专利名称：糖基化的细胞素的制作方法
技术领域：
本发明涉及用作药物的糖基修饰的细胞素。
依赖目前生物技术的进展，已经分离并纯化了大量的细胞素。同样，有可能对它们进行大量生产，现在预计它们是新药的候选化合物。不过，在实现这种期望之前，有许多问题有待解决，其中的问题之一便是研制理想的细胞素的靶向药物释放系统。严格控制细胞素在体内的行为，被认为是增强其治疗作用，减小其副作用的关键。
例如干扰素，作为一种细胞素，是具有诸如抗病毒活性和细胞生长抑制等多种生物活性的蛋白。由于这种药理作用，干扰素被用于治疗大量疾病，特别是治疗慢性乙型和丙型肝炎以及肾癌。可是，由于干扰素服用后几乎不转运到肝脏以及迅速从体内排出，因此极难在肝脏保持干扰素的有效浓度。由于这一原因，为了有效地治疗肝脏疾患，必须使用大剂量进行长期治疗，同时也就包含了副作用造成的风险。
与干扰素治疗肝炎有关的作用机制，例如干扰素-α治疗慢性丙型肝炎的作用机制，已有报道。人们认为干扰素直接作用于病毒感染的肝细胞，活化肝细胞内2′5′-寡腺苷酸合成酶(2-5AS)并生成2′5′-寡腺苷酸，后者反过来活化核糖核酸酶，以便溶解病毒衍生的RNA，这样抑制蛋白合成以及抑制丙型肝炎病毒的活性〔Barson，S.Tex，Res.Bio.Med.，Vol.35，(1977)〕。
到目前为止，已发现了五种类型的肝炎病毒，即甲型至戊型，包括RNA型的丙型肝炎病毒(HCV)，在输血后非甲、非乙肝炎病人的血清中找到了该病毒的基因，而且没有有效的治疗方法。丙型肝炎的特征是，成年人有一系列急性症状和经常性的慢性症状。虽然这种慢性肝炎进展缓慢，但自愈者极少，许多病人的预后是肝硬变或肝癌。另一方面，不仅大量生产干扰素已成为可能，而且这些蛋白已经显示了体外抗HCV有关的RNA型病素的活性〔Yasuyuki Ninomiya et al.Clinical Peport，19，231(1985)〕以及对大鼠具有抗病毒感染的预防作用〔M.Kramer al.J.Interferon Res.，3，425(198)〕，从而导致预期它们对丙型肝炎的临床治疗作用。实际上，重组的干扰-α和-β对丙型肝炎病人具有优良的治疗作用〔J.H.Hoofnagle，et al.N.Eng.J.Med.，315，1575(1986)〕，从而使得治疗趋向于阴性的慢性肝炎有可能得到阳性的治疗结果;这两种重组的干扰素现已广泛地用于临床〔Masami Yamanaka et al.Journal of the Japanese Society of Internal Medicine，79，1037(1990);Sakashi Shoji et al.Japanese Journal of Gastrenterology，88，706(1991)〕。
不过干扰素对丙型肝炎的治愈率仍不令人满意，最多40%〔S.Kakuma et al.Am.J.Gastroenterol.，85，655(1990);Hepatitis Study Group，K A N TAN SUI/Journal of Liver，Gall-bladder and Pancreas，22，491(1991)〕。特别是在高病毒容量的病例中，例如对HCVⅡ基因型的病人，治愈率不高于20%〔K.Yoshika et al.Hepatology，16，293(1982)〕。所以在这些病例中，增加剂量或延长治疗时间，有可能改进疗效。同样，使用目前的干扰素剂量水平和服药时间，对于向肝硬化恶变的慢性肝炎预期没有疗效。
静脉、肌肉或皮下注射干扰素时，几乎不向靶器官肝脏转运，在血中的半衰期短;需要相当大的剂量才能获得疗效。干扰素的副作用包括开始出现流感样症状，表现为发热、头疼和一般的不适，以及白细胞和血小板减少，中期出现持续低热、失眠和忧郁倾向，后期出现脱发和甲状腺机能减退。由于这种原因，即使是那些为了获得理想的药效而本应在理想的时间内使用足够剂量的干扰素的病人，一旦出现副作用就不得不中断用药或减小剂量。
同时，日本专利未审查公开No.152393/1988中指出含糖链的聚乙二醇衍生物可用于修饰细胞素，而且生成的修饰蛋白在体内可用于增加白细胞的持久性，并改进细胞素向特定细胞或组织释放。在日本专利未审查公开No.211099/1992中还描述了用作向骨髓或脑选择性药物释放载体的糖基化蛋白衍生物。不过，这些专利公报均未报道用于向肝脏选择释放细胞素的糖修饰细胞素。
Qtsubo等报道了一种向肝脏转运的糖修饰蛋白，该蛋白在细胞内溶菌酶中降解〔Drug Delivery System，Vol.6，13-17(1991)〕。不过未报道肝脏定向的糖修饰细胞素。
本发明的目的是提供服用之后能够肯定地把全部剂量的细胞素迅速向肝脏转运，并能有利对用于增强地肝炎的疗效和降低副作用的糖修饰的细胞素。
作为对如何使细胞素向肝脏转运的广泛研究的结果，本发明者们发现用糖或糖链对细胞素进行修饰后，可使之向肝脏迅速转运。
同样，本发明提供了糖修饰的细胞素，包括把修饰基连接到细胞素的至少一个伯氨基上，其中所说的修饰基由通式(Ⅰ)表示
其中R为糖基，X为
其中n为任意的正整数，
-C6H4-NH-CS-，-S-CH2-CO-NH-CH2-CH2-，-O-CH2-CH2-，-CS-NH-C6H3(CH3)-NHCS-，-CO-(CH2)
-CO-
其中l为3至6的整数，-CO-CH(OH)-CH(OH)-CO-，
其中y为
其中y具有与上面所述相同的定义，-CO-NH，or
图1表示大鼠静脉注射3×106单位后，在测定的时间内监测的血清中非修饰或半乳糖修饰的干扰素-2A浓度变化结果。O、□、△和
分别表示未修饰干扰素-αA、实施例16中获得的半乳糖修饰干扰素-αA、实施例3中得到的半乳糖修饰干扰素αA和实施例1中获得的半乳糖修饰干扰素-2A。
图2表示用大鼠肝灌流方法测定的未修饰和半乳糖修饰干扰素-αA向肝脏转运的实验结果。◇如
分别表示未修饰干扰素-2A和实施例1中获得的半乳糖修饰干扰素-αA。
图3表示对初级培养的大鼠肝细胞施用未修饰或半乳糖修饰干扰素-αA后测定的2′，5′-寡腺苷酸合成酶的活性结果。IFN和galIFN分别表示未修饰干扰素-αA和实施例1中获得的半乳糖修饰的干扰素-αA。
图4表示实验实施例4中描述的干扰素-αA体外抗病毒活性的标准曲线。
图5表示小鼠腹膜内贯序两天注射未修饰干扰素-β(IFNB)或半乳糖修饰干扰素β，以未修饰干扰素-β计剂量为0.2μg/天/小鼠，测得的肝内2′，5′-寡腺苷酸合成酶(2-5A)活性的结果。mIFN和Gal-mIFN分别表示未修饰小鼠干扰素β和实施例28中获得的半乳糖修饰的小鼠干扰素β。
图6表示小鼠腹膜内序贯两天注射未修饰干扰素β(IFNB)或半乳糖修饰干扰素β，以未修饰干扰素-β计，剂量为1.0μg/天/小鼠，测得的肝内2′，5′-寡腺苷酸合成酶(2-5A)活性的结果。mIFN和Gal-mIFN分别表示未修饰小鼠干扰素β和实施例28中获得的半乳糖修饰的小鼠干扰素β。
本发明的细胞素的实例包括白细胞介素-1(同抗原活化巨细胞获得)、白细胞介素-2(同抗原活化T细胞获得)、白细胞介素-3(由T细胞的特殊克隆生成)、白细胞介素-4、T细胞取代因子(TRF)或B细胞分化因子(BCDF)、挤原专属抑制因子(TsF)、可溶性免疫应答抑制因子(SIRF)、抑制诱导因子(SIF)和干扰素-γ(IFN-γ，由T细胞生成)、B细胞生长因子(BCGF)、B细胞分化生长因子(BCDF)和B细胞长生抑制因子(SBF，由B细胞生成)、巨噬细胞活化因子(MAF)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白细胞迁移抑制因子(LIF，报道是由B细胞或T细胞产生)、干扰素-α(IFN-α)、粒细胞克隆兴奋因子(G-CSF)，巨噬细胞克隆兴奋因子(GM-CSF)、单核细胞克隆兴奋因子(M-CSF)，由巨噬细胞产生)、以及干扰素-β(IFN-β，由成纤细胞产生)等等。实例还包括其它由细胞介素，例如白细胞介素-5、和白细胞介素-6、趋化性因子，例如巨噬细胞趋化因子(MCF)和淋巴细胞趋化因子(LCF)，炎性淋巴因子，例如血管渗透因子(VPE)、perforin(由细胞毒素T细胞产生)，以及杀癌细胞的因子，例如淋巴细胞衍化的淋巴细胞毒素(LT)。细胞素也可以是细胞生长因子，例如血小板衍化细胞生长因子(PDGF，它的主要靶点位于成纤细胞和平滑肌细胞)、表皮生长因子(ECF，它的主要靶点在成纤细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、表皮细胞和软骨细胞)、成纤细胞生长因子(FGF，它的主要靶点在成纤细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞和表皮细胞)、神经生长因子(NGF，它的主要靶点在神经细胞)、神经生长因子(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)，它们的主要靶点是软骨细胞，红细胞生成素元使红细胞增生，hepatotropin(HTP)和肝细胞生长因子(hHGF，促进肝细胞生长)。
