使用包含聚乙二醇部分的化合物在支持物上固定细胞的方法

使用包含聚乙二醇部分的化合物在支持物上固定细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及在支持物上固定细胞的方法，所述方法包括a）提供包含连接至一个亲水结构域的一个或多个疏水结构域的化合物或其盐，优选由连接至一个亲水结构域的一个或多个疏水结构域组成的化合物或其盐，其中所述一个或多个疏水结构域共价结合所述亲水结构域，并且其中所述一个或多个疏水结构域各自包含直链脂质、类固醇或疏水维生素，并且其中所述亲水结构域包含聚乙二醇（PEG）部分，并且其中所述化合物包含连接基团；b）在允许化合物与细胞膜相互作用的条件下将细胞与化合物接触，由此在细胞表面上固定连接基团；和c）将细胞上固定的连接基团与能够结合所述连接基团的支持物接触，由此在支持物上固定所述细胞。
【专利说明】使用包含聚乙二醇部分的化合物在支持物上固定细胞的方法
[0001] 本发明设及在支持物上固定细胞的方法，所述方法包括a)提供包含连接至一个亲 水结构域的一个或多个疏水结构域的化合物或其盐，优选由连接至一个亲水结构域的一个 或多个疏水结构域组成的化合物或其盐，其中所述一个或多个疏水结构域共价结合所述亲 水结构域，并且其中所述一个或多个疏水结构域各自包含直链脂质、类固醇或疏水维生素， 并且其中所述亲水结构域包含聚乙二醇(PEG)部分，并且其中所述化合物包含连接基团;b) 在允许化合物与细胞膜相互作用的条件下将细胞与化合物接触，由此在细胞表面上固定连 接基团；和C)将细胞上固定的连接基团与能够结合所述连接基团的支持物接触，由此在支 持物上固定所述细胞。
[0002] 在US2005/0208644A1中，使用利用两种化合物的系统来固定细胞。其中公开了通 过使用具有对细胞的亲和力的化合物W期望模式将细胞固定在固相表面上的方法。通过使 用另一第二化合物(其更容易固定在固相表面上），将第一化合物结合到第二化合物上。第 一化合物描述为对膜的生物相容的错(BAM)。该错具有缠绕(bines)的脂族基团，因为其插 入到细胞膜内并且其可W通过非共价键固定而不损伤细胞。Kato K.等人， Biotechnol.Prog.2004，20，897-904:描述了所谓的BAM (BAM90: -个油締基链;DO阳- BAM80:二油締基憐脂酷乙醇胺），由于高度水溶性、蛋白进入细胞膜外侧小叶中的快速错 定能力、细胞膜中的高保留和缺少溶胞活性，其可用作蛋白进入细胞膜的错定试剂，表明运 种错定技术对于细胞表面工程化是有希望的。"Kato K.等人BioTechniques 2003 35: 1014-1021描述了通过生物相容的错分子即油締基-0-聚(oly)(乙二醇)-下二酷-N-径基- 班巧酷亚胺基-醋在表面上的悬浮细胞附着。
[0003] 然而，现有技术的化合物具有若干缺点。使用此类化合物的细胞固定既不是定量 的也不是细胞类型依赖性的。而且，不同细胞类型的混合物，例如天然存在于血液样品中 的，无法定量地且不取决于细胞表型而附着到表面上。此外，细胞与表面的结合对于随后的 处理步骤例如免疫化学染色和洗涂不足够紧密。现有技术的另一个缺点是所述接头分子可 能被细胞内化(internal ized)或被细胞排斥，最终导致细胞释放和/或损失。
[0004] 因此，存在对于固定细胞而不影响活力且优选能够定量细胞的新方法的需求。
[0005] 本发明的方法解决了运一问题并且克服了现有技术的缺点。用本发明的方法使用 基于PEG的化合物，可W捕获所有类型的细胞，涵盖悬浮细胞和贴壁细胞。
[0006] 在一个实施方案中，本发明设及在支持物上固定细胞的方法，所述方法包括 a) 提供包含连接至一个亲水结构域的一个或多个疏水结构域的化合物或其盐，优选由 连接至一个亲水结构域的一个或多个疏水结构域组成的化合物或其盐， 其中所述一个或多个疏水结构域共价结合所述亲水结构域，且 其中所述一个或多个疏水结构域各自包含直链脂质、类固醇或疏水维生素，且其中所 述亲水结构域包含聚乙二醇(PEG)部分，且 其中所述化合物包含连接基团； b) 在允许化合物与细胞膜相互作用的条件下使细胞与化合物接触，从而在细胞表面上 固定连接基团；和 C)将细胞上固定的连接基团与能够结合所述连接基团的支持物接触，从而在支持物上 固定所述细胞。
[0007] 令人惊奇地发现相比于固定此类化合物至表面并随后将细胞固定其上，在固定细 胞至支持物之前，用如上定义的化合物处理细胞的情况下，细胞固定是更有效的（例如，参 见图3-5)。
[0008] 本发明的方法允许在支持物上固定细胞。
[0009] 术语"支持物"或"表面"指通过非均相反应与液相中的试剂相互作用的材料。优选 地，支持物是固体支持物。
[0010] 术语"固体支持物"指通过非均相反应与液相中的试剂相互作用的固相中的材料。 使用固体支持物是化学、生物化学、药学和分子生物学领域中熟知的。根据待解决的技术问 题已开发了许多类型的固体支持物。运些中的任何均可用于本发明的上下文中。例如，用于 本发明的方法中的固体支持物可W包括W下组分:二氧化娃、乙酸纤维素、硝酸纤维素、尼 龙、聚醋、聚酸讽、聚締控或聚偏二氣乙締、或其组合。进一步合适的固体支持物包括但不限 于可控孔度玻璃、玻璃板或载玻片、聚苯乙締和活化的葡聚糖。在其他方面，合成有机聚合 物诸如聚丙締酷胺、聚甲基丙締酸醋、和聚苯乙締也是说明性的支持物表面。此外，多糖诸 如纤维素和葡聚糖是支持物表面的进一步说明性的实例。其他支持物表面诸如纤维也是可 行的。
[0011] 固体支持物可W包含在容器中，其中所述容器是管，诸如离屯、管或旋转管（spin 化be)、注射器、药筒、室(chamber)、多孔板、或试管、或其组合。固体支持物可W预处理或进 行官能化W允许细胞固定。例如，孔板可W用链霉抗生物素预处理，如实施例中所示的。在 一个实施方案中，固体支持物可W是纤维的或微粒的，通常允许合适的接触。适于使用的固 体支持物的大小可W改变。细胞可W仅结合一个固体支持物(例如一个容器或多孔板)或可 W结合许多固体支持物(例如珠粒）。适于使用的固体支持物的形状例如可W是片、预切割 的盘、圆筒、单纤维、或由微粒构成的固体支持物。在一个优选的实施方案中，固体支持物是 平的、或具有腔的实质上平的。在一个实施方案中，固体支持物可W是纤维的或微粒的。固 体支持物的大小可W改变且可W根据待进行的方法或应用来选择。
[0012] 在一些实施方案中，固相是测试条、忍片、尤其是微阵列或纳米阵列忍片、微量滴 定板或微粒。
[0013] 可用于本发明的方法中的化合物固定细胞的基本原则是可用于本发明的方法的 化合物的末端疏水部分错定入目标细胞膜的脂质双层中。细胞可W然后例如随后附着到特 定修饰的表面上，和任选地可W标记W显色和/或检测。取决于疏水部分，还可W实现优先 或专一结合到特定细胞。
[0014] 此外，固定方法采用如实施例中详细所示的此外展示有利的稳定作用的化合物。 运在经固定的细胞的细胞活力和/或细胞形态受关注且重要的情况下是特别重要的。
[0015] 特别是，包含胆固醇部分作为疏水部分的化合物尤其优选。
[0016] 稳定特别是剪切保护作用尤其对在可用于本发明的方法的化合物中的胆固醇、肉 豆違酸和硬脂酸作为疏水部分得到证实(参见实施例5)。
[0017] 将聚乙二醇（PEG)部分理解为直链或支链的部分，优选直链部分，其包含至少一 个-0-C出-C出-部分，优选地优选1-50个，更优选4-30个-0-C出-C出-部分。
[0018] 稳定的基本原理一除提供固定一还假定为结合分子的末端疏水部分错定入细胞 膜的脂质双层内。运一疏水分子固定降低质膜流动性并因此稳定细胞。
[0019] 本发明的方法中采用的化合物包含连接基团。
[0020] 连接基团是适合于可逆地或不可逆地、和/或共价或非共价地固定化合物至表面 或支持物尤其是固体支持物的部分。在优选的实施方案中，连接基团是抗体或抗原结合的 抗体片段、受体或其结合位点、受体的配体、酶或其结合位点、酶的底物、标签结合位点、标 签、或官能化学基团。
[0021] 官能化学基团可W例如为琉基，其可W通过形成共价的、不可逆的-S-S-键结合至 金涂覆的底物表面。
[0022] 生物素与链霉抗生物素或抗体或结合抗原的抗体片段的结合是非共价且可逆的。 此类利用非共价结合固体支持物的连接基团在旨在将细胞再次分开用于进一步用途例如 用于在动物模型中施用的情况下是优选的。
[0023] 在优选的实施方案中，连接基团可W是例如允许非共价结合链霉抗生物素包被的 表面或支持物的生物素部分、或可W结合作为固体支持物的金涂覆的底物表面的琉基。
[0024] 根据本发明特别优选的连接基团是生物素。发现包含生物素作为连接基团的化合 物特别可用于固定细胞，如实施例中所示。
[0025] 脂质是选自W下的疏水小分子:脂肪、蜡类、酱醇类、可溶性脂肪、疏水维生素诸如 维生素 A、D、E和K，脂肪酸甘油一醋、甘油二醋、甘油Ξ醋和憐醋。
[0026] 疏水维生素是选自维生素 A、D、E和K的小分子。在更优选的实施方案中，疏水维生 素是α-生育酪。
[0027] 可用于本发明的方法的化合物包含一个或多个疏水结构域、一个亲水结构域和连 接基团，优选由其组成。
[00%]优选地，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个疏水结构域共价结合所述亲水结构域。
[0029] 如实施例中所示，用于本发明的方法的化合物与细胞接触。由于固定优选用活细 胞或可能活的细胞来完成，因此细胞通常存在于水溶液(其优选是缓冲的和/或包含营养 素）中，例如细胞悬浮在PBS中。本发明的方法中使用的化合物可W通过本领域已知的方法 如吸取(pipetting)例如W溶液的形式，例如作为水溶液添加至细胞中。
[0030] 通常，将化合物例如作为水溶液加入目标细胞悬液中。通常，轻柔地进行混合W维 持细胞活力。
[0031] 通常，接触在约rc-45Γ、优选10Γ-30 Γ、更优选22。-38Γ的溫度发生。优选地， 选择不影响细胞活力的溫度。
[0032] 而且，接触通常W约900-1100 mbar的压力发生W维持细胞活力。
[0033] 而且，细胞优选与化合物解育足够时间W允许结合。通常，细胞优选与化合物解育 1分钟至3天，优选5分钟至24小时，甚至更优选10分钟至8小时。
[0034] 此外，通常选择水溶液W不影响细胞的完整性和/或活力。
[0035] 此类条件允许化合物与细胞膜的相互作用。由此连接基团固定在细胞上。
[0036] 本发明的方法的步骤C)设及将细胞上固定的连接基团与能够结合所述连接基团 的支持物接触，从而在支持物上固定所述细胞。此类接触可W通过添加步骤b)中获得的细 胞至合适支持物，例如通过吸取步骤b)中获得的细胞至合适的支持物来完成。在该实施方 案中，步骤b)的细胞和支持物在步骤c)之前空间上分开。例如，包含生物素部分的本文公开 的化合物可W固定在细胞上。解育后，由此获得的细胞可W吸取或W其他方式转移至用链 霉抗生物素包被的阵列或孔板。生物素和链霉抗生物素部分将结合由此固定细胞至表面。
[0037] 可选地，步骤b)中获得的细胞不与支持物空间上分开。在此类实施方案中，细胞已 经例如在孔板中，且可用于本发明的方法的包含连接基团的化合物添加至悬浮细胞中，或 可用于本发明的方法的包含连接基团的化合物存在于例如孔中，且将细胞(其悬浮于合适 的缓冲液中）添加至孔。在该实施方案中，连接基团是运样的部分，其允许仅在特定条件下 的结合，由此代表分子开关。例如，连接基团可W是官能化学基团（其仅当添加辅因子或反 应物时与能够结合连接基团的支持物反应)或生物亲和(bioaffine)结合对的成员（其需要 辅因子W结合，由此在支持物上固定细胞）。
