGCGGCGGTGGCGGTGGGCAGCTAGA GTGGATGAGGCCGCAGCCTACAGCAGCGGAGGAGGAGAGGACGGAGGTGATGGAGAAGATGCGCCCAAAATTTTAA GGTGTGCTTAGTTCCACGATAAAATTGGAAGTTTGACTAATATTGAAAGTTTGAAGAAAAAAGTTGGAAGTTTATGT GTGTAGGAAAGTTTTGATGTGATGGAAAAGTTGGAAGTTTGAATAAAAAGTTGGGAACTAAATAAGGGCTTAGTCT ATAAATTTCAAAAGTTGAAAGGTTGGGCTGATTTTTTTTTTTTTTTATGTTTTGAGGTTAAGAGAAATGATTGAGT TGGACTATGAAAGATCCCATGGCCTATGGCCCATTACCACCCTTTCAAGCTCAACAAGTTCGAGATGGCCCAACTT GTTGCAGCCGATCGAGCCTATCCTACCCTAGCTAAGCATGACTCGAAATGAACAAGACGTGCCAGCAGGAGTCATG CTGCCTTGTGTAGGAAGCACCCGAGCCGCTGAACAATCAACTGGAGTATTGAAATTTGAAAGGTGCTCTCGTGGAA TATTTGCACAGCTGGTGGACGTGCGAGGACTAGGAGACCTCGAATCGGGCTACGGAAAATCCCAAAACGCTAGCGA CGTCAACGTGTGCTTTTCTTGGCTTCCAAGCAGGTCTGCCTCCTGCCTTCCTGCCTCCTATGGTGTCCACCAGTTC TCTCCTGGTCAAAGTATGTAAAGTTTAACTGGGCGTTCGGCTTGACTAGAAAGGGATAGATTATTAATGAATAATT AATTAATTATTAACTATTTTCAATTTTAAAAATAGATTCCTTTTTATTTTTTAAAACCTTCTATATATAAAGTTTT TTTAAAAGAAATATATACTTTTAACAATTTAAGAAGTGTGCTCACGAAAACGATAAAGTTGCTCAGTCAAAATGTG GAATCAAATCCAGCTAGGTGAAGGCCTTGCCATTTGCAAATTGCAGTGGCACATTCATGAGGGTGTGTCGCTAAGG TGACAGTGACCTGAAGAATTCCTAGTTCTAGATGTATTGATCTGCTCTACCGTAAAGGATACTCCAGGTTTATATT ACTCTCTCTATTTCAAAATATAAG