在上面提到的细胞素中，干扰素(亦称IFN)或由细胞介素-2(亦称IL-2)为本发明优选。干扰素可以是α型，β型成γ型，其中α型优选。只要干扰素-α是具有干扰素-α活性或抗病毒活性的多肽化合物，那么干扰素-α就不应受到限制。例如，干扰素-α可以是天然存在的干扰素-α，也可以是因基因工程技术制得的干扰素-α，后者优先。用基因工程技术制得的干扰素-α的例子有重组干扰素-αA、B、C、D、E、F、G、H、I和J(日本专利未审查公开，No.79897/1982和European patent publication No.43980)。只要本质的活性得到保留，干扰素-α可以是衍生物。这类衍生物包括干扰素-αA的衍生物，其中N端氨基用-COCH3或-COCH2OH酰化(日本专利未审查公开No.41500/1988)。
只要干扰素-γ是具有干扰素-γ抗病毒活性的多肽化合物，那么干扰素-γ不应受限制。例如干扰素-γ可以是天然存在的干扰素-γ或用基因工程技术制得的干扰素-γ，后者优先。用基因工程技术制得的干扰素-γ的例子，包括日本专利未审查公开No.90514/1983和No.186995/1984中描述的方法制得的干扰素-γ。只要本质的活性得到保留，干扰素-γ还应包括它们的衍生物。
另外，干扰素可以是在它的部分氨基酸组分被删除或因其它氨基酸置换而生成的突变蛋白。对于干扰素-γ，这类突变蛋白包括从氨端和/或羧端缺乏1至数个氨基酸的片段。这类片段包括删除干扰素-γ氨端的Cys1-Tyr2-Cys3和从干扰素-γ羧端的Gly130-Gln146肽链的羧端删除1至17个氨基酸所得的片段(日本专利未审查公开No，2020899/1985)，包括干扰素-γ的部分序列5-127、1-127或5-146(日本专利未审查公开No.233100/1985)，包括从干扰素-γ的氨端删除Cys-Yyr、Cys-Tyr-Cys或Cys-Cyr-Gln和从干扰素-γ羧端的Lys131-Gln146肽链的羧端删除1至16个氮基酸或肽所得到的片段(日本专利未审查公开No.5096/1986)，包括干扰素-γ的部分序列1-131(日本专利未审查公开No.62395/1966)，包括干扰素-γ的部分序列1-132或1-133〔Arakawa et al.J.Biol.Chem.，261，8534(1986)〕，包括干扰素-γ的部分序列1-135(干扰素研究的第三届(国际会议)，包括删除干扰素-γ的氨端Cys1-Tyr2-Gln4-Asp5以及从干扰素-γ的羧端的肽链Lus128-Gln126的羧端删除0至19个氨基酸或肽所得的片段(日本专利未审查公开No.99399/1987)，如那些通过从干扰素-γ的氨端删除Cys-Yyr、Cys-Tyr-Cys或Cys-Cyr-Gln以及从干扰素-γ的羧端的肽链Gln122-Gl146的羧端删除18至25肽所生成的片段(日本专利未审查公开No.264500/1988)。
只要具有白细胞介素-2的类似活性，白细胞介素-2就可以是多肽化合物，例如允许T细胞过代培养同时又保留它们的功能的化合物。具体讲，可以是具有日本专利未审查公开No.78799/1986(同样是European Patent Publication No.1761299)的图1中给出的氨基酸序列的多肽(Ⅰ，人白细胞介素-2)，或对于它们的生物活性和免疫活性来说是必须的它们的部分序列组成的片段。这类片段包括从多肽(Ⅰ)的氨端删除1个氨基酸(EPC Publication No915339)或4个氨基酸(日本专利未审查公开No.126088/1985)以及从羧端删除数个氨基酸所得的片段。片段亦可以是多肽(Ⅰ)的一个或多个组成氨基酸被删除或被其它氨基酸取代的片段，例如其中125位的半氨酸残基被丝氨酸残基取代的片段(日本专利未审查公开No.93093/1984，同样见于US Patent No.4，518，584)。
在本发明中，特别优先使用具有日本专利未审查公开No.78799/1986(同样见于EPC Publication No.176，299)的图1给出的氨基酸序列的人白细胞介素-2。在这种情况下，人白细胞介素-2可以是一种在氨端多一个蛋氨酸残基的人白细胞介素-2和另外一种缺乏蛋氨酸残基的人白细胞介素-2的混合物(日本专利未审查公开No.115528/1985and78799/1986)，或在氨端无蛋氨酸而以丙氨酸起始的人白细胞介素-2的混合物日本专利未审查公开No.78799/1986)。
细胞素的伯氨基包括氨端氨基酸的α氨基酸的α-氨基或赖氨酸的ε-氨基。
对于上面的通式(Ⅰ)，x较好为
上面通式(Ⅰ)中的任意正整数以n不大为10为好，最好是1-3。
本发明的通式(Ⅰ)中的糖基可以是糖或多糖。这类糖基包括呋喃糖基、吡喃糖基和七环糖基，其中吡喃糖基优先。
单糖的例子包括己醛糖，例如吡喃半乳糖基、吡喃甘露糖基、吡喃葡萄糖基和吡喃果糖基，包括氨基己糖，例如2-氨基-2-去氧吡喃半乳糖基、2-氨基-2-去氧吡喃甘露糖基、2-氨基-2-去氧吡喃葡萄糖基和2-氨基-2-去氧吡喃果糖基，以及包括氨基己糖的衍生物，例如2-乙酰胺基-2-去氧吡喃半乳糖基、2-乙酰胺基-2-去氧吡喃甘露糖基、2-乙酰胺基-2-去氧吡喃葡萄糖基和2-乙酰酸基-2-去氧吡喃果糖基。优先的单糖是吡喃半乳糖基、吡喃甘露糖基、2-乙酰胺基-2-去氧吡喃半乳糖基和2-乙酰胺基-2-去氧吡喃甘露糖基，而吡喃半乳糖基和2-乙酰胺基-2-去氧吡喃半乳糖基更优先。
作为多糖来说，可以是其末端组份单元的单糖(非还原物)是上面描述的单糖的任何一种多糖，以及除末端单糖外，多糖的组份单糖可以是任意单糖只要它们能连接多糖。另外，单糖之间的苷键可以是α和β。本文中，糖基的组成多糖的末端组份单元单糖为苷键相反一面的组分单元单糖。例如，在吡喃半乳糖为末端平稳的多糖中，多糖是吡喃半乳糖基-糖基。在2-乙酰胺基-2-去氧吡喃半乳糖基为末端单糖的多糖中，多糖是(2-乙酰胺基-2-去氧吡喃半乳糖基-糖基。
在本发明的糖修饰细胞素中，含糖键的修饰基连接到细胞素的伯氨基上。伯氨基的例子有氨端氨基酸的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。
在本发明的糖修饰的细胞素中，糖链和细胞素可以通过已知的修饰方法化学键合。本发明的制备糖修饰细胞素的方法如下(a)通式
表示的化合物与细胞素反应，其中R和n的定义同前，Z为低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)，
(b)通式
代表的化合物与细胞素反应，其中R的定义同前，(c)通式R-C6H4-N＝C＝S代表的化合物与细胞素反应，其中R的定义同前，(d)通式R-S-CH2-CO-NHCH2-CHO表示的化合物与细胞素反应，其中R的定义同前，(e)通式R-O-CH2-CHO代表的化合物与细胞素反应，其中R的定义同前，(f)通式
代表的化合物与细胞素反应，其中R的定义同前，(g)通式代表的化合物与细胞素反应，其中R和l的定义同前，(h)通式
代表的化合物与细胞素反应，其中R的定义同前，(i)通式其中R的定义同前，代表的化合物与顺丁烯亚胺化的细胞素(细胞素
其中y为-(CH2)3、
)，反应，(j)通式
其中R的定义同前，代表的化合物与顺丁烯亚胺化的细胞素(细胞素
，其中y为-(CH2)3-、
)反应，(k)通式RCOOH代表的化合物与细胞素反应，其中R的定义同前，(l)通式
代表的化合物与细胞素反应，其中R的定义同前。
例如按照Lee等的方法，上面提到的单糖的氰甲基-1-硫糖苷在甲醇中在甲氧基钠存在下反应，生成2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫糖苷，这是活泼中间体。该活泼中间体然后与细胞素反应，通过亚氨链连接到细胞素的主要氨基功能基氨基酸残基上，生成期望的糖修饰的细胞素〔Biochemistry，vol.15，3956-3963(1976)〕。另外，用氰烷基-1-硫糖苷，例如氰乙基-1-硫糖苷或氰丙基-1-硫糖苷，以及上面提到的氰甲基-1-硫糖苷，可以制得期望的糖修饰的细胞素。使用上面提到的Lee等的方法，甚至当糖为多糖时，也可以制得期望的糖修饰细胞素。