[0038] 优选地，与细胞接触的化合物在步骤b)中与表面或支持物空间上分开。如实施例 中所示，生物素和链霉抗生物素可用作结合对。在实例中，将生物素用作化合物的连接基 团，且能够结合连接基团的支持物是用链霉抗生物素包被的支持物。
[0039] 能够结合连接基团的支持物是运样的支持物，所述支持物可W是未处理的，如果 所述支持物本身能够结合连接基团，如在能够与琉基反应的金表面的情况中；或可W预处 理W包含合适结合对的成员、或官能团W与连接基团反应。预处理的性质取决于支持物和 适合于结合连接基团的待与其连接的部分的化学性质。在优选的实施方案中，能够结合连 接基团的支持物被预处理，并包含生物亲和结合对的一个成员，具体而言，支持物包含抗体 或结合抗原的抗体片段，受体或其结合位点、针对受体的配体，酶或其结合位点、针对酶的 底物，标签结合位点、或与其结合的标签，优选与其共价结合。
[0040] 应理解对应于连接基团来选择预处理的支持物上的部分，W获得能够结合连接基 团的支持物。
[0041] 在优选的实施方案中，本发明设及本发明的方法，其中化合物包含一个或多个疏 水结构域和一个亲水结构域的，优选由其组成， 其中所述一个或多个疏水结构域共价结合所述亲水结构域，且 其中所述一个或多个疏水结构域各自包含直链脂质、类固醇或疏水维生素，且 其中所述亲水结构域包含式(I)的化合物： Xl-[Al-(Ll)n]ki-Z-[A2-(Ll)n]k2-X2 (I), 其中 Z为含有1-100、优选1-50、更优选4-30个-0-C出-C出-部分的直链聚乙二醇(PEG)部分， 其中所述聚乙二醇部分任选地包含一个或多个连接两个-0-C出-C出-部分的间隔基部分SP， 并且其中所述直链阳G部分任选地包含在一个或两个末端的接头部分L3， 每一 L1为彼此独立选择的接头部分， 每一η为0或1，彼此独立选择， Α1和Α2为彼此独立选择的双官能或Ξ官能部分，条件是至少一个Α1或Α2是Ξ官能的， kl和k2为0-10的整数，彼此独立选择，条件是kl和k2的至少一个不是0， XI和X2独立地选自氨或保护基， L3独立地选自具有1-10个C原子的直链烷基或締基链，其任选地(i )被1-3个N、0或S原 子间断，和/或（i i )被1 -4个径基、幾基、氨基或琉基所取代， 且 其中所述一个或多个疏水结构域经所述Ξ官能结构域共价结合所述亲水结构域， 且 其中所述化合物进一步包含连接基团， 或其盐。
[0042] 对于稳定作用，发现本发明的方法中使用的化合物优选包含2个或3个或更多、更 优选2个或3个疏水结构域是有利的。具有特定优点，在一个具体的实施方案中，至少一个脂 质疏水结构域包含类固醇。
[0043] 在本发明的一个优选的实施方案中，2个或3个或更多个、更优选2个或3个疏水部 分疏水结构域共价结合所述亲水结构域。
[0044] 对于本文的一般理解，"疏水部分"包含于并形成"疏水结构域"的主要部分，因此 决定其疏水特性。
[0045] 包含2个或更多个疏水部分的化合物的疏水部分可W是相同的或可W是不同的。 例如，包含两个疏水结构域的本发明的方法中使用的化合物可W包含2个肉豆違酸部分，或 一个肉豆違酸部分或一个胆酱醇基部分。
[0046] 疏水结构域各自包含直链脂质、类固醇或疏水维生素，优选由其组成。
[0047] 直链脂质、类固醇或疏水维生素可W直接结合Ξ官能部分或经接头L2结合Ξ官能 部分。其中直链脂质、类固醇或疏水维生素直接结合Ξ官能部分的化合物的实例是化合物 肉豆違酸-肉豆違酸-(间隔基C18)7-Fluos-生物素-TEG。其中直链脂质、类固醇或疏水维生 素经接头L2结合Ξ官能部分的化合物的实例是化合物胆酱醇基-TEG-胆酱醇基-TEG-(间隔 基C18) 7-Fluos-生物素-TEG。在该后一实例中，TEG(四乙二醇)是接头L2。
[0048] 在一个优选的实施方案中，疏水结构域各自由直链脂质、类固醇或疏水维生素组 成。在运一情况下，显然疏水结构域是疏水的、更优选是亲脂的，因为直链脂质、类固醇或疏 水维生素是疏水的、更优选是亲脂的。
[0049] 疏水部分应理解为排斥水体(a mass of water)的部分。优选地，所述部分是亲脂 的；即其趋于溶于其他非极性的亲脂物质如脂肪或脂肪酸。
[0050] 在另一优选的实施方案中，疏水部分各自包含直链脂质、类固醇或疏水维生素和 一个或多个其他部分。在该实施方案中，疏水部分作为整体是疏水的，更优选是亲脂的。
[0051] 在甚至更优选的实施方案中，包含直链脂质、类固醇或疏水维生素的可用于本发 明的方法的化合物的疏水结构域能够插入细胞膜内。运可W通过本领域已知的方法来确 定。
[0052] 在一个优选的实施方案中，可用于本发明的方法的化合物的2个或3个疏水部分是 不同的疏水结构域，或者在3个疏水部分的情况下，两个与第Ξ个是不同的或者所有Ξ个彼 此均不相同。
[0053] 在本发明的运一优选的实施方案中，第一疏水结构域包含饱和脂肪酸，尤其是肉 豆違酸、硬脂酸或二十二酸，特别是肉豆違酸，优选由W上组成;和/或第二疏水结构域包含 胆固醇，优选由其组成。在第Ξ疏水结构域的情况下，该结构域优选包含胆固醇或饱和脂肪 酸，尤其是肉豆違酸、硬脂酸或二十二酸，特别是肉豆違酸，优选由W上组成，和/或该结构 域与第一或第二疏水结构域相同。
[0054] 运一构象显示相比于单价分子(即，本发明的包含一个疏水部分的分子)具有对细 胞的更高的结合亲和力。因此，相比于单价分子，需要可用于本发明的方法中的化合物的更 低的浓度W达到剪切保护作用。
[0055] 分子的亲水部分抑制可用于本发明的方法的化合物的内化并且剪切保护作用被 疏水部分并入外部质膜而诱导。用标记的可用于本发明的方法的化合物的实验已证实化合 物刚好并入外部质膜而不影响细胞内部。
[0056] 关于固定，在实施例中发现具有疏水部分的化合物显示所有细胞类型的祀向和紧 密保持(具体参见实施例2)。具体地，发现胆固醇、肉豆違酸、硬脂酸和二十二酸部分特别可 用于用于本发明的方法的化合物中。
[0057] 而且，发现采用含有一个、两个或Ξ个疏水部分的化合物的方法在实验中证实对 于定量细胞固定是有利的。
[0058] 根据本发明，将"胆固醇-双接头分子"理解为含有两个疏水部分(其均为胆固醇） 的可用于本发明的方法的化合物。因此，将"肉豆違酸-Ξ接头分子"理解为包含Ξ个疏水部 分(其均为肉豆違酸)的化合物。
[0059] 根据本发明，将"不对称的双接头分子"理解为包含两个疏水部分的化合物，其中 两个疏水部分彼此不同。
[0060] 用于本发明的方法的化合物在实例中大部分W该模块、图示方式进行描述。
[0061 ]根据本发明，将化合物"胆酱醇基-TEG-胆酱醇基-TEG-(间隔基C18)7-Fluos-生物 素-TEG"如6 A中所示)理解为其中作为疏水部分的两个胆固醇部分经TEG(四乙二醇）结合 至Ξ官能部分的化合物。
[0062] 根据图6,其显示化合物的模块描述连同化学式，将"（间隔基C18)"理解为长度18 个原子的PEG部分随后为作为间隔基部分的憐酸醋部分。因此，-(间隔基C18)7-理解为由7 个"(间隔基C18)"部分组成的部分。
[0063] 根据本发明，将"Fluos"理解为直接结合Ξ官能部分A2的巧光素部分。
[0064] 根据本发明，将"生物素-TEG"理解为经接头TEG结合Ξ官能部分A2的生物素部分。
[0065] 在W该图示方式公开的用于本发明的方法的化合物的情况下，Ξ官能部分A1通常 是TEG结合的疏水部分的甘油（参见图6 A)。此外，同样公开用丝氨醇或6-[(2-径乙基）氨 基]-1-己醇替代甘油作为Ξ官能部分的实施方案。此类Ξ官能部分的其他替换方案是技术 人员可得的。
[0066] Ξ官能部分A1对于图6A的化合物是丝氨醇，其中疏水部分直接结合Ξ官能部分 Alo
[0067] W甚至更图示的方式，可W将"胆酱醇基-TEG-胆酱醇基-TEG-(间隔基C18)7- Fluos-生物素-TE护描述为结构巧'-XXYYYYYYYFZ-3'"，其中Υ=为阳G+间隔基部分，X为经Ξ 官能接头结合亲水部分的疏水部分，F为巧光标签巧光素，且Ζ为连接基团（生物素）。5 '和3 ' 表示如实施例中所示类似于核巧酸通过自动合成的合成方向。
[006引类似地，-PEG2000-理解为阳G2000部分；即，由45个C2化化亚单位组成的聚乙二醇 (阳G)链。
[0069]在实验部分中描述的用于本发明的方法的化合物中，L1存在(η=1)且为憐酸醋，如 果没有另外明确说明的话。
[0070] 在实施例中用于本发明的方法的具体公开的化合物的背景中的"间隔基"应理解 为包括憐酸醋(phosphate)部分的PEG部分。PEG部分的长度通过例如C9或C12来确定，其分 别表示PEG部分具有9或12个原子的长度。
[0071] "dr应理解为胸巧，如图6B中示例的）。该部分dT可用于通过吸收确定化合物的浓 度且根据本发明是双官能部分。
[0072] 具体地，发现胆固醇双接头分子、肉豆違酸双接头或Ξ接头分子W及硬脂酸双接 头分子适合于实现使用白细胞和不同的培养细胞系的定量细胞固定。此外，相比于单一双 接头分子，胆固醇双接头和肉豆違酸双接头分子的组合显示一些细胞类型的固定速率的略 微增加。
[0073] 还已显示包含胆固醇部分和肉豆違酸部分两者的不对称双接头也显示定量的细 胞固定。
[0074] 此外，包含2个或3个共价结合亲水结构域的疏水分子的可用于本发明的方法的化 合物展示细胞的紧密结合，潜在地利用合作结合效应。此类分子与细胞的结合相比于使用 仅含有一个疏水分子的化合物的结合或固定强100-1000倍。
[0075] 此外，在一个实施方案中优选两个或Ξ个疏水分子通过使用接头部分L1空间上分 开。运对于细胞的定量固定尤其有用。利用合适的接头，获得定制的结合分子，其理想地适 合于用于固定来自血液的所有类型的稀有和常规细胞的本发明的方法。
[0076] 在此类优选的实施方案中，n=l，且因此存在L1。
[0077] 可用于本发明的方法的化合物的亲水结构域包含阳G部分且因此是柔性的。
[0078] 可用于本发明的方法的化合物的末端疏水部分随后为长的柔性亲水结构域。
[0079] 该亲水结构域允许对于细胞的安全埋入所需的绕目标细胞的柔性折叠，从而产生 细胞友好的、水凝胶样的环境，运对于保持细胞形态和功能有效是重要的。
[0080] 可W使用不同的直链PEG部分，其在长度和/或包含间隔基部分如PEG部分之间的 憐酸醋中有所不同W实现柔性亲水结构域。例如，可W使用如上所述的由45个C2也化亚单位 组成的聚乙二醇(PEG)链(PEG2000K参见实施例6B)或具有憐酸醋间隔基如-(间隔基C18) 7-的PEG部分。
[0081] 合适的保护基是本领域已知的。用于亚憐酷胺化学的合适的保护基是例如(4,4'- 二甲氧基Ξ苯甲基(DMT)和巧甲氧基幾基(Fmoc)。特别优选的保护基是DMT(4,4'-二甲氧基 Ξ苯甲基）。
[0082] 可用于本发明的方法的化合物的各种盐可W使用，如可用于本发明方法的化合物 的Na+和/或TEA+盐，如图1中所示。
[0083] 其他盐也是可W的且是技术人员已知的。优选地，使用不影响或不实质上影响细 胞活力或功能的盐。
