一种人松弛素h2前体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种人松弛素H2前体及其制备方法和应用，本发明提供了一种人工C肽序列，该序列具有SeqIDNo1-4所示的任一序列。该人工C肽序列可将天然或功能突变的人松弛素H2的B链和A链按B-C-A顺序连接，获得重组的人松弛素H2前体结构。本发明还提供了重组人松弛素H2蛋白的制备方法，通过上述C肽将人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，在宿主细胞表达后通过收集包涵体，并对包涵体变性复性等步骤获得人松弛素H2前体。前体通过蛋白酶消化并经层析等步骤获得纯化的成熟体人松弛素H2。
【专利说明】-种人松弛轰H2前体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，尤其涉及一种人松弛素H2前体及其制备方法和 应用。本发明还涉及经由人松弛素H2前体获得的成熟的人松弛素及其应用。
【背景技术】
[0002] 松弛素（Relaxin)做为一种肤类激素，由化ederick Hisaw在研究妊娠期间骨盆 带变化时首次发现。松弛素最初被认为是一种妊娠相关激素，在孕妇妊娠期前H月，体循环 中的松弛素水平明显上升，同时伴随血流动力学和肾血流改变；同时还具有松弛骨盆初带， 扩张子宫颈，抑制子宫平滑肌自发收缩，参与妊娠期结缔组织的重建等作用。后来研究发 现，在非妊娠期的妇女及男性体内多种组织都有松弛素的表达，并且具有广泛的生物学作 用，包括血管扩张，有抗炎、细胞外基质重塑、血管生成和抗缺血等作用。目前普遍认为松弛 素是一种肤类激素，此类肤家族由7种基因编码，包括松弛素基因RLNURLN2和RLN3,及膜 岛素样肤基因IN化3、IN化4、IN化5、IN化6。人类RLN2编码的松弛素肥是其功能产物，有较 强全身和肾脏扩张血管、增加也输出量，减少体循环阻力、肺毛细血管模压W及NT-proBNP， 改善肾功能来调节也血管反应，对抗对也脏粟血功能有害的机体反应等。人体中松弛素H2 是W松弛素H2原的状态表达，松弛素原蛋白一级结构按B-C-A的顺序排列（见图1)，其中C 链由108个氨基酸残基组成，松弛素原产生后由组织中的转化酶将C链切除后，形成成熟的 松弛素肥。松弛素肥由53个氨基酸组成，其结构特征是有两个独立的多肤链（A链和B 链），其中A链由24个氨基酸残基构成，B链29个氨基酸残基组成；A、B链之间有两对链 间二硫键相连，A链内有一对链内二硫键。临床证据显示，松弛素有舒张血管增加血管顺应 性和抗缺血作用；在血压正常和增高的急性也衰患者，松弛素可W改善呼吸困难及其他临 床结果，安全性可靠。
[0003] 由于人松弛素有很好的成药性，具有极高的临床应用价值，需求量日益增大，因此 推动了人松弛素H2制备方法的研究。目前最为常见的制备方法主要有W下两种： 1、化学合成法；E. Bullesbach和C. Schw油e在1991年及2005年报道了 RLX的化学 合成方法（J. Biol. Chem. 1991，266, 10754-10761; J. Biol. Chem. 2005, 280, 14586-14590)， 松弛素H2的A链采用Fmoc法合成，B链采用Boc法合成，合成过程需要采用氣化氨处理两 次，并且需要H步进行肤链A和肤链B的组合，H对二硫键采用不同的保护基和不同的脱保 护剂。此制备工艺极其复杂，并且产率仅为1.4%，工艺中要求使用高毒性和危险的氣化氨， 不适合规模化生产。
[0004] 专利US-A-4835251中通过在抑7至12的氧化条件下将还原游离-半脫氨酸形 式的A链和还原游离-半脫氨酸形式的B肤链在水性介质中混合W产生具有生物活性的人 松弛素H2。但由于B肤链的水溶性极差，很难在A肤链和B肤链间形成正确的链间二硫键。