若x为
时，糖链和细胞素可以通过化学方法键连，以便修饰细胞素，例如在该方法中由半乳糖和葡萄糖组成的二糖，即乳糖，用氰硼氢还原性地氨基化，以便细胞素分子中的伯级氨基与它键合〔B.A.Schwartz et al.Arch.Biochem.Biophys.，181，542(1977);L.Fiume et al，FEBS Lett.，146，42(1982)〕。同样，甚至当R不是半乳糖时，也可以按照该方法制备本发明的糖修饰的细胞素。
当x为-C6H4-NH-CS-时，糖链和细胞素能够化学键连以便修饰细胞素，例如在使用的方法中异氰酸根合苯基β-吡喃半乳糖苷与细胞素中的伯氨基偶联〔M.Monsigny et al.Biol，Cell，51，187(1984)〕。使用该方法，甚至当R不是半乳糖时，也可以制得糖修饰的细胞素。
当x为-S-CH2-NH-CH2-CH2-时，使用R.T.Lee and Y.C.LeeBiochem.，19，156(1980)中描述的方法，可以使糖链与细胞素化学键合，生成修饰的细胞素。
为x为-O-CH2-CH2-时，按照J.Bogwald et al.Carbohydr.Res.，148，1010(1986)中描述的方法，糖链和细胞素可以化学键合，生成修饰的细胞素。
当x为-CS-NH-C6H3(CH3)-NHCS-时，按照J.C.Rogers omd S.KanfeldBiochem，Biophys.Res.Commun.，45622(1971)中描述的方法，糖链可以与细胞素化学键合，生成修饰的细胞素。
当x为-CO-(CH2)n-CO-时，按照S.Avrameas et al，Immunochem.，6，43(1969)或M.Tieneyer et al，;Biol.Chem.，264，1671(1984)中描述的方法，糖链与细胞素可以化学键合，生成修饰的细胞素。
当x为-COCH(OH)-CH(OH)-CO-时，按照J.Biol.Chem.261205(1986)中描述的方法，糖链与细胞素可以化学键合，生成修饰的素。
当X为
时，按照E.Ishikawa et al，;J.Immunoassay，4，209(1983)中描述的方法，糖链与细胞素可以化学键连生成修饰的细胞素。
当x为
SEQ ID NO∶1序列长度63序列类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽
SEQ ID NO∶2序列长度87序列类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽
只要溶剂不干扰反应，那么细胞素和具有糖或糖链的修饰基之间的反应使用的溶剂就不应受到限制。这类溶剂包括缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液、三羧甲基氨基甲酸缓冲液和乙酸盐缓冲液。另外，只要有机溶剂不使细胞素失活或不干扰反应，那么亦可加入低级烷醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇)、乙氰、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺一类的有机溶剂。虽然反应的pH可以在3至14的宽范围内选择，但pH大约7和9之间的弱碱性理想。糖修饰细胞素的修饰程度也可以通过改变反应的pH加以调节。虽然只要不使用细胞素变性反应温度就可以是任意温度，但取大约0℃至40℃之间的温度最好。反应时间大约3至72小时，反应时间使用大约24至30小时可以得特别满意结果。采用诸如渗析，盐析，超声过滤、离子交换色谱、凝胶过滤、高效液相色谱和电泳的常规蛋白质纯化方法，反应液可以纯化为期望的糖修饰细胞素。
由于细胞素的较高级结构对于表达它的生物活性是重要的，所以本发明的糖修饰细胞素具有对应的未修饰细胞素的有用的生物活性，并进行修饰，以便保留60%以上的生物活性，最好保留80%以上的生物活性。
用糖链修饰的细胞素的生物活性可以用各种方法确定。例如，当细胞素是一种干扰素时，它的抗病毒活性可以在体外通过其中MBDK(Madin和Darby牛肾)细胞用VSV(囊状口尖病毒)感染，并在有干扰素或无干扰素存在下孵育，之后通过中性的方法〔M，Rubinstein et al.Proc.NatlAcak.Sci，USA，76，640(1979);P.R.Maheshwari and R.M.FriedmanVirol.，101，399(1980)〕测定细胞致病效应(CPE)。2′，5′-寡腺苷酸合成酶活性亦可使用商业上可以买到的2′，5′-寡腺苷酸合成酶试剂盒(Eiken Chemical Co.Ltd.)按常规方法测定。另外，在体内的肝靶向实验中，可以通过已知的免疫检测方法(WO82/01773)或上面描述的抗病毒活性试验或2′，5′-寡腺苷酸合成酶活性试验测定目标动物的血和组织中的干扰素浓度来测定。
与对应的已知的未修饰细胞素相比，本发明的糖修饰细胞素的特点是迅速从血清中消除，并迅速向肝脏转运。
本发明的糖修饰细胞素可以口服或非口服途径施用于动物(例如，、狗、猪、兔、小鼠、大鼠、人)，用药时采用合适的剂型(例如，胶囊和注射溶液)，与已知载体、稀释剂以及其它添加剂一道服用。
本发明的糖修饰的细胞素由于能充分转运到靶器官，所以低剂量下即可提供很好的疗效。由于这一特点，本发明的糖修饰细胞素几乎没有诸如发热、发冷一类的副作用，且毒性小，并可以通过类似于已知未修饰细胞素的方法，更安全地用于相同的治疗目标。
例如本发明的糖修饰重组干扰素-γ(γIFN-γ)被用作抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞生长和免疫增强的治疗药。在这种情况下，它静脉或肌肉注射的成人日剂量是100，000至100，000，000单位。
本发明的糖修饰重组干扰素-αA(γIFN-αA)用作抗肿瘤或抗病毒治疗。在这种情况下，注射的糖修饰重组干扰素-αA剂量是大约(0.1至10)×105单位/日。
例如，当乙型或丙型肝炎病人静脉注射时，糖修饰重组干扰素-αA的日剂量大约是(0.1至100)×105单位，最好是(0.5至30)×105单位。
本发明的糖修饰重组白细胞介素-2(γIL-2)用作抗肿瘤治疗药。在这种情况下，它可以在大约(0.01至1.0)×400，000单位/日的剂量下给病人注射。
当给哺乳动物用药时，与未修饰的细胞素相比，本发明的糖修饰细胞激素从血清中消失要迅速得多，向肝脏转运也迅速得多。另外，尽管未修饰细胞素几乎不向肝脏转运，但本发明的糖修饰细胞激素大部分转运到肝脏。所以本发明的糖修饰细胞激素可以有利地用于增强肝疾病的疗效。
下面用工作实施例和实验实施例更详细地描述本发明，这些实施例不应解释为对本申请的限制。
实施例1110g氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷、即半乳糖的氰甲基硫苷，溶于25ml甲醇中。往该溶液中加入485μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，Wako Pure Chemicnl Iudustries生产)，然后在搅拌下室温反应48小时。取该甲醇溶液5ml分装到蛋状烧瓶中，并用蒸发仪(SIBATA，BUCHI RE111)彻底蒸发甲醇。往生成的干燥的反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组干扰素-αA(γIFN-αA)，含量为3.3mg/ml，pH8.2(0.1M磷酸缓冲液)。室温反应24小时后，加入100μl1M的乙酸水溶液以中止反应。用凝胶柱PD-10(Pharmacia生产)除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时用磷酸盐缓冲液洗脱。
这样制得3mg半乳糖修饰重组干扰素αA，结合到每一个干扰素分子上的半乳糖分子数为3.3。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，PIERCE公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖含量。
