一种提高化合物或材料进细胞效率的方法及应用与流程

本发明涉及生物材料领域，具体地涉及一种提高化合物或材料进细胞效率的方法及应用。

背景技术：

多肽分子作为介于有机小分子和蛋白质之间的一类特殊的生物大分子，具有较好的生物相容性，同时又可以模拟体内一些蛋白质的生物功能，因此常被用于设计成分子探针研究细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，或者被设计成药物分子，参与细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，诱导癌细胞凋亡，达到疾病的诊断和治疗的目的。然而，进细胞效率低成为限制其应用的主要瓶颈。

早在20世纪就有研究人员发现许多病毒(如hiv-1、hcv等等)在进入细胞的过程中会与细胞膜发生巯基-二硫键交换反应，并且这一交换反应对介导其进细胞发挥着十分重要的作用。受此启发，一种利用细胞膜巯基-二硫键交换反应来提高外源性材料的进细胞效率的方法应运而生。例如：torres,a.g.等在2011年报道了利用细胞膜二硫键交换反应提高寡聚核苷酸类似物的进细胞效率方法。stefanmatile等则合成了有高进细胞效率的聚二硫键高分子化合物(cpds)，其依据的原理也是细胞膜二硫键交换反应。sandrinesagan等则将细胞膜巯基-二硫键交换反应介导的跨膜递送应用到多肽分子体系，通过在细胞穿透肽(cpps)上引入巯基或者二硫键进一步提高了细胞穿透肽的进细胞效率。

然而，目前发展的利用细胞膜巯基-二硫键交换反应即仅依靠多肽分子与细胞膜间形成单二硫键的方式对多肽分子进细胞效率的提高程度是十分有限的。这主要是因为细胞膜及其外围因存在着不少含巯基化合物，如谷胱甘肽(gsh)、半胱氨酸(cys)等，会使得在细胞膜表面及其外围发生的巯基-二硫键交换反应更加的复杂。很多多肽分子在到达细胞膜之前可能就已经发生了二硫键交换反应，甚至一些多肽分子即使与细胞膜间形成了二硫键，也同样会因再次发生交换反应而从细胞膜脱离。这些因素都使得细胞膜巯基-二硫键交换反应对进细胞效率的介导效应大打折扣。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种提高化合物或材料进细胞效率的方法及应用。

本发明是这样实现的，一种提高化合物或材料进细胞效率的方法，其包括如下步骤：

在化合物或材料上修饰含有cxc的氨基酸序列，其中，c代表半胱氨酸，x代表除半胱氨酸外的任意天然氨基酸或非天然氨基酸。

以及，本发明提供一种提高化合物或材料进细胞效率的方法在药物或药物制备中的应用。

本发明提还供一种提高化合物或材料进细胞效率的方法在药物载体或药物载体制备中的应用。

本发明还提供一种提高化合物或材料进细胞效率的方法在生物探针或生物探针制备中的应用。

本发明提供的一种提高化合物或材料进细胞效率的方法，利用特殊氨基酸序列cxc，在细胞膜表面形成稳定性更高的双二硫键，从而有效地抵抗了细胞外围谷胱甘肽等巯基分子的进攻，避免了多肽分子再次发生交换反应而从细胞膜脱离的过程，使得基于细胞膜二硫键交换反应介导的进细胞效率有了很大程度的提高，从而克服传统的通过在细胞膜表面形成单二硫键来提高多肽分子的进细胞效率所存在的缺陷。当多肽片段为c(x)n时，也就是只含有一个半胱氨酸，就是传统的依靠与细胞膜间形成单二硫键的方式来提高进细胞效率，这种单二硫键不够稳定，形成后还会可能再次被细胞外围的谷胱甘肽含巯基分子进攻，从而脱离细胞膜，所以其介导进细胞的效率较低；当n＝0，即为cc结构时，两个巯基因为距离比较近，而非常容易在分子内形成二硫键，从而自身形成内环结构；当n≥2时，此时，两个巯基间因间隔较多的氨基酸而变得柔性，也非常容易在分子内形成二硫键，从而自身形成内环结构，这种内环结构一旦形成，就使得多肽分子从细胞膜脱落，巯基-二硫键交换反应就失去了介导进细胞的效应。而当n＝1，即为cxc结构时，两个巯基间间隔一个氨基酸，此时空间位阻恰好比较大，导致较难在分子内形成二硫键，在细胞外排的谷胱甘肽的介导下，cxc结构单元会与含双巯基(或二硫键)的膜蛋白以及谷胱甘肽分子形成较稳定的混合型二硫键，并最终能以双二硫键的方式连接到膜蛋白上，并且其巯基还原态也具有同样的效果。该多肽可以大大提高其修饰物(如化合物和材料)进细胞的效率，操作上非常简单、易于实现，而且对进细胞效率的提高效果十分显著，在药物和探针等诸多领域都具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是cxc具有较高介导进细胞效率的机理图。