[0084] 在本发明的优选的实施方案中，式(I)中的部分Z具有W下结构： -(L3 ) n2_ [ O-CH2-CH2 ] y- ( SP ) nl ] m- [ O-CH2-CH2 ] y：L-化3 ) n2_， 其中 SP是间隔基部分， 每一间隔基部分SP彼此独立地选择， 每一η 1为0或1，对于每一 m部分独立选择， 每一 n2为ο或1，彼此独立选择， m为1-100的整数，优选1-50，更优选4-30， y为1-100的整数，优选1-50，更优选4-30， yl为0-30的整数，优选0-10，更优选0-4， 条件是y*m +yl < 100 且其中L3如上文定义。
[0085] 在本发明的进一步优选的实施方案中，nl对于m个部分-[0-C此-C此]y-(SP)ni]-是 相同的。
[0086] 如从实例中可见，nl在可用于本发明的方法的化合物中通常要么总是0,要么在可 用于本发明的方法的化合物中总是1。
[0087] 其中nl=l的一个示例性的化合物为胆酱醇基-TEG-间隔基C12-胆酱醇基-TEG-(间 隔基 C18)7-Fluos-生物素-TEG。
[008引其中nl=0的一个示例性的化合物为胆酱醇基-TEG-胆酱醇基-TEG-PEG2000- Fluos-生物素-TEG。
[0089] 在本发明的进一步优选的实施方案中，yl为0。
[0090] 其中yl=〇的一个示例性的化合物为胆酱醇基-TEG-间隔基C12-胆酱醇基-TEG-(间 隔基 C18)7-Fluos-生物素-TEG。
[0091] 在本发明的进一步的实施方案中，yl为1。
[0092] 其中y 1 = 1的一个示例性的化合物为5' -胆酱醇基TEG-胆酱醇基TEG-(间隔基C18) 7-间隔基C3-dT-生物素 TEG-3'。
[0093] 在本发明的进一步优选的实施方案中，y为3、4、5或6,且nl为1。甚至更优选地，m为 3、4、5、6、7、8、9或10。
[0094] 在本发明的进一步优选的实施方案中，间隔基部分SP彼此独立地选自憐酸醋和双 官能部分。
[00M]优选所有间隔基部分SP是相同的。甚至更优选地，所有部分SP均是憐酸醋。
[0096] 根据本发明的双官能部分应理解为在合成用于本发明的方法的化合物之前包含 两个官能团的部分。合适的双官能部分因此适合于合成直链化合物。合适的双官能基团优 选地选自憐酸醋基团、氨基甲酸醋基团、酷胺基，包含核碱基的部分、甚至更优选肌，和具有 1-10个C原子(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个原子)的直链烷基，且所述烷基链包含在末 端C原子处的官能团，尤其是独立地选自胺、幾基、径基、琉基、碳酸基团。具有末端官能团的 合适的直链烷基的实例为二氨基烷基部分诸如出N-(C出)5-N此或径基-幾基部分诸如-C (0)-(CH2)4-0-。
[0097] 根据本发明的Ξ官能部分应理解为在合成用于本发明的方法的化合物之前包含 Ξ个官能团的部分。此类合适的Ξ官能部分因此适合于合成支链化合物。合适的Ξ官能部 分优选选自具有1-10个C原子(具体为l、2、3、4、5、6、7、8、9或10个C原子)且包含至少一个- 0H、-細和/或至少一个-NH2基团的Ξ官能部分，更优选地选自氨基酸，诸如赖氨酸或丝氨 酸、丝氨醇、-0-C肥-CH( (C出)4-畑2) -C肥-、甘油和1，3二氨基甘油部分。
[0098] 在本发明进一步优选的实施方案中，XI和/或X2,优选XI或X2被疏水结合域替代。 其中XI被疏水结构域替代的一个示例性化合物为生物素-PEG-Lys-(C18)2,如实施例中所 /J、- ο
[0099] 在本发明的进一步优选的实施方案中，n2均为0。在此类实施方案中，中屯、的直链 PEG 部分直接结合部分 Xl-[Al-(Ll)n]kl 和[A2-化 I)n]k2-X2。
[0100] 在本发明进一步优选的实施方案中，一个或两个n2=l，且L3为具有1-10个C原子的 烷基，其任选包含酷胺基、幾基、氨基甲酸醋、和/或NH基团。在本发明进一步优选的实施方 案中，L3为具有1-10个C原子的烷基，其任选包含酷胺基、幾基、氨基甲酸醋、和/或NH基团。 例如，一个L3可W为-NH-C此-C此NHC0-C此-C此-，如本发明的化合物生物素-PEG2000-Lys- (C18)2 中。
[0101 ]在本发明的进一步优选的实施方案中，直链脂质为 (a) 饱和或不饱和脂肪酸，和/或 (b) 具有8-26个C原子的脂肪酸，优选12-22个C原子，更优选14-18个C原子。
[0102] 脂肪酸是具有长的脂族尾(链)的簇酸，其是饱和的或不饱和的。大部分天然存在 的脂肪酸具有偶数个碳原子(4-28个)的链。
[0103] 饱和脂肪酸的实例为辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆違酸、栋桐酸、硬脂酸、花生四締酸、 二十二酸、木蜡酸和蜡酸。
[0104] 合适的不饱和脂肪酸的实例为：
[0105] 在甚至更优选的实施方案中，直链脂质选自油酸、肉豆違酸、硬脂酸和二十二酸， 更优选地选自肉豆違酸和油酸。
[0106] 在进一步优选的实施方案中，类固醇可用作疏水部分。
[0107] 类固醇是一类包含彼此连接的四个环烧环的特征性排列的有机化合物。类固醇的 核屯、由键合在一起的十屯个碳原子构成，所述十屯个碳原子采用四个稠合环的形式:Ξ个 环己烧环(命名为环A、B和C)和一个环戊烧环(D环）。类固醇由结合至该四环核屯、的官能团 和由环的氧化状态而不同。固醇是类固醇的具体形式，具有在位置3的径基和衍生自胆酱烧 的骨架。
[0108] 在本发明的进一步优选的实施方案中， (a) 所述类固醇为固醇，或 (b) 类固醇选自胆固醇;类固醇激素，优选性腺类固醇，更优选雄激素，诸如促蛋白合成 类固醇、雄酱締二酬、脱氨表雄酬、双氨睾酬、或睾酬，雌激素，诸如雌二醇、雌Ξ醇、或雌酬； 孕激素，诸如孕酬或妊娠素(progestine)、皮质类固醇，特别是糖皮质激素或盐皮质激素； 蚁化类固醇诸如蚁皮酱酬;植物酱醇;油菜素类固醇;蕾烧类化opanoid);和麦角固醇， 更优选地类固醇为胆固醇，或 (C)疏水维生素为α-生育酪。
[0109] 在本发明进一步优选的实施方案中，一个、两个、Ξ个或四个，优选一个、两个或Ξ 个疏水结构域共价结合亲水结构域。
[0110] 在本发明进一步优选的实施方案中，共价结合亲水结合构的两个或多个疏水结构 域是不同的或相同的。
[0111] 在本发明进一步优选的实施方案中，疏水结构域由直链脂质、类固醇或疏水维生 素组成。
[0112] 在本发明进一步优选的实施方案中，疏水结构域包含W下（优选由W下组成）：直 链脂质、类固醇或经接头部分L2共价结合Ξ官能部分Α1的疏水维生素。
[0113] 此类双功能和Ξ功能部分成功地使用于用于本发明的方法的化合物中用于直接 或经接头L2结合疏水部分。
[0114] 接头L2独立地为适合于将疏水部分共价结合亲水部分的任何接头部分，且所述接 头分别在疏水部分和Α1或Α2之间具有50、30或20个或更少的原子的长度。
[0115] 在一个优选的实施方案中，接头L2包含W下，优选由W下组成:憐酸醋基团，部分- [0-C此-C此]y2-( SP)n]m广，其中SP和η如上定义，优选η=0，y2为1-30的整数，优选3-10，且ml 为1-10的整数，优选1-3,甘油部分，氨基甲酸醋基团，酷胺基，具有1-10个C原子(具体为1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10个原子)的直链烷基，且所述烷基链包含在末端C原子处的官能团，特 别是独立选自胺、幾基、径基、琉基、碳酸基团，所述烷基任选被1、2、3、4或5个部分R1所取 代，其中R1独立地为C1-C4烷基、Cl-C4^烷基、C1-C4氨基烷基、C1-C4氯基烷基、径基、琉基、 氨基或幾基部分。具有末端官能团的合适的直链烷基的实例为二氨基烷基部分诸如出N- (C出)5-N出或径基-幾基部分诸如-C(0)-(CH2)4-0-。优选地，直链烷基是未被取代的。甚至 更优选地，直链脂质、类固醇或疏水维生素经接头部分-(0-CH2-CH2) j-结合Ξ官能部分A1， 其中j选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10,优选j为3,特别是四乙二醇(TEG)、憐酸醋部分或包含 TEG、甘油、和憐酸醋部分的部分，或包含-TEG-甘油基-憐酸醋-0-(C出)4-C(0)-或由其组成 的部分。
[0116] 在本发明的方法的更优选的实施方案中，化合物包含经接头部分L2共价结合Ξ官 能部分A1的直链脂质、类固醇或疏水维生素，优选其中L2选自憐酸醋、酷胺、氨基甲酸醋、醋 基和部分 -[0-0l2-ai2]y2-(SP)nU-， 其中 SP和η如上文定义，优选地n=0， y2为1-30的整数，优选3-10,且 ml为1-10的整数，优选1-3， 更优选地，其中直链脂质、类固醇或疏水维生素经接头部分四乙二醇(TEG)或憐酸醋结 合Ξ官能部分A1。
[0117] 在本发明的进一步优选的实施方案中，kl为1、2、3、4或5,优选1、2、或3。
[0118] 在本发明特别优选的实施方案中，疏水结构域仅经Ξ官能部分A1或经上文描述的 结构域Xl-[Al-(Ll)n]ki共价结合所述亲水结构域。对于此类实施方案，还应用用于本发明 的方法的化合物的进一步优选的实施方案。在此类化合物中，疏水结构域唯一地位于分子 的一个末端部分，而其他基团如连接基团和任选标记部分位于另一末端部分，在空间上与 其分开。
[0119] 在本发明的进一步优选的实施方案中，k2为1、2、3、4、5或6,优选1、2、或3。
[0120] 在用于本发明的方法的化合物包含肌部分作为双官能部分A2的情况下，k2优选为 3、4、5或 6。
[0121] 在本发明另一优选的实施方案中，kl为0,且XI被疏水结构域所替代，所述疏水结 构域优选包含类固醇，更优选胆固醇。在特别优选的实施方案中，Z为部分-化3)n2 -TEG (L3)n2-，其中n2独立地为0或1。在本发明的甚至更优选的实施方案中，k2为1、2、3、4、5或6， 优选3、4、5、或6。甚至更优选地，一个或多个(特别是一个)进一步的疏水部分结合部分- [A2-化I)n]k2-X2,其中所述进一步的疏水部分包含类固醇，更优选胆固醇。甚至更优选地， L2为接头部分四乙二醇(TEG)、憐酸醋或包含TEG、甘油和憐酸醋部分的部分、或包含-TEG- 甘油基-憐酸醋-0-(CH2)4-C(0)-或由其组成的部分。本发明的方法中使用的一个示例性的 化合物为图12中所示的Cho 1 -TEG-Cho 1-TEG-双倍物(Doub 1 er)-生物素-肌。
[0122] 在用于本发明的方法的化合物包含肌部分作为双官能部分A2的情况下，k2优选为 3、4、5或 6。
[0123] 在本发明的方法的进一步优选的实施方案中，步骤a)的化合物进一步包含标记部 分。因此，在本发明进一步优选的实施方案中，化合物进一步包含标记部分和连接基团。
[0124] 此类化合物特别适合于其中需要实现细胞的固定和检测两者例如用于固定细胞 的定位和或用于细胞定量的本发明的方法。此类化合物的一个实例为5'-(胆酱醇基-TEG) 2-PEG2000-F1UOS-生物素_TEG-3'，其成功地用于本发明的方法中W固定细胞至链霉抗生 物素包被的板并检测运些细胞。
[0125] 合适的标记部分是适合于体外检测的部分且是技术人员已知的。检测可W是直接 的（如在发光的情况下，尤其是巧光)或间接的（在酶或其底物的情况下）。因此，适合于间接 或间接检测的标记部分可W使用。