实施例2100mg氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于2.5ml甲醇。往该溶液中加4.9μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Industries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将450μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸发掉甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加入1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，pH6.5(0.1M磷酸缓冲液)。室温反应30小时后，加入100μl 1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时，用含0.13M NaCl，pH5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得4.8mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素分子结合的半乳糖分子数为3.3。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，PIERCA公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖含量。
实施例3100mg氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于2.5ml甲醇。往该溶液中加4.9μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Industries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将450μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸发掉甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加入1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，pH7.0(0.1M磷酸缓冲液)。室温反应30小时后，加入100μl 1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时，用含0.13M NaCl，pH5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得5.2mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素分子结合的半乳糖分子数为3.8。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，PIERCA公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖含量。
实施例4;
100mg氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于2.5ml甲醇。往该溶液中加4.9μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Industries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将450μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸发掉甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加入1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，pH7.5(0.1M磷酸缓冲液)。室温反应30小时后，加入100μl 1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时，用含0.13M NaCl，pH5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得2mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素分子结合的半乳糖分子数为5.3。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，PIERCA公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖含量。
实施例5100mg氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于2.5ml甲醇。往该溶液中加4.9μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Industries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将450μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸发掉甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加入1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，pH8.1(0.1M磷酸缓冲液)。室温反应30小时后，加入100μl 1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时，用含0.13M NaCl，pH5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得5.8mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素分子结合的半乳糖分子数为5.8。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，PIERCA公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖含量。
实施例6100mg氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于2.5ml甲醇。往该溶液中加4.9μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Industries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将450μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸发掉甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加入1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，pH8.7(0.1M磷酸缓冲液)。室温反应30小时后，加入100μl 1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时，用含0.13M NaCl，pH5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得5.0mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素分子结合的半乳糖分子数为6.8。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，PIERCA公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖含量。