图2是不同氨基酸序列进入细胞的效率。

图3是不同氨基酸序列多肽或蛋白质分子的进细胞效率评价。

图4是不同种属和种类的细胞“cxc”基序的进细胞效率进行的考察情况。

图5是基于cgc和crc序列的多肽分子探针fam-gcgcgrkkrrqrrr和fam-gcrcgrkkrrqrrr进细胞效率的考察。

图6是fam-gcggge和fam-gcgcge多肽进hela细胞的效率。

图7是fam-gsgggltfrrywarlrs和fam-gcgggltfrrywarlrs多肽进mcf-7细胞的效率。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种提高化合物或材料进细胞效率的方法，其包括如下步骤：

在化合物或材料上修饰含有cxc的氨基酸序列，其中，c代表半胱氨酸，x为除半胱氨酸外的任意天然氨基酸或非天然氨基酸。

具体地，x可以为甘氨酸gly、丙氨酸ala、缬氨酸val、亮氨酸leu、异亮氨酸ile、脯氨酸pro、苯丙氨酸phe、酪氨酸tyr、色氨酸trp、丝氨酸ser、苏氨酸thr、蛋氨酸met、天冬酰胺asn、谷氨酰胺gln、天冬氨酸asp、谷氨酸glu、赖氨酸lys、精氨酸arg、组氨酸his等中的任意一种，或者是非天然氨基酸，即具有不同于上述天然氨基酸侧链的其它类型氨基酸，如d型氨基酸、丁氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸等。基于巯基形成二硫键的动力学过程会受到位阻效应的影响，通过调节多肽片段c(x)nc(n＝0,1,2…)中两个半胱氨酸的位置和数目的方式，改变两个巯基间的空间位阻，可以操纵巯基形成二硫键的方向。采用“遍历”的方法进行筛选，最终得到可以与细胞膜上的某些双巯基蛋白形成双二硫键的特殊结构单元。在cxc结构中，两个巯基间间隔一个氨基酸，此时空间位阻恰好比较大，导致较难在分子内形成二硫键，在细胞外排的谷胱甘肽的介导下，cxc结构单元会与含双巯基(或二硫键)的膜蛋白以及谷胱甘肽分子形成较稳定的混合型二硫键，并最终能以双二硫键的方式连接到膜蛋白上。如图1所示，cxc因其特殊的空间位阻性质，在与谷胱甘肽等巯基化合物反应时可以以四种形式存在，分别是还原态的双巯基，氧化态的内环形式，单谷胱甘肽结合物和双谷胱甘肽结合物。而cc或cxxc则仅能以还原态双巯基和氧化态内环这两种形式存在。所以在细胞膜外排的谷胱甘肽的参与下，与细胞膜发生巯基-二硫键交换反应时，cxc与含巯基膜蛋白能形成如上图所示的三种较稳定中间体，并最终形成稳定的双二硫键，从而大幅度提高进细胞效率。