[0126] 如本文所用的"标记"或"标记部分"指能够产生信号用于直接或间接检测的任何 物质。因此标记部分可W直接或间接检测。对于直接检测，适合用于本发明的标记部分可W 选自任何已知的可检测的标记物组，如色原、化学发光基团（例如叮晚醋或二氧杂环下烧 (dioxetanes))、电化学发光化合物、染料或巧光染料(例如巧光素、香豆素、罗丹明、嗯嗦、 试面灵、花青及其衍生物）、发光金属络合物，诸如钉或館络合物和放射性同位素。
[0127] 在间接检测系统中，生物亲和(bioaffine)结合对的第一配偶体为用于本发明的 方法的化合物的标记部分；即第一配偶体共价结合用于本发明的方法的化合物的部分。合 适的结合对的实例为半抗原或抗原/抗体、生物素或生物素类似物诸如氨基生物素 (aminobiotin)、亚氨基生物素或脱硫生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素、糖/凝集素、 核酸或核酸类似物/互补核酸、和受体/配体，例如类固醇激素受体/类固醇激素。优选的第 一结合对成员包含半抗原、抗原和激素。还优选半抗原如标签、地高辛和生物素及其类似 物。此类结合对的第二配偶体例如抗体、链霉抗生物素等通常进行标记W允许直接检测，例 如，通过如上所述的标记部分。
[01%]因此，在优选的实施方案中，标记部分是用于直接标记或用于间接标记的标记部 分。
[0129] 在一个优选的实施方案中，标记部分选自（a)选自W下的直接标记部分:色原、化 学发光基团（例如叮晚醋或二氧杂环下烧(dioxetane))、电化学发光化合物、染料、巧光染 料(例如巧光素、香豆素、罗丹明、嗯嗦、试面灵、花青及其衍生物）、发光金属络合物，诸如钉 或館络合物和放射性同位素；（b)或间接检测系统的配偶体之一，优选其中标记部分为选自 W下的结合对的成员之一：（i)半抗原或抗原/抗体，（ii)生物素或生物素类似物诸如氨基 生物素(aminobiotin)、亚氨基生物素或脱硫生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素，（iii) 糖/凝集素，（iv)核酸或核酸类似物/互补核酸，和(V)受体或受体片段/配体，例如类固醇激 素受体/类固醇激素。
[0130] 优选的作为适合于间接检测的标记部分的第一结合对成员包括半抗原、抗原和激 素。还优选半抗原如地高辛和生物素及其类似物。此类结合对的第二配偶体例如抗体、链霉 抗生物素等通常进行标记W允许直接检测，例如通过如上所述的直接标记部分;然而，还可 W利用用于本发明的方法的化合物中的抗体和使用经标记的抗原或半抗原用于检测。
[0131] 在结合对成员的W上描述中，术语抗体应理解为涵盖抗体及其抗原结合片段两 者。
[0132] 在优选的实施方案中，标记部分为用于直接标记的标记部分，甚至更优选地，标记 部分为巧光标记部分或染料。
[0133] 合适的巧光部分（或染料）是本领域已知的且包括巧光素、切3、切5、切5.5、切2、 切3.5、切3b、切7、Alexa Fluor染料、氧杂蔥衍生物诸如罗丹明、俄勒冈绿、曙红、或德克萨 斯红，花青衍生物诸如花青、吗I噪幾花青、氧杂幾花青、硫杂幾花青和部花青，糞衍生物诸如 丹横酷和氣娃酸钢衍生物，香豆素衍生物、嗯二挫衍生物，诸如化晚基嗯挫、硝基苯并嗯二 挫和苯并嗯二挫，巧衍生物诸如瀑布蓝(cascade blue),嗯嗦衍生物诸如尼罗红、尼罗蓝、 甲酪紫、嗯嗦170，叮晚衍生物，诸如原黄素、叮晚澄、叮晚黄、芳基次甲基(arylmethine)衍 生物，诸如金胺、结晶紫、孔雀绿，四化咯衍生物诸如化吩、献菁和胆红素。
[0134] 在实例中，将巧光素用作代表性标记。运允许标记的灵敏检测，允许标记的定位 和/或定量。巧光标记是本发明尤其优选的标记部分。
[01巧]用于标记的合适的放射性的同位素(>曰(1；[0曰(31：；[￥6 1301：0口6 3)或放射性同位素 (radioisotopes)和用此类放射性标记标记用于本发明的方法的化合物的方法是技术人员 已知的。例如，可W使用W下同位素之一 :i4c、3H、32p、33p、i23i、i 25Kpi"i。
[0136]在抗体或抗原结合片段用作间接系统抗体/抗原或半抗原的成员的情况下，对表 位或半抗原特异性的抗体或抗原结合片段可W是用于本发明的方法的化合物的部分，或者 表位或半抗原可W是可用于本发明的方法的化合物的部分。因此，各其他成员可W例如用 用于随后检测的巧光标记直接标记。合适的抗体或抗原结合片段下文中更详细描述。
[0137] 在本发明优选的实施方案中，连接基团和任选标记结合部分[A2-化I)n]k2-X2。
[0138] 在本发明特别优选的实施方案中，疏水结构域仅经Ξ官能部分Al(或经上述的结 构域Xl-[Al-(Ll)n]ki)共价结合所述亲水结构域，并且连接基团和任选标记部分结合部分 [A2-(Ll)n]k2-X2。运保证插入细胞膜的疏水结构域和用于固定和任选标记的部分在空间上 分开。
[0139] 在本发明的更优选的实施方案中，化合物进一步包含标记部分，其中标记部分经 Ξ官能部分A2共价结合。例如，此类标记部分为巧光染料。
[0140] 此类化合物特别适合用于本发明的方法用于除固定外标记和检测。
[0141] 在本发明的另一优选的实施方案中，一个或多个部分A2为标记部分，更优选地，其 中部分A2为包含核碱基的部分，甚至更优选地，其中部分A2为肌，如在实施例中所述的某些 化合物的情况。
[0142] 在本发明的另一优选的实施方案中，化合物进一步包含标记部分，其中标记部分 经Ξ官能部分A2共价结合。例如，此类标记部分为巧光染料，和一个或多个部分A2为标记部 分，更优选地，其中部分A2为包含核碱基的部分，甚至更优选地，其中部分A2为肌。
[0143] 包含dT的此类化合物用于实施例中化合物的浓度测定。
[0144] 在此类实施方案中，在本发明的方法中待使用的化合物可W包含巧光素和dT部 分。
[0145] 在进一步优选的实施方案中，连接基团经Ξ官能部分A2共价结合，例如连接基团 为生物素。
[0146] 在甚至更优选的实施方案中，连接基团经Ξ官能部分A2共价结合，并且标记部分 经Ξ官能部分A2共价结合。
[0147] 在本发明进一步特别优选的实施方案中，疏水结构域仅经Ξ官能部分AU或经上 述的结构域Xl-[Al-(Ll)n]ki)共价结合所述亲水结构域，并且连接基团和标记部分结合部 分[A2-化 I)n]k2-X2。
[0148] 此类化合物进一步允许固定和标记、检测和定量两者。
[0149] 在本发明仍进一步特别优选的实施方案中，疏水结构域仅经Ξ官能部分A1(或经 上述的结构域Xl-[Al-(Ll)n]ki)共价结合所述亲水结构域，并且连接基团而非标记部分结 合部分[A2-化 I)n]k2-X2。
[0150] 如果旨在仅固定结合的细胞，可W使用此类化合物。
[0151] 在本发明甚至更优选的实施方案中，本发明的方法中使用的化合物包含标记部分 和连接基团，其中所述标记部分是巧光标记和所述连接基团是生物素。
[0152] 在本发明另一个优选的实施方案中，化合物不进一步包含标记部分。示例性化合 物为5' -胆酱醇基TEG-胆酱醇基TEG-PEG2000-生物素 TEG-3。
[0153] 在本发明的进一步优选的实施方案中，接头L1独立地选自憐酸醋(phosphate)、酷 胺、氨基甲酸醋和醋基。
[0154] 在本发明进一步优选的实施方案中，部分A1和A2独立地选自选自W下的双官能基 团:憐酸醋基团、氨基甲酸醋基团、酷胺基团、包含核碱基的部分(甚至更优选肌）、和具有1- 10个C原子的直链烷基(且所述烷基链包含在末端C原子处的官能团，尤其独立的选自胺、幾 基、径基、琉基、碳酸基团）、和Ξ官能部分，所述Ξ官能部分具有1-10个C原子且包含至少一 个-〇H、-SH和/或至少一个-N化基团，优选地选自赖氨酸、丝氨酸、丝氨醇、-0-CH2-CH ((C出)4-N出)-C出-、甘油、和1，3二氨基甘油部分。
[0155] 在本发明的进一步更优选的实施方案中，接头L2独立地选自憐酸醋(phosphate)、 酷胺、氨基甲酸醋、醋基和部分 -[0-C出-C出]y2-( SP ) η]ml-, 其中 SP和η如上文定义，优选地n=0， y2为1-30的整数，优选3-10,且 ml为1-10的整数，优选1-3， 显示基于PEG的接头即TEG接头可用于本发明的方法中可用的示例性化合物中。示例性 的化合物为5'-胆酱醇基TEG-胆酱醇基TEG-(间隔基C18)7-Fluos-生物素 TEG-3'。
[0156] 可用于本发明的方法的化合物W及其中间体可通过技术人员已知的方法来制备。 可用于本发明的方法的化合物的示例性合成显示于图6C中。此外，用于本发明的方法中可 用的化合物合成中的中间体显示于图12。此外，化合物的合成的一般概念简短地描述于实 施例1中。化合物可W类似于核巧酸的基于亚憐酷胺的合成在固相上制备。化合物可W通过 如实施例中所述在固体支持物如CPG上合成来进行合成。具体而言，化合物可W通过在技术 人员已知的条件下随后的偶联步骤和从固体支持物(在实例中：CPG(可控孔度玻璃））上切 割来合成。其他固体支持物诸如大孔聚苯乙締也可W用于合成。合成可W通过保留保护基 或通过切割保护基来进行。具体而言，化合物可有DMT(DMT on)或无 DMT(DMT off)方式 合成，将DMT分子留在称为3 '端的分子末端，或通过切去DMT基团。化合物任选进一步通过例 如透析来纯化。
[0157] 生物素-PEG-Lys-(C18)2的合成详细描述于图6C)中。
[0158] 可用于本发明的方法的其他化合物可根据本领域已知的方法的类似方式来 制备。
[0159] 如上所解释，本发明的方法中采用的化合物可W在步骤b)中作为组合物例如作为 水溶液进行接触。
[0160] 在一个优选的实施方案中，包含上述的多于一种的化合物的组合物可W使用。
[0161] 在更优选的实施方案中，化合物或其盐在包含上述的一种或多种化合物的组合物 中。
[0162] 因此，在一个实施方案中，本发明设及在表面上固定细胞的方法，所述方法包括 a) 提供组合物，所述组合物包含含有连接至一个亲水结构域的一个或多个疏水结构域 的化合物或其盐，优选由连接至一个亲水结构域的一个或多个疏水结构域组成的化合物或 其盐， 其中所述一个或多个疏水结构域共价结合所述亲水结构域，且 其中所述一个或多个疏水结构域各自包含直链脂质、类固醇或疏水维生素，且其中所 述亲水结构域包含聚乙二醇(PEG)部分，且 其中所述化合物包含连接基团； b) 在允许化合物与细胞膜相互作用的条件下使细胞与包含所述化合物的组合物接触， 从而在细胞表面上固定连接基团；和 C)将细胞上固定的连接基团与能够结合功能结构域的表面接触，从而在表面上固定所 述细胞。
[0163] 在甚至更优选的实施方案中，组合物包含上述的至少Ξ种不同的化合物，且其中 (i)所述不同的化合物至少在其疏水结构域处不同和 (i i )所述不同的化合物包含标记部分。
[0164] 在甚至更优选的实施方案中，组合物包含至少四种、五种、六种、屯种、八种、九种 或十种不同的化合物。
[0165] 本发明进一步设及组合物，所述组合物包含可用于本发明的方法中的结合至少一 个细胞优选活细胞的至少一种化合物。此类组合物分别可用于固定且任选检测细胞。