实施例71.0g氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于2.5ml甲醇。往该溶液中加4.9μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Industries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将450μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸发掉甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加入1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，pH6.5(0.1M磷酸缓冲液)。室温反应30小时后，加入100μl 1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时，用含0.13M NaCl，pH5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得6.4mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素分子结合的半乳糖分子数为9.5。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，PIERCA公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖含量。
实施例81.0g氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于2.5ml甲醇。往该溶液中加4.9μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Industries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将450μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸发掉甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加入1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，pH7.0(0.1M磷酸缓冲液)。室温反应24小时后，加入100μl 1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时，用含0.13M NaCl，pH5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得6.3mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素分子结合的半乳糖分子数为8.5。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，PIERCA公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖含量。
实施例91.0g氰甲基2，34，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于25ml甲醇中。往该溶液中加50μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Industries)生产，接着在搅拌下室温反应72小时，将4.0ml该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往所得的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组干扰素-αA，6.25mg/mlPH7.5(0.1M磷酸盐缓冲液)。室温反应24小时后，加入100μl1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时用含0.13MNacl，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得5.9mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每个干扰素分子上结合的半乳糖分子数为9.7。分别用PIERCE BCA方法((BCA蛋白检测剂，由PIERCE公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖含量。
实施例101.0g氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶入25ml甲酸中。往该溶液中加50μl甲氧基钠(28%甲醇溶液，由Wako Pure C hemical Iudustries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将4.0ml该甲醇溶液装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃并乳糖苷中加1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，PH8.1(0.1M磷酸盐缓冲液)。室温反应24小时后，加入100μl1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时用含0.13m Nacl，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得5.7mg半乳糖修饰重组干扰素αA，，每个干扰素分子上结合的半乳糖分子数为88。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，由PIERCE公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖的含量。
实施例111.0g氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于25ml甲醇中。往该溶液中加50μl甲氧基钠(28%)的甲醇溶液，由Wako Pure C hemical Iudustries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将410ml该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往所得的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，PH8.7(0.1M磷酸盐缓冲液)。室温反应24小时后，加入100μl1M乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时用含0.13M Nacl，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得5.1mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素上结合的半乳糖分子数为11。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，由PIERCE公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖含量。
实施例121.0g氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于25ml甲酸中。往该溶液中加50μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Walo Pure Chemical Iudustries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将410ml该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往所得的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，PH6.5(0.1M磷酸盐缓冲液)。室温反应24小时后，加入100μl1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时用含0.13M Nael，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得4.7mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素上结合的半乳糖分子数为0.6。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，由PIERCE公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖的含量。