[0005] Barlos 邸等（J P巧t Sci. 2010 Apr; 16 (4) : 200-11)在 2010 年报道了米用 Fmoc 法合成肤链A和肤链B，半脫氨酸的侧链采用同一保护基，二硫键采用随机组合法形成。但 此方法依然无法有效提高松弛素2的产率，产率仅为48%。且肤链B的合成工艺复杂，不利 于工业化生产。
[0006] 专利CN 102180964 A公开了将肤链A和肤链B链接制备松弛素-2固相合成方 法。但因链间二硫键经常错配而造成产率较低，并且需多次纯化，工艺依然较复杂，不利于 工业化生产。
[0007] 2、基因工程法 目前国内外已有利用大肠杆菌及酵母等重组表达人松弛素肥前体的报道。下传天等 对人松弛素原在大肠杆菌中进行了初步表达（中华实验和临床病毒学杂志，1997,11卷第4 期，319-321)，但其并未进行松弛素原的纯化，也未将松弛素原转化为松弛素并进行活性测 定。陈历明等在大肠杆菌中实现了人松弛素原H2的表达，但并未将松弛素原进行蛋白酶切 转化为松弛素肥，蛋白活性未知，并且此方法收率仅为2-3mg/L。专利US005759807A公开了 一种利用大肠杆菌制备重组人松弛素肥的方法，但此方法中由于其采用MKKNIAFLIK(或R) R (或K)，W及C肤链K服PTGYGS服KR，导致K (或R) -B0和K (或R) -A0副产物的产生，导 致膜蛋白酶酶切条件不容易控制和后续纯化的复杂。韩佳灿等（中国生物制品学杂志2012， vol. 25 No. 10) W及专利CN 102603888 A利用酵母表达系统制备人松弛素肥，其肤链C设 计为NGFNG，利用轻胺切除C肤链，但此工艺使得肤链B和A分别残留N和G，对松弛素肥 的生物学活性具有一定程度的影响，如可能因为一级结构上与天然氨基酸序列的差异导致 高级结构的不正确，进而影响到活性；也可能由于与人体天然的氨基酸序列不同，导致在动 物或人体内的药效作用及毒性作用的改变。专利CN 102643825 A公开了一种利用毕赤酵 母制备松弛素野生型和突变体的方法，此方法分别在N端6个组氨酸肤链与B肤链连接处， B肤链与C肤链连接处，和C肤链与A肤链连接处设计了H个凝血酶原蛋白酶切位点，导致 成熟的松弛素B链的氨基端有一个附加的甘氨酸，駿基端将有附加的甘氨酸-精氨酸，在A 链的氨基端将有一个附加的甘氨酸，并且未对松弛素活性进行进一步测定。并且由于酵母 表达系统本身的限制，如生长缓慢，生产周期较长，产量较低，导致生产成本高，产业化效果 并不理想。
【发明内容】
[0008] 本发明包括W下按顺序排列的段落所述的主题： 1. 一种重组人松弛素肥前体，使用人工C肤将人松弛素肥的B链和A链按B-C-A顺 序连接，其特征在于所述的人工C肤具有SEQ ID NO 1-4任一项所示的氨基酸序列。 2. 段落1所述的人松弛素H2前体，其特征在于人松弛素肥的B链和A链为天然序列 或其功能突变序列。 3. 段落1所述的人松弛素肥前体，其特征在于在B链的N段连接前导肤S，前导肤包 含纯化标签蛋白序列。 4. 段落3所述的人松弛素肥前体，其特征在于所述前导肤S的C端还可包含连接链。 5. 段落4所述的人松弛素H2前体，其特征在于所述连接链最后一个氨基酸为精氨酸R 或者赖氨酸K。 6. 段落5所述的人松弛素H2前体，其特征在于所述连接链为SSGR或SSGK序列。 7. 段落6所述的人松弛素肥前体，其特征在于所述前导肤S具有SEQ ID NO 7所示的 氨基酸序列。 8. -种寡聚核酸序列，其编码段落1-7任一项所述的重组人松弛素肥前体。 9. 段落8所述的寡聚核酸序列，其特征在于具有SEQ ID NO 6所示的核酸序列。 10. -种载体，其包含段落8或9所述的寡聚核酸序列。 11. 一种宿主细胞，其包含段落10所述的载体或段落8或9所述的寡聚核酸序列。 12. 段落1-7任一项所述的重组人松弛素肥前体的制备方法，其包括培养段落11所述 的宿主细胞和分离所述蛋白的步骤。 13. 