[0166] 在一个优选的实施方案中，此类组合物进一步包含固体支持物，可用于本发明的 方法的至少一种化合物经连接基团结合所述固体支持物。在此类实施方案中，将至少一个 细胞经可用于本发明的方法的化合物固定到固体支持物上。在化合物进一步包含标记部分 的情况下，定位、检测和定量细胞是可W的。
[0167] 在另一优选的实施方案中，包含结合至少一个细胞的可用于本发明的方法的至少 一种化合物的组合物包含水性缓冲溶液，其中可用于本发明的方法的至少一种化合物所结 合的至少一个细胞是悬浮的。此类组合物适合于充分地稳定其中的细胞，例如在FACS或离 屯、过程中，例如在固定步骤前，或在固定步骤后和随后的脱离。
[0168] 可用于本发明的方法的化合物适合于结合任何包含脂双层的细胞。优选地，细胞 是真核细胞，更优选为动物细胞，甚至更优选脊椎动物细胞，最优选人细胞。
[0169] 在优选的实施方案中，细胞为悬浮细胞和/或其中细胞为动物或人细胞，特别是脊 椎动物细胞，尤其是哺乳动物细胞。甚至更优选地，细胞为悬浮细胞且为动物或人细胞，特 别是脊椎动物细胞，尤其是哺乳动物细胞。
[0170] 例如，细胞是白细胞、稀有细胞、肿瘤细胞或突变的细胞，更优选为脊椎动物或人 白细胞、稀有细胞、肿瘤细胞或突变的细胞。
[0171] 在进一步的实施方案中，本发明设及本发明的方法，其中使用包含可用于本发明 的方法的一种或多种化合物的组合物。
[0172] 可W显示包含可用于本发明的方法的两种或多种不同化合物的一些组合物特别 可用于不依赖细胞类型的固定和标记。
[0173] 因此，在另一实施方案中，本发明设及本发明的方法，其中使用包含至少Ξ种不同 的可用于本发明的方法的化合物的组合物，其中所述不同的化合物至少在其疏水结构域上 不同且其中所述不同的化合物包含标记部分。
[0174] 通过使用多种可用于本发明的方法的化合物(其中至少两种至少在其疏水结构域 上不同），可W获得结合所有细胞类型的组合物，从而提供不依赖于细胞类型的固定。
[0175] 在甚至更优选的实施方案中，组合物因此包含至少四种、五种、六种、屯种、八种、 九种或十种不同的可用于本发明的方法的化合物。在甚至更优选的实施方案中，此类组合 物的两种、Ξ种、四种、五种、六种、屯种、八种、九种、十种或所有化合物至少在其疏水结构 域上不同。
[0176] 合适的优选的疏水结构域是如上定义的那些。
[0177] 在更优选的实施方案中，至少一种化合物的疏水结构域包含W下，优选由W下组 成:饱和脂肪酸，尤其是肉豆違酸、硬脂酸或二十二酸，特别是肉豆違酸;和/或至少一种化 合物的疏水结构域包含W下，优选由W下组成:类固醇，特别是胆固醇、或疏水维生素，特别 是α-生育酪。
[0178] 在优选的实施方案中，本发明设及本发明的方法，其中使用包含可用于本发明的 方法的一种或多种化合物的水溶液。
[0179] 可用于本发明的方法的水溶液优选是缓冲的。例如，溶液可W是憐酸缓冲盐溶液 (PBS)、Tirs、和/或Hepes缓冲溶液。
[0180] 用于本发明的方法的溶液的pH优选约5.5-8.5，更优选6.5-7.5。
[0181] 在仍进一步的实施方案中，本发明设及包含至少一种如上公开的化合物或组合物 的试剂盒用于固定细胞的用途。
[0182] 试剂盒可W进一步包含分开储存的（例如在容器或注射器中）本发明的方法使用 的两种或多种化合物。它们可干燥形式例如冻干的或干燥的、或作为溶液、或W冷冻形 式，例如作为冷冻溶液储存。
[0183] 在一个实施方案中，本发明的方法可用于固定，和任选检测和/或表征稀有细胞， 优选用于一个稀有细胞表征。
[0184] 因此，在另一个实施方案中，本发明设及在表面上固定包含目标细胞的细胞群的 方法，所述方法包括 a) 提供包含连接至一个亲水结构域的一个或多个疏水结构域的化合物或其盐，优选由 连接至一个亲水结构域的一个或多个疏水结构域组成的化合物或其盐， 其中所述一个或多个疏水结构域共价结合所述亲水结构域，且 其中所述一个或多个疏水结构域各自包含直链脂质、类固醇或疏水维生素，且其中所 述亲水结构域包含聚乙二醇(PEG)部分，且 其中所述化合物包含连接基团； b) 在允许化合物与细胞膜相互作用的条件下使细胞群与化合物接触，从而在细胞表面 上固定连接基团； C)将细胞上固定的连接基团与能够结合所述连接基团的表面接触，从而在表面上固定 所述细胞;和 d)任选检测固定在表面上的目标细胞。
[0185] 细胞群为包含至少两个细胞的组合物，其包含或怀疑包含至少两种不同细胞。此 类不同细胞可W分别为例如T细胞和B细胞，不同的T细胞亚群，或肿瘤细胞和非肿瘤细胞， 或内皮细胞和上皮细胞。
[0186] 根据本发明的"细胞膜"应理解为细胞质膜。
[0187] 对于本发明的运一方法，如同上述的本发明的在表面上固定细胞的方法，应用相 同的实施方案。因此，包含合适化合物的组合物也可W如上述采用。
[0188] 在特别优选的实施方案中，目标细胞是白细胞，特别是稀有细胞诸如循环肿瘤细 胞、内皮细胞或上皮细胞。
[0189] 甚至更优选地，细胞为悬浮细胞和/或细胞为动物或人细胞，特别是脊椎动物细 胞，尤其是哺乳动物细胞。
[0190] 固定在表面上的目标细胞的检测可W通过使用对于此类目标细胞的特定检测剂 来进行，例如识别一种特定细胞表面标记物的一种抗体或其抗原结合片段、或识别多种特 定细胞表面标记物的多种抗体或其抗原结合片段，作为例如用于检测特定T细胞亚群，或识 别特定肿瘤标记物用于检测特定肿瘤细胞类型。如上所述，且如技术人员已知，此类检测剂 如抗体或其抗原结合片段可随后直接或间接检测。在直接检测的情况下，检测剂本身用直 接可检测的标记诸如巧光染料进行标记。可选地，可W使用间接可检测标记，例如二级抗体 可W用标记部分诸如巧光部分来检测。巧光可W随后进行检测。
[0191] 用于检测目标细胞的可检测标记优选不同于本发明的步骤a)和b)中使用的化合 物的标记部分，W允许目标细胞的特定检测。在使用巧光染料的情况下，各染料优选展示不 同的激发和/或发射光谱。
[0192] 在固定目标细胞的此类实施方案中，例如从全血分离的有核细胞可W通过进行本 发明的方法而固定在确定的支持物或表面上，特别是在阵列上，更优选微阵列或纳米阵列。 有核细胞的该群体中例如在白细胞(WBC)例如循环肿瘤细胞、内皮细胞或上皮细胞群体中 的稀有细胞可W经针对对该稀有细胞群体特异性的抗原或生物化学特性的抗体或特异性 结合分子而定量地结合该表面或支持物并鉴定。运能够准确定位和再定位用于进一步的表 征步骤(如需要的话）。
[0193] 因此，在本发明的优选的实施方案中，进行检测固定在表面上的目标细胞的步骤 d)〇
[0194] 在本发明的进一步的实施方案中，采用可用于本发明的方法的进一步包含标记部 分的化合物。运允许照此检测细胞群，并允许获得关于目标细胞相比于细胞群的信息。 [01M]因此，本发明还设及本发明的方法用于一个稀有细胞表征的用途。
[0196] 因此，在本发明的进一步的实施方案中，一个稀有细胞表征如进一步步骤e)例如 通过检测细胞表面标记物来进行。
[0197] 在进一步的实施方案中，本发明的方法可用于固定悬浮细胞，尤其用于筛选目的 如用于抗体筛选。例如，表面上呈递抗体或抗原结合片段的固定的细胞可W通过本领域已 知的方法对于结合抗原进行筛选。
[0198] 抗体或其抗原结合片段对培养细胞系的筛选是抗体开发中的一般应用。一种应用 包括抗体结合细胞表面上的特异性受体分子。使用二级抗体(夹屯、效应），可W研究一级抗 体的结合特征。使用悬浮细胞难于进行此类实验。本发明的方法允许悬浮细胞的小屯、固定， 而不丧失任何生理细胞特性并且可W因此用于进行此类筛选测定。
[0199] 此外，使用本发明的方法可W将悬浮细胞固定用于功能细胞测定。体外或体内研 究细胞功能的测定是重要的：功能细胞测定通常用于药物、农药和生物技术研究和开发中 W研究小分子化合物或生物制剂或W高通量筛选鉴定小分子的类别。一些功能测定基于表 面依赖性测定并因此一般用贴壁细胞进行。本发明的方法可W作为随后步骤进行用于固定 悬浮细胞W应用此类功能测定。
[0200] 因此，在本发明的进一步的实施方案中，方法进一步包括筛选固定的细胞的步骤 e )，例如固定的细胞的抗体筛选。
[0201] 在本发明的仍进一步的实施方案中，方法进一步包括用固定的细胞进行功能细胞 测定的步骤e)。
[0202] 因此，本发明还设及本发明的方法用于固定悬浮细胞、优选用于筛选、甚至更优选 用于用抗体或结合抗原的抗体片段或其他形式的结合分子筛选的用途。
[0203] 因此，本发明还设及本发明的方法用于进行功能细胞测定的用途。
[0204] 在一个优选的实施方案中，本发明的方法为体外方法。
[0205] 此外，本发明的方法可W随后为细胞脱离的后续步骤。例如，本发明的方法可W进 行用于固定活细胞至固体支持物或表面，随后为从支持物或表面脱离和植入小鼠模型。运 些类型的功能测定例如对于研究循环异常细胞的肿瘤诱导潜力是格外重要的。
[0206] 在该实施方案中，脱离可W在本发明的步骤C):将固定在细胞上的连接基团与能 够结合连接基团的表面接触，由此固定表面上的细胞之后;或在本发明的步骤d):检测固定 在表面上的目标细胞之后，优选在本发明的步骤d):检测固定在表面上的目标细胞之后进 行。
[0207] 在进一步优选的实施方案中，在细胞脱离前进行筛选步骤和/或稀有细胞表征步 骤和/或功能细胞测定步骤。
[0208] 因此，在本发明的进一步的实施方案中，方法进一步包括设及经固定的细胞的随 后脱离的步骤。
[0209] 本发明的方法可W作为忍片上的实验室(a lab on a chip)进行:为了研究少数 细胞如2-50个细胞或单个细胞的细胞形态或细胞功能，支持物或表面可W选择地或系统地 用可用于本发明的方法的化合物点样（spotted)。运种点样允许少数细胞或单个细胞在此 类斑点上的祀向固定。运允许在支持物或表面(忍片)上直接分子分析。
[0210] 因此，在一个实施方案中，本发明的2、3、4或更多种方法并行进行，特别是在固体 基底如忍片上。忍片可W是阵列，尤其是微阵列或纳米阵列。例如，并行进行50、1000或 10000种固定方法。
[021。 此类固体基底可W是颗粒如纳米颗粒，特别是磁性纳米颗粒、柱、或平的基底、阵 列或孔板，特别是少孔板(oligo-well plate)或多孔板。在一个优选的实施方案中，阵列是 微阵列或纳米阵列。
[0212] 本发明的方法中使用的化合物还可用于细胞稳定，例如在代表剪切应力的条件 中。
[0213] 因此，本发明还设及本发明的方法在本发明的方法的步骤a)之前在固定过程中或 在培养过程中用于稳定至少一个细胞的用途。
[0214] 可用于本发明的方法的化合物此外可用于生物技术例如在大规模动物细胞培养 中的细胞稳定：已公开哺乳动物细胞的剪切敏感性可能是使大规模动物细胞培养的开发变 得复杂的一个相关问题。化合物减少运些问题。
[0215] 可用于本发明的方法的化合物此外可用于在流式细胞术和/或巧光激活细胞分选 术中的细胞稳定： 流式细胞术是非常常用的分离特定细胞群的方法。在该方法中，取决于流速将细胞暴 露于高剪切应力下。可用于本发明的方法的化合物减少运一剪切应力。
[0216] 可用于本发明的方法的化合物此外可用于在基于珠粒的细胞分离方法中的细胞 稳定： 具有不同的表型的细胞群可W通过偶联至磁珠的特异性抗体来分离。在该方法中，取 决于珠粒大小将细胞暴露于高剪切应力下。可用于本发明的方法的化合物减少运一剪切应 力。