实施例131.0g氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于25ml甲醇。往该溶液中加50μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure C hemical Iudustries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将40μl该甲醇溶液分装到一试管中，并同氮气流彻底蒸去甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，PH7.0(0.1M磷酸盐缓冲液)。室温反应24小时后，加入100μl1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时用含0.13M Nacl，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得5.1mg半乳糖修饰干扰素-αA，每分子干扰素上结合的半乳糖的分子数为0.6。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，由PIERCE公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量的修饰半乳糖的含量。
实施例141.0g氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶入25ml甲醇中。往该溶液中加50μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Iudustries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将40μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往所得的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，PH7.5(0.1M磷酸盐缓冲液)。室温反应24小时后，加100μl1M乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时用含0.13M Nacl，PH为5.5的15mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得5.0mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素上结合的半乳糖分子数为1.1。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，由PIERCE公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖的含量。
实施例151.0g氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶入25ml甲醇中。往该溶液中加50μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wakl Pure C hemical Iudustries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将40μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，PH8.1(0.1M磷酸缓冲液)。室温反应24小时后，加入100μl1M乙酸水溶液以便中止反应。用PH-10凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时用含0.13M Nacl，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得5.1mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素上结合的半乳糖的分子数为1.6。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，由PIERCE公司生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖的含量。
实施例161.0g氰甲基2.3.4.6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶入25ml甲醇中。往该溶液中加50μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure C hemical Iudustries生产)，接着在搅拌下室温反应72小时。将40μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组干扰素-αA，6.25mg/ml，PH8.7(0.1M磷酸缓冲液)。室温反应24小时后，加100μl1M的乙酸溶液以便中止反应。用PD-1-凝胶柱除去未反应的吡喃半乳糖苷，同时用含0.13M Nacl，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。
这样制得4.6mg半乳糖修饰重组干扰素-αA，每分子干扰素上结合的半乳糖分子数为2.0。分别用PIERCE BCA方法(BCA蛋白检测剂，由PIERCE生产)和硫酸-酚方法测定蛋白含量和修饰半乳糖的含量。
实验实施例1静脉用药后，血清浓度随时间的变化大鼠静脉注射实施例1、3和16中得到的半乳糖修饰干扰素-αA后测定了血清浓度随时间的变化。测定方法为酶免疫检测。对照组静脉注射未修饰干扰素-αA。结果见图1。
从图1可以看出，10分钟内未修饰的干扰素-αA几乎不从血清中消失，而半乳糖修饰的干扰素迅速消失。
实验实施例2通过肝脏灌流实验测定药物向肝脏转运用大鼠肝脏灌流方法测定半乳糖修饰干扰素-αA向肝脏转运。导管插入大鼠肝门静脉和腔静脉。当从门静脉端灌流半乳糖修饰干扰素-αA(Cin)时，定期收集腔静脉端的灌流液(Cout)，以便跟踪Cim与Cout的浓度比随时间的变化。该实验中，下腔静脉用手术缝合结扎。同时测定大鼠灌流未修饰干扰素-αA时的Cin与Cout的比值作对照。结果见图2。
从图1可以看出，未修饰干扰素-αA的Cout/cin比接近1，说明不由肝脏转运，而半乳糖修饰干扰素-αA的Cout/Cin比为0.1至0.4，说明向肝脏转运。
实验实施例3用培养肝细胞测定2′，5′-寡腺苷酸合成酶活性，用培养的大鼠肝细胞检测了半乳糖修饰干扰素-αA引起的2′，5′-寡腺苷酸合成酶活性增高。通过胶原酶处理收集大鼠肝细胞。这样得到的1×102个肝细胞分散到含有10%胎牛血清(FCS)的1ml Eagle最小必需介质(Eagle MEM)中，并加入各种浓度的实施例1的半乳糖修饰干扰素-αA或未修饰干扰素-αA。在37℃的孵育箱中培养1天后，离心分离细胞并加至0.01%Triton X-100(由Wako Pure Chemical Industries生产)中，匀化口用0.2μm漏斗滤去细胞碎片之后，用2′，5′-寡腺苷酸合成酶检测盒(Eiken Chemical Co.Lfd)测定滤液的2′，5′-寡腺苷酸合成酶的活性。结果见图3。
从图3可以看出，半乳糖修饰干扰素-αA在低至未修饰干扰素-αA的1/100至1/1000浓度下还可以增强2′，5′-寡腺苷酸合成酶的活性。这一发现说明，干扰素-αA在肝细胞中活性增加是半乳糖修饰干扰素-αA向肝细胞转运明显改进的结果。由于这一原因，半乳糖修饰干扰素-αA在比未修饰干扰素-αA低的浓度下就可以增强2′，5′寡腺苷酸合成酶活性。