优选地，所述x为甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、丝氨酸等。

具体地，所述cxc多肽的固相合成方法为：

(1)按照事先计算好的比例配制氨基酸溶液和合成用树脂；

(2)将配好的氨基酸溶液装入多肽合成仪；

(3)运行多肽合成程序，进行多肽合成；

(4)切割树脂和多肽，色谱纯化，质谱表征，获得cxc多肽。

对于多肽固相合成技术以及化学修饰技术，目前都已经比较成熟，在此不再详述。要是想得到较稳定的氧化态内环结构形式，后续再通过在体积比为10：1的dmso与10mmpb的混合溶剂中进行低浓度氧化24h，再经过色谱纯化，即可以得到有较高进细胞效率的含“cxc”cyclic的多肽分子。

所述在化合物或材料上修饰含有cxc氨基酸序列，对于多肽分子，可以在多肽固相合成的过程中直接将“cxc”作为多肽序列的一部分一起合成，从而直接得到含“cxc”基序的多肽分子，对于其他化合物或者材料，可以通过共价键、静电作用、氢键等方式修饰。优选地，通过共价键修饰，例如：运用多肽固相合成技术合成gcxcg的多肽序列，就可以获得c端酰胺化，n端有活性氨基的cxc基序；再通过缩合反应，将cxc基序连到含有活性羧基的化合物或材料上，以此提高化合物或材料的进细胞效率。当然也可以根据化合物或材料的性质，选择合适的中间连接键进行转换，实现将cxc基序连到化合物或材料上的目的。具体地，所述化合物或材料可以为多肽化合物、蛋白、聚合物、微纳米材料中的任意一种。对于多肽化合物，可以在多肽合成的过程中，直接将cxc作为多肽序列的一部分与原有的多肽序列一起合成。

更优选地，所述在化合物或材料上修饰含有cxc的氨基酸序列，还包括通过修饰将化合物或材料带正电的步骤。正电荷能够介导cxc靠近细胞膜，使之与细胞膜发生巯基-二硫键交换反应，提高化合物或材料进细胞的效率。

通过设计五个不同氨基酸序列含正电荷的多肽分子来验证基于cxc序列的有效性。s-tat(fam-gsgggrkkrrqrrr-nh2)、c-tat(fam-gcgggrkkrrqrrr-nh2)、cc-tat(fam-gccggrkkrrqrrr-nh2)、cgc-tat(fam-gcgcgrkkrrqrrr-nh2)和cggc-tat(fam-gcggcgrkkrrqrrr-nh2)。s-tat是不含任何巯基或二硫键的多肽分子用来作为对照，c-tat是用dtdp活化的二硫键，即为传统的单二硫键；cc-tat、cgc-tat和cggc-tat分别是含cc、cgc、cggc基序的多肽。多肽分子的浓度均为1μm，孵育hela细胞时间均为4h，通过流式细胞仪考查的其分别进细胞效率，包括了其氧化态的内环结构形式和还原态的巯基形式，从图2中可以看出，上述五个多肽中进入细胞最多的是cgc-tat，证明了该序列对于提高多肽进入细胞效率的具有重要的意义。

通过设计如下六个不同氨基酸序列多肽或蛋白质分子fam-gsgggrrr、fam-gcgggrrr、fam-gcgcgrrr、fam-gsgggpsqptypgddapvrdlirfyrdlrrylnvvtrhry、fam-gcgggpsqptypgddapvrdlirfyrdlrrylnvvtrhry、fam-gcgcgpsqptypgddapvrdlirfyrdlrrylnvvtrhry来验证cxc对提高不同的多肽以及蛋白质分子进细胞效率的普适性。从图3中可以看出，无论是对于多肽还是蛋白质，cxc都可以提高其进入细胞的效率。

利用不同种属和种类的细胞系验证该提高多肽进细胞效率的方法在不同细胞系中具有普适性，其中细胞系包括人源、鼠源和正常组织细胞。多肽序列为fam-gcgcgrkkrrqrrr。从图4可以看出，本发明提高进细胞效率的多肽对细胞没有选择性，可以提高多肽进入任何细胞的效率。