[0217] 关于抗体和结合抗原的抗体片段，技术人员知晓此类分子:天然存在的抗体是球 形血浆蛋白（~150 kDa 化t1:p://en.Wikipedia.org/wiki/Dalton_unit))，其也称为免疫 球蛋白，所述免疫球蛋白具有基本结构。由于它们具有添加至氨基酸残基的糖链，因此它们 是糖蛋白。每一抗体的基本功能单元是免疫球蛋白（Ig)单体(包含仅一个Ig单元）；分泌的 抗体还可W如IgA是用两个Ig单元二聚化的，如硬骨鱼IgM用四个Ig单元四聚化的，或如哺 乳动物IgM用五个Ig单元五聚化的。在本发明中，合适形式的实例包括天然存在抗体的形 式，所述天然存在抗体的形式包括已知为IgA、I曲、I巧、IgG和IgM的抗体同种型。
[0218] 除了天然存在抗体外，还已开发了包括抗体片段的人工抗体形式。其中一些描述 于下文。
[0219] 尽管所有抗体的一般结构非常类似，但给定抗体的独特特性由可变(V)区所决定， 如上文详述。更具体而言，可变环(Ξ个各自位于轻(VL)链和Ξ个位于重(VH)链上）负责结 合抗原，即负责其抗原特异性。运些环称为互补性决定区域(CDR)。由于来自VH和化结构域 两者的CDR形成了抗原结合位点，因此正是重链和轻链的组合而非单独任一者决定了最终 的抗原特异性。
[0220] 因此，如本文所用的术语"抗体"意指任何运样的多肤，其具有与天然存在抗体的 结构相似性并且能够特异性结合各个祀点，其中结合特异性由CDR决定。因此，"抗体"旨在 设及结合各个祀点的免疫球蛋白衍生的结构，包括但不限于全长或完整抗体、抗原结合片 段(衍生自（物理上或概念上)抗体结构的片段）、任何前者的衍生物、嵌合分子、任何前者与 另一多肤的融合物、或选择性结合各个祀点的任何可选的结构/组成。抗体或其功能活性部 分可W是包含至少一个抗原结合片段的任何多肤。抗原结合片段由至少重链的可变域和轻 链的可变域组成，W两个结构域同时能够结合特定抗原的方式排列。
[0221] "全长"或"完全"抗体指包含由二硫键相互连接的两个重(H)和两个轻化)链的蛋 白，其包含：（1)在重链方面，可变区和包含Ξ个结构域CH1、CH2和CH3的重链恒定区；和（2) 在轻链方面，轻链可变区和包含一个结构域化的轻链恒定区。
[0222] "结合抗原的抗体片段"或"其抗原结合片段"也包含如上定义的至少一个抗原结 合片段，并展示与完全抗体实质上相同的功能和结合特异性，功能活性部分(或片段)衍生 自所述完全抗体。用木瓜蛋白酶的有限的蛋白水解消化切割Ig原型为Ξ个片段。两个相同 的氨基末端片段(各自包含一个完整L链和约半个Η链)为抗原结合片段(Fab)。第Ξ片段(其 大小类似但包含具有其链间二硫键的两个重链的簇基末端一半)为可结晶片段(Fc)"Fc包 含碳水化合物、补体结合位点和FcR结合位点。有限的胃蛋白酶消化产生包含Fab段和较链 区两者的单一 F(ab'）2片段，包括H-H链间二硫键。F(ab'）2对于抗原结合是二价的。F(ab'）2 的二硫键可W切割W获得Fab'。此外，重链和轻链的可变区可W融合在一起W形成单链可 变片段(scFv)。
[0223] 可变域(Fv)是具有由一个化和一个VH组成的完整的抗原结合结构域的最小片段。 此类片段，具有仅结合结构域，可W通过酶促方法或表达相关基因片段(例如在细菌和真核 细胞中）来产生。可W使用不同的方法，例如单独Fv片段或包含?'的上臂之一的'Fab'片 段，所述?'包括Fv加第一恒定域。运些片段通常通过在两个链之间引入多肤连接(其导致 产生单链Fv(scFv))来稳定。或者，可W使用二硫化物连接的Fv(dsFv)片段。片段的结合域 可W与任何恒定域组合W产生全长抗体或可W与其他蛋白和多肤融合。
[0224] 重组抗体片段是单链Fv(scFV)片段。scFv的离解导致单体scFV，其可W复合为二 聚体(双抗体）、Ξ聚体(Ξ抗体)或更大的聚集体诸如化ndAbs和Flexibodies。
[0225] 具有两个结合域的抗体可W经用简单多肤连接(scFv)2结合两个scFv或经两个单 体的二聚化(双抗体)来产生。最简单的设计是具有两个功能性抗原结合域的双抗体，所述 两个功能性抗原结合域可W是相同的、相似的（二价双抗体)或具有对不同抗原的特异性 (双特异性双抗体）。
[0226] 而且，包含重链的四个可变域和轻链的四个可变域的抗体形式已被开发。运些的 实例包括四价双特异性抗体（TandAbs和Flexibodies, Affimed Therapeutics AG, Heide化erg.Germany)。Flexibodies是scFv与双抗体多聚体基序的组合，导致具有对于连 接细胞表面上彼此非常远的两个分子的高度柔性的多价分子。如果存在多于两个功能抗原 结合域且如果它们对于不同抗原具有特异性，则抗体是多特异性的。
[0227] 概括地说，代表抗体或其抗原结合片段的特异性免疫球蛋白类型包括但不限于W 下抗体:化K具有可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(化)和恒定重链UCH1)结构域的 单价片段）、F(ab'）2(包含由二硫键或可选地在较链区连接的两个化b片段的二价片段）、Fv (化和VH结构域）、S cFv (单链Fv，其中化和VH通过接头例如肤接头连接）、双特异性抗体分子 (具有如本文所述的特异性且连接至具有与所述抗体不同的结合特异性的第二功能部分的 抗体分子，所述第二功能部分包括但不限于另一肤或蛋白诸如抗体或受体配体）、双特异性 单链Fv二聚体、双抗体、Ξ抗体、四抗体、微抗体(连接C册的S cFv )。
[0228] 抗体可W是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
[0229] 标签为生物技术中用于识别的肤基序。众所周知的标签为化S标签(6x组氨酸），其 可W结合Ni2+柱。
[0230] 在核酸或核酸类似物/互补核酸用作结合对的情况下，任何核酸序列及其互补序 列可W使用。
[0231] 凝集素为对糖部分高度特异性的碳水化合物结合蛋白。作为合适的凝集素，可W 使用伴刀豆球蛋白A，其结合a-D-甘露糖基和a-D-葡萄糖基残基、支化的α-甘露糖巧 (mannosidic)结构(高α-甘露糖类型、或杂合类型和二天线(biantenna巧)复合物类型Ν-聚 糖。
[0232] 作为受体/配体结合对，例如可W使用类固醇激素受体/类固醇激素。例如，可W使 用雌激素作为类固醇及其受体作为相应的结合配偶体。
[0233] 附图 图1:实施例6的实验中使用的板：链霉抗生物素处理的MTP (Microcoat)，12孔， NUNC, MC ID:604 176，批号：1665 C2。
[0234] 图2:显示实施例6的实验设计。4x测定。行A:引入20化1 PBS，分别向其加入Inmol 化合物，混合，解育约30111111，洗涂扯？85，引入80化1?85，加入300.000胖8(：(未处理的）。行 8:引入80化1口85，加入300.000胖8(：(未处理的）。行(：：11111中10^0~6胖8(：与10皿〇1本发明 的化合物解育lOmin，引入80化1 PBS/孔，分别300.000经处理的WBC。30min后用PBS洗涂第 一MTP板2x，覆盖册chst并解育 15 min。测量〉Cellavista (Operator s9巧）。90 min后测 量第二板。150 min后测量第二板。
[0235] 图3:显示30、90或120分钟解育后的实施例6的结果。
[0236] 图4:显示30、90或120分钟解育后的实施例6的结果作为图。
[0237] 图5:显示30、90或150分钟解育后的实施例6的板。
[0238] 图6:A:可用于本发明的方法的示例性化合物W及合成的副产物的化学结构。C:生 物素-PEG-Lys-(C18)2的合成W及副产物合成。
[0239] 图7:显示用A)具有内部参考号29.891180的包含胆酱醇基的化合物、B)具有内部 参考号29.891194的包含肉豆違酸的化合物染色细胞。〇染色104-18468。0)和6):用图示 说明的可用于本发明的方法的不同化合物染色细胞不同的暴露时间。根据实施例3的代表 性图片。
[0240] 图8:A)和B)显示根据实施例3用化rkat细胞的xCelligence实验的结果。B) : 1 :PBS +生物素接头；2:PBS+10% FCS+生物素接头；3:PBS+1% FCS+生物素接头;4:PBS无(w/o) 生物素接头；5:PBS+10% FCS无(w/o)生物素接头;6:PBS+1% FCS无(w/o)生物素接头； 7:PBS +生物素接头无(w/o) SA; 8:PBS无生物素接头无 SA。
[0241] 图9:显示根据实施例3用WBC细胞的xCelligence实验的结果。B):1:PBS+生物素 接头；2:PBS+10% FCS+生物素接头；3:PBS+1% FCS+生物素接头;4:PBS无(w/o)生物素 接头；5:PBS+10% FCS无(w/o)生物素接头;6:PBS+1% FCS无(w/o)生物素接头。
[0242] 图10:显示根据实施例3的固定细胞的染色。左栏:DA-MB468 -抗体:K5/8。中栏： MDA-MB468 -抗体:EpCAM Miltenyi 門TC。右栏:MDA-MB468 -抗体:EGFR。
[024引图11:显示根据实施例3的固定细胞的染色。左栏：MDA-MB468 -抗体：EpCAM Biolegend。中栏：MDA-MB468 -抗体：EpCAM Miltenys APC。右栏：WBCs-抗体：CD45 Biolegendo
[0244] 图12:显示可用于本发明的方法的进一步的化合物和参考化合物W及中间体的结 构。
[0245] 图13:显示离屯、和使用不同分子细胞固定后的WBC回收率。分子探针HH1749*、 皿1750*和皿1755* (*生物素-PEG-细胞溶解酶化ysin)-(C18)2)显示离屯、后关于回收率 的不同性能:分子浓度越高，离屯、后细胞回收率越高。离屯、特征:1〇 min, 300 X g。
[0246] 图14:显示离屯、和使用不同分子细胞固定后的WBC回收率。分子探针皿1749*、 皿1750*和皿1755*显示W不同浓度时关于细胞固定率的不同性能。接头浓度越高，细胞固 定率越高。
[0247] 图15:显示在不同时间点使用不同的可用于本发明的方法的化合物离屯、后的WBC 回收率。分子A和B (A:胆酱醇基-TEG-胆酱醇基-TEG-(间隔基C18)7-Fluos-生物素-TEG; B:生物素-PEG-细胞溶解酶-(C18)2)显示离屯、后关于回收率的不同性能。各左柱:无本发明 的化合物；各左数第二柱：0.35 nmol分子A;各左数第Ξ柱：100 nmol分子B;各右柱：0.5 nmol分子B。分子浓度越高，离屯、后细胞回收率越高。分子B能够在3.5小时内细胞固定。离屯、 特征:10 min, 300 X g。
[0248] 图16:显示不同实验者的离屯、后的WBC回收率。每个测定的各左、中和右柱代表不 同的实验者1、2和3。分子浓度越高，离屯、后细胞回收率越高。此外，细胞稳定独立于实验者。 离屯、特征：10 min, 300 X g。分子:胆酱醇基-TEG-胆酱醇基-TEG-(间隔基C18)7-Fluos-生 物素-TEG。