实验实施例4体外测定抗病毒活性按已知方法〔M.Rubinstein et alProc.Natl.Acad.Sci.USA，76，640(1979);R.K.Maheshwari and R.M.FridmanVirol.101，399(1980)〕进行实验。特别是干扰素或半乳糖修饰干扰素用含10%胎牛血清的介质(Eagle′s MEM)稀释成各种浓度，并加到96-孔微量板上，每孔50μl。接着把悬浮于相同介质的MDBK细胞(4×105个细胞/ml)加到微量平板孔中，每孔50μl，再在37℃孵育3小时。病毒(VSV)制品(2×105PFU或血小板形成单位/ml)用相同的介质稀释，再加到微量平板孔中，每孔50μl，接着37℃孵育40小时。
用0.1%中性红(每孔25μl)污染后，所述细胞在37℃再孵育1小时，然后加4%的福尔马林溶液(每孔25μl)以便使病毒失活并固定细胞。微量平板放置30分钟后，用紫外光照射，用水洗并干燥，染料用含2%(V/V)柠檬酸的1∶1的乙三醇-乙醇混合物(每孔100μl)萃取，测定540nm处的吸收。
干扰素-αA标准制品的抗病毒标准工作曲线见图4。
实施例17半乳糖修饰干扰素-αA的合成(1)100mg半乳糖的氰甲基硫苷，即氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于2.5ml甲醇中。往该溶液中加419μl28%甲氧基钠的甲醇溶液，接着室温反应72小时。将200至400μl该反应液分装到一试管中，并用氮气流蒸去甲醇。往这样得到的2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加含重组干扰素的0.1M磷酸盐缓冲液(PH7.0，6.25mg/ml)1.0ml，接着室温反应30小时。加1M乙酸水溶液中止反应后，产物用PD-10柱层析纯化。用25mM乙酸铵-0.13M Nacl(PH5.5)洗脱。得大约4.8至5.8mg半乳糖修饰干扰素-αA。
用市售BCA蛋白检测盒(PIERCE公司)测定蛋白浓度。通过氨基酸分析测定每分子干扰素中的半乳糖分子数。用实验实施例4中描述的方法测定抗病毒活性。
结果列入表1。给合4.1个半乳糖分子的干扰素的抗病毒活性与未修饰干扰素相等，而结合5.7个半乳糖分子的干扰素的抗病毒活性降至63%。
U活性单位实施例18半乳糖修饰干扰素-αA的合成(2)往按实施例17同样的途径制得的2-亚氨-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷(等于150至190μl反应液的量)中加1.0ml含有干扰素-αA的0.1M磷酸缓冲液(PH7.0，1.82mg/ml)，接着室温反应30小时。然后按与实施例17相同的方式处理，得纯化的半乳糖修饰干扰素-αA。
结果列入表2。在任何反应条件下，产率为90至97%，随加入的活泼半乳糖的量增加，修饰半乳糖的分子数增加。
表2
实施例19半乳糖修饰干扰素-αA的合成(3)往按实施例17同样的途径制备的2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷(等于25到400μl反应液的量)中加1.0ml含干扰素-αA的0.1M磷酸缓冲液(PH8.0，0.54mg/ml)，接着室温反应30小时。按实施例17的方法处理，得纯的半乳糖修饰干扰素-αA。
结果列入表3。随着加入的活泼半乳糖的量增加，修饰的半乳糖的分子数增加。同时，当修饰半乳糖的分子数少于5时，只保留80%以上的抗病毒活性。
表3
实施例20半乳糖基化的干扰素-αA的合成(4)往9.7mg干扰素-αA与1.0ml0.2M硼酸钠缓冲溶液(PH8.0)组成的溶液中加10mg氰硼氯化钠，接着在37℃孵育5天。加0.1ml1M乙酸水溶液中止反应后，反应产物用PD-10凝胶过滤柱纯化，用25mM乙酸铵-0.13M Nacl溶液平衡。
制得1.6mg有4.7个乳糖分子修饰的干扰素-αA。产物的抗病毒活性大约是未修饰干扰素的81%。
实验实施例5肝定向的半乳糖修饰干扰素-αA(1)未修饰干扰素-αA和实施例17制得的结合有4.1个半乳糖分子的干扰素-αA均由肌肉注射给予3只大鼠(4×106单位/大鼠)。1小时后给大鼠放血，用已知的酶免疫检测方法(ELISA)测定肝、肾和血清中的干扰素-αA浓度。
结果列入表4。半乳糖修饰的干扰素-αA显示增加向肝转运，向肝转运的选择性大约是未修饰干扰素-αA的80倍。根据血清浓度，两种干扰素-αA向肾的转运几乎相等。
浓度数据用平均值±SD表示。括号中的数据为浓度比。
实验实施例6肝定向的半乳糖修饰干扰素-A(2)磷酸盐缓冲液生理盐水(PBC)、未修饰干扰素-αA和实施例17中制得的结合4.1个分子半乳糖的干扰素-αA均由肌肉注射给予大鼠(4×106单位/大鼠)。3和24小时后切除肝。取出的肝与4ml0.1M乙酸钠缓冲溶液(PH5.0)制成匀浆，接着离心。用实验实施例5中描述的酶免疫检测方法测定上清液的干扰素-αA浓度，并按实验实施例4中描述的方法测定抗病毒活性。
结果列入表5。半乳糖修饰干扰素-αA显示比未修饰干扰素-αA更好的肝脏积聚效果和保留性能，即使用药24小时后也仍然观察到显著的抗病毒活性
实施例21100mg氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酸基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷，即氰甲基半乳糖硫苷，溶入2.5ml甲醇。往该溶液中加49μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Iudustries生产)，接着在25℃反应72小时。将30μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往所得的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组白细胞介素-2(rIL-2)，0.7mg/ml，PH8.5(0.1M磷酸盐缓冲液)。25℃反应24小时后，加100μl1M的乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱(由Pharmacia生产)除去未反应的吡喃半乳糖苷，用含0.13M Nacl，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。这样制得473μg半乳糖修饰重组白细胞介素-2，根据氨基酸分析测得每个白细胞介素-2分子中结合的半乳糖分子数为3.4。
实施例22100mg氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酸基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷，即半乳糖氰甲基硫苷，溶入2，5ml甲醇。往该溶液中加49μk甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Iudustries生产)，接着在25℃反应72小时。将40ml该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往生成的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组白细胞介素-2，0.7mg/ml，PH8.5(0.1M磷酸盐缓冲液)。25℃反应24小时后，加100μl1M乙酸水溶液以便中止反应。用PD-10凝胶柱(由Pharmacia生产)除去未反应的吡喃半乳糖苷，用含0.13M Nacl，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。这样得493μg半乳糖修饰重组的细胞介素-2，氨基酸分析测得每个白细胞介素分子上结合的半乳糖分子数为4.3。
实施例23100mg氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷，即半乳糖氰甲基硫苷，溶入2.5ml甲醇。往该溶液中加49μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Iudustries生产)，接着搅拌下在25℃反应72小时。将50μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往所得的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加1ml重组白细胞介素-2，0.7mg/ml，PH8.5(0.1M磷酸盐缓冲液)。25℃反应24小时后，加100μl1M乙酸水溶液，以便中止反应。用PD-10凝胶柱(Pharmacia生产)除去未反应的吡喃半乳糖苷，用含0.13M Nacl，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。这样制得533μg半乳糖修饰重组白细胞介素-2，由氨基酸分析测得每分子白细胞介素-2上结合的半乳糖分子数为5.2。