段落1-7任一项所述的人松弛素H2前体的制备方法，其特征在于： 1) 获得重组基因：获得表达人松弛素肥前体的寡聚核酸序列； 2) 获得重组载体：将上一步获得的寡聚核酸序列插入载体质粒，获得含有重组基因的 重组载体； 3) 获得基因工程菌：将上一步获得的重组载体转化宿主细胞获得基因工程菌； 4) 表达外源基因；基因工程菌发酵表达重组人松弛素肥前体蛋白； 5) 收集前体蛋白：裂解菌体，收集重组人松弛素H2前体蛋白； 6) 纯化目的蛋白；通过蛋白酶酶切去除前导肤S、C肤，并经层析纯化步骤获得成熟的 人松弛素肥蛋白。 14. 段落13所述的人松弛素H2前体的制备方法，其特征在于所述寡聚核酸序列具有段 落8或9所示的序列。 15. 段落13或14制得的成熟的人松弛素肥蛋白。 16. -种药物组合物，其包含药物有效量的段落15所述的成熟的人松弛素肥蛋白。 17. 段落15所述的成熟的人松弛素蛋白在制备治疗也血管疾病、肺疾病、纤维化病症 或肾疾病的药物中的应用。 18. 段落17所述的应用，所述也血管疾病包含冠也病，急性冠脉综合症，也衰和也肌梗 塞。 为解决现有制备重组人松弛素肥工艺中由松弛素原酶切得到松弛素肥的过程中蛋白 N端或C端存在残留氨基酸的问题，W及包涵体复性等问题，本发明提供了一种新的人松弛 素肥前体，该前体采用人工C肤将人松弛素肥前体的B链和A链按B-C-A顺序连接，本发 明的人工C肤具有SEQ ID NO 1-4任一项所示的氨基酸序列。本发明中，人松弛素肥的B 链和A链可W为天然序列，也可W为其功能突变序列。功能突变序列是指与天然序列具有 90%及W上同源性且其成熟体对体循环和肾脏血管具有扩张作用的突变体。根据需要，可 在各链段之间设计蛋白酶酶切位点，用于切除多余的序列。蛋白酶可选自膜蛋白酶、凝血 酶、肠激酶和Xa因子等。
[0009] 优选情况下，本发明的人松弛素肥前体在B链的N端连接前导肤S，前导肤包含 纯化标签蛋白序列。所述纯化标签可W为组氨酸标签、谷脫甘肤S转移酶（GST)或FLAG?。 组氨酸标签是常用的纯化标签，可通过媒亲和层析进行纯化。常见的组氨酸标签为6X化S (化S-化g)。为增强亲和层析纯化效果，本发明的使用的组氨酸标签为10X化sWis-化g)。 在更优选的情况下，本发明的前导肤S的C端还可包含连接链，连接链最后一个氨基酸优选 为精氨酸R。在更优选的情况下，连接链为SSGR序列。该一连接链序列柔性较好，能够使组 氨酸标签充分暴露，同时精氨酸R可被膜蛋白酶精确识别并切割，完全切除前导肤S序列。 在最优选的情况下，前导肤S具有SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列。
[0010] No 7 MGHHHHHHHHHHSSGR 本发明还提供了一种寡聚核酸序列，其编码上述任一种情况下所述的重组人松弛素H2 前体。根据不同的表达系统的密码子偏好，可对核酸序列进行优化。优选情况下，寡聚核酸 具有SEQ ID NO 6所示的核酸序列。
[0011] 本发明还提供了一种载体，其包含上述所述的寡聚核酸序列。
[0012] 本发明还提供了一种宿主细胞，其包含上述载体或上述寡聚核酸序列。
[0013] 本发明还提供了一种重组人松弛素肥前体的制备方法，其包括培养上述宿主细 胞和分离所述蛋白的步骤。所述分离蛋白的步骤包括亲和层析、阳离子交换、反相层析等。
[0014] 具体地，人松弛素肥前体的制备方法，包括如下步骤： 1) 获得重组基因：获得表达人松弛素肥前体的寡聚核酸序列； 2) 获得重组载体：将上一步获得的寡聚核酸序列插入载体质粒，获得含有重组基因的 重组载体； 3) 获得基因工程菌：将上一步获得的重组载体转化宿主细胞获得基因工程菌； 4) 表达外源基因；基因工程菌发酵表达重组人松弛素肥前体蛋白； 5) 收集前体蛋白：裂解菌体，收集包涵体并洗涂，包涵体经变性、复性后通过Ni亲和层 析收集人松弛素H2前体蛋白； 6) 纯化目的蛋白；通过蛋白酶酶切去除前导肤S、C肤，并经层析纯化步骤获得成熟的 人松弛素蛋白。
[0015] 优选情况下，层析纯化步骤包括阳离子层析、反相层析和阳离子层析等顺序相接 的步骤。