[0249] 图17:显示在不同时间点和离屯、设定时离屯、后的WBC回收率。测试W下分子：1234: 5'-(胆酱醇基-了66)2-间隔基(：18-(11'-生物素-了66-3'；1248:3'-(胆酱醇基-了66)2- 阳G2000-F1UOS-生物素-TEG-5' INV邸S; 1254:3'-(胆酱醇基-TEG)2-间隔基C18-F1UOS- 生物素-了66-5'1^邸5;1255:3'-(肉豆違酸）2斗662000-肌-生物素-了66-5'1曆635。所 有分子能够在2小时内细胞固定。在W300 X g离屯、20 min过程中PBS中的WBC受损伤。分子 1234显示最佳性能，随后为化合物1255和1254。离屯、特征:20 min, 300 X g。各左柱：与分 子10 min解育。各中柱:与分子1 h min解育。各右柱:与分子2小时解育。
[0250] 图18:显示在不同时间点和离屯、设定时离屯、后的WBC回收率。测试W下分子：1255: 3'-(肉豆違酸）2-PEG2000-dT-生物素-TEG-5' INVERS; 1234:5'-(胆酱醇基-TEG)2-间隔 基C18-dT-生物素-TEG-3' ； 1248:3'-(胆酱醇基-了66)2斗662000斗111〇3-生物素-了66-5' 1曆635;1254:3'-(胆酱醇基-了66)2-间隔基(：18斗111〇3-生物素-了66-5'1曆61?5。所有分子 能够在2小时内细胞固定。在W500 X g离屯、20 min过程中PBS中的WBC受损伤。分子1234显 示最佳性能，随后为分子1255和1254。离屯、特征:20 min, 500 X g。各左柱:与分子10 min 解育。各中柱:与分子1 h min解育。各右柱:与分子3小时解育。
[0251] 图19:显示在不同时间点和离屯、设定时离屯、后的WBC回收率。测试W下分子：1255: 3'-(肉豆違酸）2-PEG2000-dT-生物素-TEG-5' INVERS; 1234:5'-(胆酱醇基-TEG)2-间隔 基C18-dT-生物素-TEG-3' ； 1248:3'-(胆酱醇基-了66)2斗662000斗111〇3-生物素-了66-5' INVERS; 1254:3'-(胆酱醇基-TEG)2-间隔基C18-F1UOS-生物素-TEG-5' INVERS。所有分子 能够在2小时内细胞固定。W1000 X g离屯、20 min过程中PBS中的WBC受损伤。离屯、特征:20 min, 1000 X g。各左柱:与分子10 min解育。各中柱:与分子1 h min解育。各右柱:与分子2 小时解育。
[0252] 图20:显示在不同时间点离屯、后的化rkat细胞回收率。从左数各柱：1:与分子10 min解育。2:与分子1小时解育。3:与分子3.5小时解育。4:与分子5.5 h min解育。测试W下 分子：1255: 3 '-(肉豆違酸）2-PEG2000-dT-生物素 -TEG-5 ' INVERS。1234: 5 '-(胆酱醇基- TEG)2-间隔基C18-dT-生物素 -TEG-3' ； 1248:3(胆酱醇基-TEG)2-PEG2000-Fluos-生物 素 -TEG-5 ' INVERS ; 1254 : 3 ' -(胆酱醇基-TEG)2-间隔基C18-F1UOS-生物素 -TEG-5 ' INVERS。离屯、过程中在PBS中W及使用不同分子在5.5小时内化rkat培养细胞是稳定的。离 屯、特征:20 min, 500 X g。
[0253] 图21:显示Ξ官能接头部分不影响细胞活力。进行使用WST-1增殖试剂盒(RAS)的 细胞活力测试，采用可用于本发明的方法的不同化合物，其在Ξ官能接头部分有所不同。不 同接头似乎不影响4小时的接头解育时间过程中的细胞活力。A)2小时和BM小时后的活力 测试。
[0254] 图22:显示Ξ官能接头部分不影响细胞活力。发现可用于本发明的方法的测试化 合物，即A):作为具有胆固醇部分的化合物的第1244号和B):作为具有硬脂酸部分的化合物 的1274，在4.5小时的接头解育时间过程中不影响细胞形态。左图：1小时解育。中图：2.5小 时解育。右图：4.5小时解育。上图：明场。下图：DAPI。
[0255] 图23:显示在不同时间点无接头解育的细胞形态。无可用于本发明的方法的分子 添加时，在4.5小时的解育时间过程中，细胞扩散开(difTuse away)。在解育时间过程中左 侧细胞中细胞形态未受影响。左图：1小时解育。中图：2.5小时解育。右图：4.5小时解育。上 图：明场。下图：DAPI。
[0巧6] 图24:显示在不同时间点离屯、后的MDA-MB468细胞回收率。从左数各柱：1:与分子 10 min解育。2:与分子1小时解育。3:与分子3小时解育。4:与分子5 h min解育。测试W下可 用于本发明方法的化合物：1234:5'-(胆酱醇基-了66)2-间隔基(：18-(11'-生物素-了66-3'； 1255:3(肉豆違酸）2-PEG2000-dT-生物素-TEG-5' INVERS。离屯、过程中在PBS中W及使用 可用于本发明的方法的不同化合物在5小时内MDA-MB468培养细胞是稳定的。离屯、特征：20 min, 500 x g。
[ο巧7] 实施例5:使用可用于本发明方法中的化合物稳定细胞 测定可用于本发明的方法的化合物对稳定细胞和对固定的作用。
[ο測]A)离屯、和使用不同分子细胞固定后的WBC回收率 如图14中所示，分子探针皿1749*、皿1750*和皿1755* (*生物素-PEG-细胞溶解酶- (C18)2)显示关于离屯、后回收率的不同性能：分子浓度越高，离屯、后细胞回收率越高。离屯、 特征：10 min, 300 X g。如从图15中可见的，分子探针皿1749*、皿1750*和皿1755*显示W 不同浓度关于细胞固定率的不同性能。接头浓度越高，细胞固定率越高。
[0巧9] B)使用不同化合物离屯、后的WBC回收率一不同时间点 如从图16中可见，分子A和B( A:胆酱醇基-TEG-胆酱醇基-TEG-(间隔基C18) 7-Fluos-生 物素-TEG; B:生物素-PEG-细胞溶解酶-(C18)2)显示离屯、后关于回收率的不同性能。分子 浓度越高，离屯、后细胞回收率越高。分子B能够在3.5小时内细胞固定。离屯、特征：10 min, 300 X g. A:胆酱醇基-TEG-胆酱醇基-TEG-(间隔基C18)7-Fluos-生物素-TEGdB:生物素- PEG-细胞溶解酶-(C18)2。
[0260] C)离屯、后的WBC回收率一不同实验 如图17中所见，分子浓度越高，离屯、后细胞回收率越高。此外，细胞稳定独立于实验者。 离屯、特征：10 min, 300 X g。分子:胆酱醇基-TEG-胆酱醇基-TEG-(间隔基C18)7-Fluos-生 物素-TEG。
[0261] D)离屯、后的WBC回收率一不同时间点和离屯、设定 第一实验的结果显示在图18中。测试W下分子： ? 1234:5'-(胆酱醇基-了66)2-间隔基018-肌-生物素 -了66-3' ? 1248:3'-(胆酱醇基-TEG)2-PEG2000-Fluos-生物素 -TEG-5' INVERS 1 化4:3'-(胆 酱醇基-TEG)2-间隔基C18-F1UOS-生物素 -TEG-5 ' INVERS ? 1255:3'-(肉豆違酸）2斗662000-肌-生物素 -了66-5'1曆6尺5 ?所有分子能够在2小时内细胞固定。 ? W300 X g离屯、20 min过程中PBS中的WBC受损伤 ?分子1234显示最佳性能，随后为化合物1255和1254。 离屯、特征：20 min, 300 X邑。
[0262] 该背景下第二实验的结果显示在图19中。测试W下分子： 1255:3'-(肉豆違酸）2-PEG2000-dT-生物素-TEG-5' INVERS 1234:5'-(胆酱醇基- TEG)2-间隔基 C18-dT-生物素-TEG-3' 1248:3(胆酱醇基-TEG)2-PEG2000-Fluos-生物素-TEG-5' INVERS 1254:3'-(胆酱醇基-了66)2-间隔基(：18斗111〇3-生物素 -了66-5'1曆6尺5 结果如下： ?所有分子能够在2小时内细胞固定。 ? W500 X g离屯、20 min过程中PBS中的WBC受损伤 ?分子1234显不最佳性能，随后为分子1255和1254 离屯、特征:20 min, 500 X g。该背景下第Ξ实验的结果显示在图20中。测试W下分子： ? 1255:3'-(肉豆違酸）2斗662000-肌-生物素 -了66-5'1曆6尺5 ? 1234:5'-(胆酱醇基-了66)2-间隔基018-肌-生物素 -了66-3' ? 1248:3'-(胆酱醇基-了66)2斗662000斗111〇3-生物素 -了66-5'1曆6尺5 ? 1254:3'-(胆酱醇基-了66)2-间隔基(：18斗111〇3-生物素 -了66-5'1曆6尺5 结果如下： ?所有分子能够在2小时内细胞固定。 ? W1000 X g离屯、20 min过程中PBS中的WBC受损伤 离屯、特征：20 min, 500 X邑。
[026；3] Ε；)离屯、后Jurkat回收率一不同时间点 该实验的结果显示于图21中。测试W下分子： ? 1255:3'-(肉豆違酸）2斗662000-肌-生物素 -了66-5'1曆6尺5 ? 1234:5'-(胆酱醇基-了66)2-间隔基018-肌-生物素 -了66-3' ? 1248:3'-(胆酱醇基-了66)2斗662000斗111〇3-生物素 -了66-5'1曆6尺5 ? 1254:3'-(胆酱醇基-了66)2-间隔基(：18斗111〇3-生物素 -了66-5'1曆6尺5 结果如下： ?离屯、过程中在PBS中W及使用不同分子在5.5小时内化rkat培养细胞是稳定的。 离屯、特征：20 min, 500 X邑。
[0264] F) Ξ官能接头部分不影响细胞活力 该背景下第一实验的结果显示在图22A和B中。
[0265] 进行使用WST-1增殖试剂盒(RAS)的细胞活力测试，采用可用于本发明的方法的不 同分子，其在Ξ官能接头部分有所不同。
[0266] 试>不同接头不会影响4小时的接头解育时间过程中的细胞活力，如图22中可见 的。
[0267] 在该背景下第二实验的结果显示在图23A和B中。发现测试的可用于本发明的方法 的分子(第1244和1274号)不影响4.5小时的接头解育时间过程中的细胞形态。
[02側 G)未与可用于本发明的方法的分子解育的细胞形态一不同时间点 该实验的结果显示在图24中。发现W下： ?无可用于本发明的方法的分子添加时，在4.5小时的解育时间过程中，细胞扩散开 (diffuse away)。 ?在解育时间过程中左侧细胞中细胞形态未受影响。
[02~]H)离屯、后的MDA-MB468回收率一不同时间点 该实验的结果显示在图25中。测试W下可用于本发明方法的化合物： .1234:5'-(胆酱醇基-了66)2-间隔基018-肌-生物素 -了66-3' ? 1255:3'-(肉豆違酸）2斗662000-肌-生物素 -了66-5'1曆6尺5 发现W下： ?离屯、过程中在PBS中W及使用可用于本发明的方法的不同分子在5小时内MDA- MB468培养细胞是稳定的。 离屯、特征：20 min, 500 X邑。 脚0] 实施例6:与可用于本发明的方法的化合物解育的SA板(链霉抗生物素板)相比于 与可用于本发明的方法的化合物解育的WBC(白细胞)的比较 使用开始材料5(胆酱醇基-TEG)2-PEG2000-Fluos-生物素 _TEG-3' INVERS (14530pmol/yl)(内部参考号:29.891250)和链霉抗生物素处理的MTP (Microcoat)、 1巧L板。