采用激光共聚焦显微镜对其进细胞途径和过程进行分析，发现cxc基序介导的进细胞效率的提高是通过一种新的内吞途径实现。含cgc的多肽fam-gcgcgrkkrrqrrr在1h时多肽分子基本上连在了细胞膜的表面，即是fam-gcgcgrkkrrqrrr中的“cgc”结构单元与细胞膜形成双二硫键的过程。孵育4h后进行的拍摄，可以看到多肽分子多数已经进入到了细胞内。

进一步，在相同情况下，我们另外设计了两条分别含有cgc和crc序列的多肽分子探针fam-gcgcgrkkrrqrrr和fam-gcrcgrkkrrqrrr进行进入细胞效率的验证。如图5所示，同样在hela细胞上，1μm的fam-gcgcgrkkrrqrrr和fam-gcrcgrkkrrqrrr孵育4h后具有相同的进细胞效率，这说明改变x的种类，对多肽进入细胞的效率没有明显影响。对于x为甘氨酸gly、丙氨酸ala、缬氨酸val、亮氨酸leu、异亮氨酸ile、脯氨酸pro、苯丙氨酸phe、酪氨酸tyr、色氨酸trp、丝氨酸ser、苏氨酸thr、蛋氨酸met、天冬酰胺asn、谷氨酰胺gln、天冬氨酸asp、谷氨酸glu、赖氨酸lys、精氨酸arg、组氨酸his均可以提高多肽进细胞的效率。

而通过改变多肽分子所带的电荷，设计了fam-gcggge和fam-gcgcge两种多肽分子探针来探索cxc发挥作用的过程，结果发现如图6所示，cgc在效果上有少许提高。这表明了带正电荷的多肽分子仅仅起到的介导cxc靠近细胞膜，使之能与细胞膜发生巯基-二硫键交换反应的作用，也再次说明了cxc序列可以提高化合物或材料进细胞的效率。

以及，本发明提供一种提高化合物或材料进细胞效率的方法在药物中的应用。

p53蛋白是细胞的基因组卫士，起着修复dna，阻止细胞癌变的作用。但当细胞过量表达mdm2或mdmx蛋白时，就会大量结合p53蛋白，使dna的复制失去控制，细胞癌变。ltfrrywarlrs是一条与mdm2或mdmx有较强亲和能力的活性多肽，其通过可以结合mdm2或mdmx蛋白，释放出p53，达到抑癌作用，但进细胞效率低成为限制其应用的主要瓶颈。以该活性多肽为例，将cgc序列插入到活性多肽ltfrrywarlrs的一端，设计出fam-gcgcgltfrrywarlrs的多肽分子。另外作为对照，设计了fam-gsgggltfrrywarlrs和fam-gcgggltfrrywarlrs这两条多肽，分别考查了它们的进mcf-7细胞(一种p53野生型，mdm2过表达的癌细胞)效率。活性多肽分子的序列为ltfrrywarlrs的n端修饰fam荧光染料，用流式细胞仪分析它们的进细胞效率。如图7所示，纵坐标是以sgg在细胞内的荧光强度值作为单位“1”做的归一化处理，可以看到，连有cgc多肽序列活性肽的进细胞效率较连上sgg的提高了60多倍，较连上cgg的提高了十几倍。

本发明提还供一种提高化合物或材料进细胞效率的方法在药物载体中的应用。

所述药物载体包括多肽、蛋白质、聚合物、纳米二氧化硅、量子点、磁性纳米颗粒中的至少一种。例如利用gcgcg的氨基修饰鱼精蛋白，作为基因载体，提高载体和基因进入细胞的效率，提升治疗效果。

本发明还提供一种提高化合物或材料进细胞效率的方法在生物探针领域中的应用。

利用gcgcg的氨基与带有谷胱甘肽修饰的纳米金簇反应，制备得到gcgcg-纳米金簇荧光探针，与hela细胞共同孵育，通过激光共聚焦和流式细胞仪对细胞内的荧光进行分析，发现修饰gcgcg的纳米金簇纳米金簇与谷胱甘肽修饰的纳米金簇相比，进入细胞的效率大大提高。