实验实施例7表6显示了实施例21、22和23中得到的半乳糖修饰重组白细胞介素-2的残留特殊生物活性的测定结果。生物活性用白细胞介素-2依赖的小鼠天然杀伤细胞系NKC3按Tada等的方法〔J.Immunol.Methods，93，157-165(1986)〕测定表6 修饰半乳糖的分子数和残留的生物活性
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实施例24往1.5ml干扰素-αA，0.7mg/ml，PH9.5(0.1M碳酸钠)中加入1.5mlβ-D-吡喃半乳糖基苯基异硫氰酸酯(Sigma公司生产)，0.5mg/ml，PH9.5(0.1M碳酸钠)，接着于25℃反应24小时。用PD-10凝胶柱(Pharmacia生产)除去未反应的β-D-吡喃半乳糖基苯基异硫氰酸酯，用含0.13M Nacl，PH为5.5的25mM乙酸铵缓冲溶液洗脱。这样制得789μg半乳糖修饰干扰素-αA，由氨基酸分析测得每分子干扰素-αA结合的半乳糖分子数为2.0。
实施例25往1.5ml干扰素-αA溶液，0.7mg/ml，PH9.5(0.1M碳酸钠)，中加0.5mlβ-D-吡喃半乳糖基苯基异硫氰酸酯(Sigma生产)，0.5mg/ml，PH9.5(0.1M碳酸钠)，接着在25℃反应24小时。用PD-10凝胶柱(Pharmacia生产)除去未反应的β-D-吡喃半乳糖基苯基异硫氰酸酯，用含0.13M Nacl，PH5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。这样得到860mg半乳糖修饰干扰素-αA，氨基酸分析测得每分子干扰素上结合的半乳糖分子数为4.0。
实施例26往1.5ml干扰素-αA溶液，0.7mg/ml，PH9.5(0.1M碳酸钠)，中加0.75mlβ-D-吡喃半乳糖基苯基异硫氰酸酯，0.5mg/ml，PH9.5(0.1M碳酸钠)，接着在25℃反应24小时。用PD-10凝胶柱(由Pharmacia生产)除去未反应的β-D-吡喃半乳糖基苯基异硫氰酸酯，用含0.13M Nacl，PH5.5的25mM乙酸铵缓冲液洗脱。这样制得870μg半乳糖修饰干扰素-αA，氨基酸分析测得每分子干扰素上结合的半乳糖分子数为4.8。
实施例27半乳糖修饰鼠干扰素-β的合成100mg氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷，即半乳糖氰甲基硫苷，溶入2.5ml甲醇中。往该溶液中加4.9μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Industries生产)，接着于25℃反应72小时。将360μl该甲醇溶液分装入一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往所得的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加120μl0.1M磷酸盐缓冲液(PH7.0)，以便溶解该产物。然后往该缓冲溶液中逐步加入溶于0.1M磷酸盐缓冲液(PH7.0)中的重组鼠干扰素-β(200μg/1.2mlFrnakshi公司出售)。25℃反应24小时后，用PD-10凝胶柱(Pharmacia生产)除去未反应的吡喃半乳糖苷，用50mM乙酸铵缓冲液(PH4.5)洗脱。
这样制得208μg半乳糖修饰干扰素-β，氨基酸分析测得每分子干扰素-β上结合的半乳糖分子数为2.5。
实施例28100mg氰甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷，即半乳糖氰甲基硫苷，溶入2.5ml甲醇中。往该溶液中加4.9μl甲氧基钠(28%的甲醇溶液，由Wako Pure Chemical Industries生产)，接着25℃反应72小时。将420μl该甲醇溶液分装到一试管中，并用氮气流彻底蒸去甲醇。往所得的干燥反应产物2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷中加120μl0.1M磷酸盐缓冲液(PH7.0)以便溶解该产物。然后往该缓冲液中逐步加溶于0.1M磷酸盐缓冲液(PH7.0)的重组鼠干扰素-β(200μg/1.2ml由Frnakoshi公司出售)。25℃反应24小时后，用PD-10凝胶柱(Pharmacia生产)除去未反应的吡喃半乳糖苷，用50mM乙酸铵缓冲液(PH4.5)洗脱。
这样制得212μg半乳糖修饰鼠干扰素-β，氨基酸分析没得每个干扰素-β分子上结合的半乳糖分子数为4.0。
实验实施例8注射鼠干扰素-β的小鼠肝中2′，5′-寡腺苷酸合成酶活性未修饰鼠干扰素-β和实施例28制得的结合4.0个半乳糖分子的干扰素-β均给小鼠腹膜内注射，日剂量为1.0μg/小鼠，分1次或2次注射。每组由4只C3H小鼠组成。一天后小鼠放血，肝脏在4倍体积的磷酸盐缓冲液生理盐水中制成匀浆。离心后，萃取的上清液象实验实施例3中一样测定2′，5′-寡腺苷酸合成酶活性。
结果列入图5和图6。从图5可以看出，即使在0.2μg/日/小鼠的单一剂量下半乳糠修饰干扰素-β也能提高2′，5′-寡腺苷酸合成酶的活性，而未修饰干扰素-β无此作用。从图6可以看到，在单一剂量和贯序剂量1.0μg/日/小鼠下半乳糖修饰干扰素-β增强活性的能力明显强于未修饰干扰素β。
权利要求
1.糖修饰细胞素，其包括把修饰基接到细胞素的一伯氨基上，其中所说的修饰基由通式(Ⅰ)表示其中R为糖；X为
其中n为任意正整数、-C6H4-NH-CS-，-S-CH2-CO-NH-CH2-CH2-，-O-CH2-CH2-，-CO-NH-C6H3(CH3)-NHCS-，-CO-(CH2)e-CO-其中l为整数3至6，
其中Y为
其中Y的定义同上，-CO-NH，or
2.权利要求1的糖修饰细胞素，其中X为
其中n为任意正整数，
-C6H4-NH-CS-
3.权利要求1的糖修饰细胞素，其中X为-S-(CH2)n-C-，其中n为任意正整数。
4.权利要求1的糖修饰细胞素，其中所说的细胞素为一种干扰素。
5.权利要求4的糖修饰细胞素，其中所说的干扰素为干扰素-α。
6.权利要求1的糖修饰细胞素，其中所说的伯氨基为赖氨酸残基的ε-氨基。
7.权利要求1的糖修饰细胞素，其中所说的伯氨基为N-端氨基酸残基的α-氨基。
8.权利要求1的糖修饰细胞素，其中所说的糖基为吡喃糖基。
9.权利要求8的糖修饰细胞素，其中所说的吡喃糖基为吡喃半乳糖基、吡喃甘露糖基、吡喃葡萄糖基、或吡喃果糖基。
10.糖修饰干扰素，其包括往干扰素的至少一个伯氨基上连接修饰基，其中所说的修饰基由通式(Ⅰ)表示其中R为糖基;X为
其中n为任意正整数，
-C6H4-NH-CS-，-S-CH2-CO-NH-CH2-CH2-，-O-CH2-CH2-，-CS-NH-C6H3(CH3)-NHCS-，-CO-(CH2)
-CO-其中l为3至6的整数，-CO-CH(OH)-CH(OH)-CO-，
其中Y为
其中Y为定义同上，-CO-NH，or
11.权利要求10的糖修饰干扰素，其中X为
其中n为任意正整数，
-C6H4-NH-CS-
12.权利要求10的糖修饰干扰素，其中X为
其中n为任意正整数。
13.权利要求10的糖修饰干扰素，其中所说的干扰素为干扰素-α。
14.权利要求10的糖修饰干扰素，其中所说的伯氨基为赖氨酸残基的ε-氨基。
15.权利要求10的糖修饰干扰素，其中所说的伯氨基为N-端氨基酸残基的α-氨基。
16.权利要求10的糖修饰干扰素，其中所说的糖基为吡喃糖基。
17.权利要求16的糖修饰干扰素，其中所说的吡喃露基为吡喃半乳糖基、吡喃甘露糖基、吡喃葡萄糖基、或吡喃果糖基。
18.权利要求10的糖修饰干扰素，其中结合了2至5个由通式(Ⅰ)表示的基团。
19.权利要求18的糖修饰干扰素，其中结合了4个由通式(Ⅰ)表示的基团。
全文摘要
发明了糖修饰细胞素，该糖修饰细胞素促使在服用后迅速向活体的肝脏转运几乎全部剂量；并能有利地用来增强对肝炎患者的治疗效果并减少副作用。
文档编号C07K14/555GK1087916SQ93117879
公开日1994年6月15日 申请日期1993年9月23日 优先权日1992年9月24日
发明者滨口直, 佐藤纯, 道券一浩 申请人:武田药品工业株式会社