一种具有侧根特异性表达特性的dna片段的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及能够在水 稻转基因调控体系中特异性的驱动目标基因的表达的一段DNA片段。
【背景技术】
[0002] 启动子是参与特定基因转录及其调控的DNA序列。它决定了一个基因是否表达、 何时表达以及何处表达。按作用方式和功能，启动子可分成组成型启动子、特异型启动子和 诱导型启动子三类。在植物基因工程中，人们利用具有不同表达调控水平的启动子来启动 目标基因的表达。例如来源于玉米的Ubiqutin和水稻的Actin启动子，能够调控目的基因 在根、叶中强烈表达，是植物转基因中被广泛使用的启动子。虽然组成型启动子能驱动目标 基因在植物中非特异性地高效表达，但往往造成植株大量积累异源蛋白，打破原有代谢平 衡，过分消耗植株能量，因而得不到所预期的表型。因此，选择一些能在组织、器官以及发育 各阶段特异的启动子，使目标基因只在特定组织或特定时期表达，对于基因功能研究、作物 性状改良有重要的意义。
[0003] 作为植物的地下部，根直接与土壤接触，从土壤中吸取水分和养分、运输物质和储 存营养等，是植物极其重要的生理器官，因此研究根特异性启动子具有实在的应用价值。如 利用根特异性启动子可以改善植物根的生长，提高植物的抗旱盐能力，增加根的分泌物，对 土壤污染进行生物修复等。同时利用根特异性启动子研究植物根的发育、根系的形态建成 和根构型的重建并进行作物的遗传改良培育高产稳产的作物新品种具有重要的意义。
[0004] 目前使用中的根特异性启动子并不多。在植物内源的根特异性启动子开发应用之 前，使用的农杆菌Ri质粒中的一个根特异的基序rolD(Elmayan T，Tepfer M. Evaluation in tobacco of the organ specificity and strength of the rolD promoter doman A of the 35S promoter and the35S promoter. Transgenic Res，1995, 4:388-396)。最近几 年人们也找到一些根特异性启动子，如利用拟南芥的黑芥子酶（myrosinase)PYKlO启动子 调控CKX3基因，使该基因在根中表达，促进根的加快生长，提高了作物抗旱和吸收矿物质 白勺會泛力（Werner T, Nehnevajova E, Kollmer I, Novak 0, Strnad M, Kramer U, Schmulling T.Root-specific feduction of cytokinin causes enhanced root growth, drought tolerance, and leaf mineral enrichment in Arabidopsis and tobacco. Plant Cell. 2010, 22(12) :3905-3920);用根特异性引物Rcc3驱动OsNACIO,发现特异性表达 该基因后，也使根变大，并能在干旱胁迫下增加植物产量（Jin Seo Jeong，Youn Shic Kim, Kwang Hun Baek, Harin Jung, Sun-Hwa Ha, Yang Do Choi,Minkyun Kim,Christophe Reuzeau, and Ju-kon Kim. Root-Specific Expression of OsNACIO Improves Drought Tolerance and Grain Yield in Rice under Field Drought Conditions. Plant Physiol. 2010153:185-197)。
[0005] 综上所述，在植物中，合理使用根特异性启动子能明显改善植物性状，但应用于水 稻等禾谷类作物基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源根特异性启动子依然较少， 因此，发展更多的水稻等禾谷类作物的根特异性启动子对基础研究和生产应用都具有重要 的意义。
【发明内容】
[0006] 因此，针对上述问题，本发明针对水稻根中相关基因的表达，获得一个DNA片段， 其具有根表达特异性，可以用于驱动在根中特异性表达的一些功能基因或结构基因。
[0007] 本发明的还获得了获得含有上述DNA片段的表达盒和重组载体，并且本发明还利 用该DNA片段获得了相应的转基因植物。其中，本文中所涉及的"植物"是指单子叶植物， 例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0008] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种DNA片段，所述DNA片段包含：
[0009] 1)序列表中SEQ ID N0 :1所不的DNA序列；或者
[0010] 2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或 者
[0011] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有启动子功能的DNA 分子。
[0012] 2)和3)中的序列与SEQ ID No: 1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基 因在植物中表达，其中，
[0013] SEQ ID N0 :1中所示序列为：
[0014]
[0015]
[0016]
[0017] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头的序列"atttcccttg tcactcctct gg"共计22bp为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾的 序列"aacgaggac ggcaaggaca aga"共计22bp为获得启动子过程中使用的反向引物的留存 序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补）；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本 晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列， 也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本 发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
[0018] 优选地，本发明所述DNA序列为SEQIDNo:1所示的序列。
[0019] 优选地，序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列用作水稻根特异表达启动子。
[0020] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列可以提取自水稻属植物，优选为日本晴水 稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)，本文中称为P0sRo4或启动子P0sRo4。具体而言，本 申请的发明人发现日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始 位点在内的1593bp的DNA序列，具有驱动目标基因在水稻根中特异性表达的功能，并且分 离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。
[0021] 另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻根特异性强表达启动子的表达盒。
[0022] 另一方面，本发明还提供一组用于扩增所述DNA片段的全长或其任意片段的引物 对，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段： AITTCCCTTGTCACTCCTCTGG ;所述第二引物的 DNA 序列包含片段：AACGAGGACGGCAAGGACAAGA。
[0023] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体为在植物表达载 体PCAMBIA1391的多克隆位点插入所述DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中， 所述水稻根特异表达启动子P0sR 〇4连接于载体中待表达的基因序列的上游；优选的，所述 待表达的基因为对水稻根有改善功能的基因。通过本发明的启动子驱动基因在根中特异性 表达，从而达到改良作物性状的作用。
[0024] 再一方面，本发明提供上述水稻根特异性强表达启动子在培育转基因植物中的应 用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻根特异性强表达启动子连接于载体的待表达的 基因序列上游（例如，将所述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载体，将 所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0025] 另一方面，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，其特征在于，所述方法包括： 利用PCR扩增方法对日本晴水稻DNA中权利要求1所述的DNA片段进行扩增；
[0026] 利用T4连接酶将扩增获得的DNA序列与含有目的基因的预定载体相连接，获得相 应重组载体；
[0027] 利用冻融法将所获得的重组载体转入根癌农杆菌；
[0028] 采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法利用所述根癌农杆菌将权利要求1所述的 DNA片段以及目的基因转入水稻细胞；
[0029] 利用所述水稻细胞培养转基因水稻。
[0030] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)P0sRo4基因上游包括转录起始位点在内的1593bp的DNA序列，并将其命名 为启动子P〇sRo4。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应 的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆 菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus组织 化学染色检测发现，转基因植株仅在根部位有Gus表达，从而证明该1593bp的序列具有驱 动基因在根部位特异性表达的活性。
[0031] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水 稻的根部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，改良水稻的特性。
[0032] 技术效果
[0033] 本发明所克隆的水稻启动子P0sR〇4能够调控基因在水稻根中特异性集中表达， 在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，从而培育出理想 的转基因植物品种。
【附图说明】
[0034] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：