[0271] 如下进行红细胞裂解： -邸TA-全血59.423 6.400 WBC/yl (Ambulanz Roche) 裂解缓冲液：100ml NH4C1 + 5mM Hepes + 0.5mM KHC03 + O.lmM 邸TA-K 化lx8ml全血装在具有裂解缓冲液的50ml化Icon管中，室溫下解育10分钟。
[0272] W250g离屯、15分钟，通过在裂解缓冲液中吹吸重悬沉淀;用裂解缓冲液加至50 ml 15分钟250g离屯、，用PBS重悬沉淀，用PB巧日至50 ml，15分钟250g离屯、，用PB巧日至50 ml。 WBC测量于Sysmex 1:37.100 WBC / μ1 对板的实验设计在下文解释(参见图2): 3x 12孔MTP:用可用于本发明的方法的化合物处理WBC: 4x测定： 行A:引入20化1 PBS，分别向其加入Inmol化合物，混合，解育约30min，洗涂2x PBS， 引入80化1口85，加入300.000胖8(：(未处理的）。 行8:引入80化1口85，加入300.000胖8(：(未处理的）。 行C: 1ml中1 Ox 10~6 WBC与1 Onmo 1可用于本发明的方法的化合物解育1 Omin。
[0273] 分别引入80化1 PBS/孔，300.000处理的胖8(：。
[0274] -30min后用PBS洗涂第一MTP板2x，覆盖H6chst并解育 15 min。测量〉Cellavista (Operator s9s5)。
[02巧]_90min后测量第二板。
[0276] _150min后测量第Ξ板。
[0277] 计算结果显示于图3中。代表运些结果的图描绘于图4中。实验的板显示在图5中。
[0278] 发现本发明的方法明显地且令人惊奇地是有利的。
【主权项】
1. 在支持物上固定细胞的方法，所述方法包括 a) 提供包含连接至一个亲水结构域的一个或多个疏水结构域的化合物或其盐，优选由 连接至一个亲水结构域的一个或多个疏水结构域组成的化合物或其盐， 其中所述一个或多个疏水结构域共价结合所述亲水结构域，且 其中所述一个或多个疏水结构域各自包含直链脂质、类固醇或疏水维生素，且其中所 述亲水结构域包含聚乙二醇(PEG)部分，且 其中所述化合物包含连接基团； b) 在允许化合物与细胞膜相互作用的条件下使细胞与所述化合物接触，从而在细胞表 面上固定连接基团；和 c) 将细胞上固定的连接基团与能够结合所述连接基团的支持物接触，从而在支持物上 固定所述细胞。2. 权利要求1的方法，其中所述化合物包含一个或多个疏水结构域和一个亲水结构域， 优选由其组成， 其中所述一个或多个疏水结构域共价结合所述亲水结构域，且 其中所述一个或多个疏水结构域各自包含直链脂质、类固醇或疏水维生素，且 其中所述亲水结构域包含式(I)的化合物： X1-[A1-(L1 )n]ki-Z-[A2-(Ll )n]k2_X2 (I)? 其中 z为含有1-100、优选1-50、更优选4-30个-〇-CH2-CH2-部分的直链聚乙二醇(PEG)部分， 其中所述聚乙二醇部分任选地包含一个或多个连接两个-〇-ch2-ch2-部分的间隔基部分SP， 并且其中所述直链PEG部分任选地包含在一个或两个末端的接头部分L3， 每一 L1为彼此独立选择的接头部分， 每一 η为0或1，彼此独立选择， Α1和Α2为彼此独立选择的双官能或三官能部分，条件是至少一个Α1或Α2是三官能的， kl和k2为0-10的整数，彼此独立选择，条件是kl和k2的至少一个不是0， XI和X2独立地选自氢或保护基， L3独立地选自具有1-10个C原子的直链烷基或烯基链，其任选地（i)被1-3个N、0或S原 子间断，和/或（i i )被1 -4个羟基、羰基、氨基或巯基所取代， 且 其中所述一个或多个疏水结构域经所述三官能结构域共价结合所述亲水结构域， 且 其中所述化合物进一步包含连接基团， 或其盐。3. 权利要求2的方法，其中式(I)中的Z具有以下结构： _ ( L3 )n2_[ 0_CH2_CH2 ] y_( SP ) nl ]m_[ 0_CH2_CH2 ] yl_ ( L3 )n2， 其中 SP是间隔基部分， 每一间隔基部分SP彼此独立地选择， 每一 nl为0或1，对于每一 m部分独立选择， 每一 n2为0或1，彼此独立选择， m为1-100的整数，优选1-50，更优选4-30， y为1-100的整数，优选1-50，更优选4-30， y 1为0-30的整数，优选0-10，更优选0-4， 条件是y*m +yl < 100， L3独立地选自具有1-10个C原子的直链烷基或烯基链，其任选地（i)被1-3个N、0或S原 子间断，和/或（i i )被1 -4个羟基、羰基、或巯基所取代。4. 权利要求3的方法，其中 (a) n 1对于m个部分-[〇-CH2-CH2 ]y-(SP)nl ]-是相同的，和/或 (b) yl为0,和/或 (c) y为4、5或6，且111为1，或 (d) y为4、5或6，且111为1，和/或 (e) 所述间隔基部分SP彼此独立地选自磷酸酯和双官能部分，和/或 (f) n2均为0,或 (g) -个或两个n2=l，且L3为具有1-10个C原子的烷基，其任选包含酰胺基、羰基、氨基 甲酸酯、和/或NH基团。5. 权利要求2-4中任一项的方法，其中 (a) Xl或X2被疏水结构域取代，和/或 (b) 所述连接基团是生物素。6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中所述直链脂质为 (a)饱和或不饱和脂肪酸，和/或 (b )具有8-26个C原子、优选12-22个C原子的脂肪酸， 更优选地，所述直链脂质选自油酸、肉豆蔻酸、硬脂酸和二十二酸，更优选地选自肉豆 蔻酸和油酸。7. 权利要求1-5中任一项的方法，其中 (a) 所述类固醇为固醇，或 (b) 其中所述类固醇选自胆固醇;类固醇激素，优选性腺类固醇，更优选雄激素，诸如促 蛋白合成类固醇、雄留烯二酮、脱氢表雄酮、双氢睾酮、或睾酮，雌激素，诸如雌二醇、雌三 醇、或雌酮;孕激素，诸如孕酮或妊娠素、皮质类固醇，特别是糖皮质激素或盐皮质激素;蜕 化类固醇诸如蜕皮留酮;植物留醇;油菜素类固醇;藿烷类;和麦角固醇， 更优选地其中所述类固醇为胆固醇，或 (c )其中所述疏水维生素为α-生育酸。8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中 (a) -个、两个、三个或四个，优选一个或两个疏水结构域共价结合至所述亲水结构域， 和/或 (b) 共价结合至所述亲水结构域的两个或多个疏水结构域是不同的或相同的，优选是 相同的。9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中所述疏水结构域 (a)由直链脂质、类固醇或疏水维生素组成，或 (b)包含经接头部分L2共价结合至三官能部分A1的直链脂质、类固醇或疏水维生素，其 中L2包含以下，优选由以下组成:磷酸酯基团，部分 -[〇-CH2_CH2 ]y2_(SP)n]_j 其中SP和η如上定义，优选n=0，y2为1-30的整数，优选3-10,且ml为1-10的整数，优选1-3,甘油部分，氨基甲酸酯基团，酰胺基，具有1-10个C原子具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个 原子的直链烷基，且所述烷基链包含在末端C原子处的官能团，特别是独立选自胺、羰基、羟 基、巯基、碳酸基团，所述烷基任选被1、2、3、4或5个部分R1所取代，其中R1独立地为C1-C4烷 基、Cl -C4羟烷基、Cl -C4氨基烷基、Cl -C4氰基烷基、羟基、巯基、氨基或羰基部分，更优选地 L2选自磷酸酯、酰胺、氨基甲酸酯、酯基和部分 -[〇-CH2_CH2 ] y2_ ( SP )η]ml- J 其中 SP和η如上文定义，优选地n=0， y2为1-30的整数，优选3-10,且 ml为1-10的整数，优选1-3， 更优选地，其中直链脂质、类固醇或疏水维生素经接头部分四乙二醇(TEG)或磷酸酯结 合三官能部分A1。10. 权利要求1-9中任一项的方法，其中 (a) kl为1、2、3、4或5,优选1、2或3,和/或 (b) 所述疏水结构域仅通过所述三官能部分A1共价结合所述亲水结构域，和/或 (c) k2为1、2、3、4、5或6,优选 1、2或3。11. 权利要求1 -1 〇中任一项的方法，其中 (a) 所述化合物进一步包含标记部分， 优选地 其中标记部分经三官能部分A2共价结合，和/或 其中一个或多个部分A2为标记部分，更优选地其中部分A2为包含核碱基的部分，甚至 更优选地其中部分A2为dT， 甚至更优选地其中所述标记部分为荧光标记，和/或 (b) 其中连接基团经三官能部分A2共价结合。12. 权利要求1 -11中任一项的方法，其中 (a) 接头L1独立地选自磷酸酯、酰胺、氨基甲酸酯和酯基，和/或 (b) 部分A1和A2独立地选自选自以下的双官能基团：磷酸酯基团、氨基甲酸酯基团、酰 胺基团、包含核碱基的部分甚至更优选dT，和具有1-10个C原子的直链烷基，且所述烷基链 包含在末端C原子处的官能团，尤其独立地选自胺、羰基、羟基、巯基、碳酸基团，和三官能部 分，所述三官能部分具有1-10个C原子且包含至少一个-〇H、-SH和/或至少一个-NH2基团，优 选地选自赖氨酸、丝氨酸、丝氨醇、_0-〇12-〇1((〇12)4-1€12)-〇12-、甘油、和1，3二氨基甘油 部分，和/或 (c) 接头L2独立地选自磷酸酯、酰胺、氨基甲酸酯、酯基和部分 -[〇-CH2_CH2 ]y2_ ( SP ) n]ml_ J 其中 SP和η如上文定义，优选地n=0， y2为1-30的整数，优选3-10,且 ml为1-10的整数，优选1-3。13. 权利要求1-12中任一项的方法，其中所述化合物或其盐在包含权利要求1-12、更优 选11 -12中任一项的一种或多种化合物的组合物中，甚至更优选地 其中所述组合物包含权利要求1-12中任一项的至少三种不同的化合物，且其中 (i)所述不同的化合物至少在其疏水结构域处不同和 (i i )所述不同的化合物包含标记部分， 最优选地，其中所述组合物包含至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种不同的 化合物。14. 在支持物上固定包含目标细胞的细胞群的方法，所述方法包括 a) 提供如权利要求1-12中任一项定义的化合物； b) 在允许化合物与细胞膜相互作用的条件下使细胞群与所述化合物接触，从而在细 胞表面上固定连接基团； c) 将细胞上固定的连接基团与能够结合所述连接基团的支持物接触，从而在所述支 持物上固定所述细胞;和 d) 任选检测固定在支持物上的目标细胞， 优选地，其中所述目标细胞是白细胞，特别是稀有细胞诸如循环肿瘤细胞、内皮细胞或 上皮细胞。15. 权利要求1-14中任一项的方法，其中所述细胞为悬浮细胞和/或其中所述细胞为动 物或人细胞，特别是脊椎动物细胞，尤其是哺乳动物细胞。
【文档编号】C12N11/06GK105829886SQ201480069194
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年12月19日
【发明人】H-P.约泽尔, D.海因德尔, T.弗雷利希, S.弗雷纳
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司