进一步，具体的所述生物探针领域中的应用包括纳米荧光探针、磁成像探针、光声成像探针等。

实施例1：

hela细胞与1μm的多肽分子探针在含10％fbs的dmem培养基中与细胞孵育4h后，用流式细胞仪分析各探针分子的进细胞效率。其中，多肽分子探针的序列如图2中所示，即在细胞穿透肽tat：rkkrrqrrr的一端引入不同的含巯基多肽单元，并在n端修饰fam荧光染料。图中黑色柱表示多肽以分子内形成二硫键的氧化态内环结构形式存在(其中cgg是通过硫吡啶活化的二硫键)，白色柱表示多肽以自由的双巯基(或巯基)形式存在。图中纵坐标是以sgg在细胞内的荧光强度值作为单位“1”做的归一化处理。可以看到，无论是连上cgc氧化态的内环形式，还是还原态的双巯基形式，均能明显提高多肽分子的进细胞效率。

实施例2：

hela细胞与1μm带有正电荷的多肽分子rrr和蛋白质分子psqptypgddapvrdlirfyrdlrrylnvvtrhry的一端引入不同的含巯基多肽单元，并在n端修饰fam荧光染料。用流式细胞仪分析各多肽(图中黑色柱)或蛋白质(图中白色柱)分子的进细胞效率，图3中纵坐标是以sgg在细胞内的荧光强度值作为单位“1”做的归一化处理。可以看到，相对于sgg，连上cgg后，多肽或蛋白质分子的进细胞效率有所提高，连上cgc后，多肽或蛋白质分子的进细胞效率均明显提高。说明cgc多肽单元能够提高任意一种多肽或蛋白质等生物材料分子的进细胞效率。

实施例3：

将不同种类的细胞与1μm的多肽在含10％fbs的dmem培养基中与细胞孵育4h后，用流式细胞仪分析各探针分子的进细胞效率。包括：hela细胞(人源的，宫颈癌细胞，图中横线填充柱)，mcf7细胞(人源的，乳腺癌细胞，图中白色填充柱)，cho细胞(鼠源的，中国仓鼠卵巢细胞，图中斜线填充柱)，raw264.7细胞(鼠源的，大鼠腹腔巨噬细胞，图中网格线填充柱)，其中，多肽分子探针的序列如图4中所示，即在细胞穿透肽tat：rkkrrqrrr的一端引入不同的含巯基多肽单元，并在n端修饰fam荧光染料。图4中纵坐标是以sgg在细胞内的荧光强度值作为单位“1”做的归一化处理。可以看到在不同种类的细胞系中连有cgc多肽单元的探针分子均具有更高的进细胞效率，验证了cgc多肽单元介导的进细胞效率的提高对不同种类细胞系的普遍适用性。

实施例4：

hela细胞与1μm的多肽在含10％fbs的dmem培养基中与细胞孵育4h后，用流式细胞仪分析各探针分子的进细胞效率。其中，多肽分子探针的序列如图5中所示，即在细胞穿透肽tat：rkkrrqrrr的一端引入cgc(电中性)或crc(带正电荷)多肽单元，并在n端修饰fam荧光染料。图中黑色柱表示cgc多肽单元介导进细胞的能力，白色柱表示crc多肽单元介导进细胞的能力。图中纵坐标是以sgg在细胞内的荧光强度值作为单位“1”做的归一化处理。可以看到cxc多肽单元所带的电荷并不会影响其介导跨膜递送的能力。

实施例5：

hela细胞与1μm的多肽分子探针在含10％fbs的dmem培养基中与细胞分别孵育4h、24h、48h后，用流式细胞仪分析各探针分子的进细胞效率。其中，多肽分子探针的序列如图中所示，即在带负电荷的氨基酸e的一端引入不同的含巯基多肽单元，并在n端修饰fam荧光染料。可以看到，对于带有负电荷的多肽或氨基酸，连上cgc多肽单元相对于cgg的进细胞效率略微有些提高，这是由于cgc是通过在正电荷的介导作用下靠近了细胞膜并与细胞膜发生了巯基-二硫键交换反应，实现提高进细胞效率的机制。