[0016] 本发明还提供了通过上述制备方法获得的成熟的人松弛素肥蛋白。
[0017] 本发明还提供了一种药物组合物，其包含药物有效量的通过上述方法获得的成熟 的人松弛素蛋白。
[0018] 本发明还提供了上述制备方法获得的成熟的人松弛素蛋白在制备治疗也血管疾 病、肺疾病、纤维化病症或肾疾病的药物中的应用。所述也血管疾病包含冠也病，急性冠脉 综合症，也衰和也肌梗塞。
[0019] 本发明的有益效果；与现有技术相比，本发明中松弛素H2前体融合蛋白及成熟型 松弛素肥蛋白制备工艺简便，产率高。创新的C肤设计W及柔性连接肤链的设计使得目的 蛋白可W获得高效表达，同时包涵体更易于复性；本发明提供的人工C肤，使得松弛素H2 原融合蛋白成熟为松弛素肥蛋白的酶切过程更加高效，避免了 Arg - A0 -松弛素H2副产 物的产生，而且获得的成熟体松弛素H2蛋白具有更好的活性。W上设计使得松弛素H2的 纯化工艺更加简洁高效，产率提高，同时制备成本得到较好的控制。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1人松弛素肥原蛋白一级结构图； 图2人松弛素肥前体融合蛋白表达SDS-PAGE凝胶电泳图； 图3人松弛素H2前体融合蛋白氨基酸序列图； 图4膜蛋白酶单酶切人松弛素H2前体融合蛋白RP-HPLC图谱； 图5松弛素肥蛋白原液纯度RP-HPLC检测图谱； 图6松弛素肥蛋白体外活性Elisa测定。
【具体实施方式】
[0021] 本发明利用基因工程的方法，设计新的人工C肤序列，并通过该C肤将人松弛素肥 前体的B链和A链按照B-C-A的顺序连接，获得重组的人松弛素肥前体蛋白。该蛋白表达 后，通过蛋白酶切除C肤，获得成熟的人松弛素肥。
[0022] 具体的，一种人松弛素肥前体蛋白，从N端至C端由S-B-C-A四段肤链组成，其中 所述S肤链为无或前导肤。C肤链的序列选自SEQ ID NO 1-4的任一条序列，具体序列如 下： No 1 RREAEDLQVGQVELGGGPGAG化QPLALEGSLQSR No 2 RREAEDLQVGQVELGGGPGAG化QPLALEGSLQGR No 3 RREAEDLQVGQVELGGGPGAG化QPLALEGSLQVR No 4 RREAEDLQVGQVELGGGPGAG化QPLALEGSLQAR 为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，前导肤序列常常包括便于分离纯化的标签 蛋白或标签多肤（Tag)。常用的有谷脫甘肤-S-转移酶（glutathione S-transferase, GST)、六聚组氨酸肤（His-Tag)、蛋白质A (protein A)和纤维素结合位点（cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肤与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利 用所述的标签蛋白或标签多肤的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His-Tag与 Ni-化elating Se地arose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肤可W在纯化后用位 点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，W获得目标蛋 白。而为了增强蛋白酶的切割位点识别特异性和更好的暴露纯化标签，前导肤序列也可包 括连接链。在本发明中，连接链的末端氨基酸优选为精氨酸R，连接链序列优选为SSG。B肤 链和A肤链可W为人松弛素H2的天然序列，也可为其功能突变序列。功能突变序列是指与 天然序列具有90%及W上同源性且其成熟体对体循环和肾脏血管具有扩张作用的突变体。 