[0035] 图1为将P0sRo4启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A 为PCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-P0sRo4示意图，其中示出了利用P0sRo4 启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0036] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0037] 图3为在7天幼苗中通过⑶S组织化学染色检测启动子的表达特征（标尺=5_)。 ⑶S在叶、茎（鞘）组织中没有表达，在主根中也没有表达，仅在侧根，特别是侧根伸长部分 有明显表达，这表明P0sR 〇4启动子在侧根中特异表达。
【具体实施方式】
[0038] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0039] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0040] 含有酶切位点的P0sRo4启动子的获得
[0041] 步骤1、引物的设计
[0042] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因组 序列，依据水稻P0sR〇4基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点， 设计引物的酶切位点。
[0043] 本实验例中以水稻双元表达载体PCAMBIA1391 (来自于CAMBIA，公开使用载体， 安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶 标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID N〇:2)5'端带BamHI，酶切位点 (GGATCC)，反向引物（SEQ ID No:3)5'端带Smal，酶切位点（CCCGGG)，引物序列如下：
[0044]正向引物：GGATCCATTTCCCTTGTCACTCCTCTGG BamHI
[0045]反向引物：GGATCCATTTCCCTTGTCACTCCTCTGG Smal
[0046] 由深圳华大基因公司合成。
[0047] 步骤2、启动子P0sRo4的获得
[0048] 以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子P0sRo4,按常 规PCR体系，采用如下扩增程序：
[0049] 95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，循环 35 次；最 后 72°C延伸 lOmin。
[0050] 回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1593bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体 (购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue 感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌 落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用BamHI和Smal进行双酶切验证，如图 2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得 的启动子P〇sRo4,其核酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0051]棺物表汰载体的构律和农杆菌的转化
[0052] 从上面"启动子P0sR〇4的获得"过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用BamHI和 Smal酶切，回收启动子P0sRo4片段。同时利用BamHI和Smal对pCAMBIA1391进行线性化 处理、回收PCAMBIA1391，将上述的P0sRo4片段和pCAMBIA1391片段（pCAMBIA1391中含 有Gus基因）用T4连接酶（购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子P0sRo4与Gus基 因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-P0sR 〇4,利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监 督检验测试中心水稻组保存）。
[0053]利用启动子P0sRo4驱动Gus报告基_在水稻中表汰
[0054] 步骤1:农杆菌介导的水稻遗传转化
[0055] 将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有1滴 Tween20的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4% )溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒 掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀 沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤与 胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于 农杆菌的转化。
[0056] 采用上述"植物表达载体的构建和农杆菌的转化"过程中转入了重组表达载体 的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得P0sR 〇4: :GUS转基因水稻植株，该遗传转 化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(0ryza sativa L.)[J]. Plant Cell Report, 2012. D0I10. 1007/s00299-01201275-3.) 等提出的方法。
[0057] 步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色
[0058] 将7天转基因水稻植株的组织器官，即根、茎（鞘）和叶分别进行⑶S染色：将各 组织分别浸于⑶S染色液中，37°C，过夜24小时，75 %乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然 后在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。结果如图3所示，启动子驱动的GUS在叶、 茎（鞘）组织中没有表达，在主根中也没有表达，仅在侧根，特别是侧根伸长部分有明显表 达，这表明P0sR 〇4启动子在侧根中特异表达。
[0059] 以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
【主权项】
1. 一种具有侧根特异性表达特性的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包含： 1) 序列表中SEQ ID NO :1所不的DNA序列；或者 2) 在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者 3) 与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有启动子功能的DNA分子， 其中： SEQ ID NO :1中所示序列为：2. 根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段提取自水稻属植物，优 选为日本晴水稻。3. 根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段用作根特异启动子，尤 其是侧根特异表达启动子。4. 一组用于扩增权利要求1所述的DNA片段的全长或其任意片段的引物对，其 特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段： AITTCCCTTGTCACTCCTCTGG ;所述第二引物的 DNA 序列包含片段：AACGAGGACGGCAAGGACAAGA。5. -种含有权利要求1所述的DNA片段的重组载体，其特征在于，所述重组表达载体为 在植物表达载体的多克隆位点插入权利要求1所述的DNA片段得到的重组质粒，在所述重 组表达载体中，所述DNA片段连接于载体中待表达的基因序列的上游。6. 根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述待表达基因为对根部位的性状 具有改善功能的基因。7. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中所述的DNA片段。8. -种根据权利要求1中任意一项所述的DNA片段在培育转基因植物中的应用，其特 征在于，所述应用包括：将根据权利要求1中所述的DNA片段连接于载体中待表达的基因序 列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行 培育。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植 物为单子叶植物：水稻、玉米、小麦、大麦、高梁或燕麦，所述待表达基因为对根部位有特定 功能的基因。10. -种制备转基因水稻的方法，其特征在于，所述方法包括：利用PCR扩增方法对日 本晴水稻DNA中权利要求1所述的DNA片段进行扩增； 利用T4连接酶将扩增获得的DNA序列与含有目的基因的预定载体相连接，获得相应重 组载体； 利用冻融法将所获得的重组载体转入根癌农杆菌； 采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法利用所述根癌农杆菌将权利要求1所述的DNA片 段以及目的基因转入水稻细胞； 利用所述水稻细胞培养转基因水稻。
【专利摘要】本发明公开一种具有侧根特异性表达特性的DNA片段，所述DNA片段包含：1)、序列表中SEQ？ID？NO：1所示的DNA序列；或者2)在严格条件下与1)、中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者3)、与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA片段。该DNA片段可以用作根特异表达启动子。本发明还提供了含有该DNA片段的表达盒、植物表达载体并将其应用于植物基因工程中。本发明还提供了一种利用该DNA片段获得转基因水稻的方法，采用本发明的启动子构筑转基因水稻可以针对性地改善水稻根部的性状。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/113
【公开号】CN105063054
【申请号】CN201510611865
【发明人】杨亚春, 杨剑波, 魏鹏程, 李莉, 秦瑞英, 李 浩, 马卉, 李娟 , 许蓉芳
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月23日