优选情况下，A肤链和B肤链的氨基酸序列如SEQ ID No8和9所示，具体序列如下： No 8 A 链 DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS No 9 B 链 QLYSALANKCCHVGCTKR化 ARFC 在一个具体实施例中，S-B-C-A肤链其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。同时，本领 域人员不难理解，与SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列具有90%或W上同源性且其成熟体 对体循环和肾脏血管具有扩张作用的突变体，也在本发明的保护范围之内。
[0023] No 5 MGHHHHHHHHH服SG畑SWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLAL EG化QSRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC 在蛋白复性过程中，将获得的变性的人松弛素肥前体在抑为8. 5-11且存在低浓度的 变性剂和氧化还原对存在条件下，低温复性。复性时，融合蛋白浓度控制在〇.5-2mg/ml ;复 性温度为4C -15C ;优选的变性剂为尿素，浓度为0. 5-2M。氧化还原对通常为硫醇和氧化 型硫醇二聚体；硫醇可选择具有强还原性的二硫苏糖醇、二硫赤薛糖醇、半脫氨酸、还原型 谷脫甘肤、目琉基己醇；氧化型硫醇二聚体可选氧化型谷脫甘肤、脫氨酸。在本发明中，硫 醇与氧化型硫醇二聚体比例(摩尔比）为1:5-1:10。
[0024] 下面将通过具体实施例来进一步详细说明。然而应当理解，具体实施例仅用于解 释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。本申请中所用到的仪器、设备、试剂、方法等如 未特别指明，均为本领域常用的仪器、设备、试剂及方法。
[00巧]实施例1人松弛素肥前体融合蛋白表达系统构建及表达鉴定 人工合成人松弛素肥前体融合蛋白基因序列RLX肥（Invitrogen合成)，从5'端到 3'端依次包括带有10地is标签蛋白的前导肤基因序列、松弛素肥肤链B基因序列、肤链C 基因序列和肤链A基因序列；其中5'端引入化〇1酶切位点，3'端引入TAATAA强终止子和 化〇1酶切位点；此合成的人松弛素肥前体蛋白基因序列根据大肠杆菌密码子偏爱性进行 优化，优化后的序列（SEQ ID No6)如下：
【权利要求】
1. 一种重组人松弛素 H2前体，使用人工C肽将人松弛素 H2的B链和A链按B-C-A顺 序连接，其特征在于所述的人工C肽具有SEQ ID NO 1-4任一项所示的氨基酸序列。
2. 权利要求1所述的人松弛素 H2前体，其特征在于人松弛素 H2的B链和A链为天然 序列或其功能突变序列。
3. 权利要求1所述的人松弛素 H2前体，其特征在于在B链的N段连接前导肽S，前导 肽包含纯化标签蛋白序列。
4. 权利要求3所述的人松弛素 H2前体，其特征在于所述前导肽S的C端还可包含连接 链。
5. 权利要求4所述的人松弛素 H2前体，其特征在于所述连接链最后一个氨基酸为精氨 酸R或者赖氨酸K。
6. 权利要求5所述的人松弛素 H2前体，其特征在于所述连接链为SSGR或SSGK序列。
7. 权利要求6所述的人松弛素 H2前体，其特征在于所述前导肽S具有SEQ ID NO 7所 示的氨基酸序列。
8. -种寡聚核酸序列，其编码权利要求1-7任一项所述的重组人松弛素 H2前体。
9. 权利要求8所述的寡聚核酸序列，其特征在于具有SEQ ID NO 6所示的核酸序列。
10. -种载体，其包含权利要求8或9所述的寡聚核酸序列。
【文档编号】A61P9/10GK104447982SQ201410511557
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】周晓雷, 张世光, 邹卫 申请人:深圳市辰瑞尔生物科技有限公司