促进β细胞复制的化合物及其使用方法

专利名称：促进β细胞复制的化合物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及促进β细胞复制和/或生长的组合物与方法。
背景技术：
存在以下两种形式的糖尿病(I)胰岛素依赖型糖尿病或I型糖尿病(又名，幼年型糖尿病、脆弱性糖尿病，胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))以及(2)非胰岛素依赖型糖尿病或2型糖尿病(又名NIDDM)。I型糖尿病最经常在青少年身上发病，但可在成年人中出现。2型糖尿病最经常在中年或老年人身上发病，但也可在年轻人中出现。糖尿病是一种由多种诱发因素引发的疾病，其特征在于禁食状态下或口服葡萄糖耐量试验期间服用葡萄糖后血浆葡萄糖水平上升(高血糖症)。在I型和2型糖尿病中都发生β细胞团块(β-cell mass)的减少。I型糖尿病是一种自身免疫疾病状况，其特征在于由完全没有胰岛素(S卩，胰腺β细胞功能和团块的丧失)而引起的高血糖水平。当人的免疫系统对在胰腺中的产胰岛素β细胞进行攻击并将其破坏时，发生I型糖尿病。目前普遍相信，细胞因子的白细胞介素12(IL-12)家族以及信号转导与转录活化因子家族中的成员、如STAT-4 (被认为是参与免疫应答的T-细胞分化调节剂)的下游活化，在导致自身免疫性的β细胞毁坏过程中起主要作用。胰腺随后几乎或完全不产生胰岛素。所经历的最常见的I型糖尿病症状中包括过度口渴(烦渴)、频繁排尿(尿频)、极度饥饿(多食)、极度疲劳以及体重下降。这些症状是由高血糖症以及身体脂肪分解造成的。被诊断患有I型糖尿病的人通常表现出高于300mg的血糖水平，并且在尿中出现酮。β细胞团块的恢复与胰岛素生产可以完全逆转糖尿病的状态。有证据表明，患有长期I型糖尿病的人持续有β细胞生成，但是被持续的自身免疫毁坏作用令人不希望地加以破坏。因此，使β细胞的复制得以增加的组合物与方法可以提供使正常的β细胞团块水平得以恢复、并逆转或治愈I型糖尿病的有效途径。LADA是I型糖尿病最新认识到的一种亚型，被认为占到所有糖尿病病例的高达10%-20%。LADA也被称作I. 5型糖尿病。LADA经常在起初被诊断患有2型糖尿病的人之中出现。尽管它具有类似于成年人I型糖尿病发病的特征，但β细胞的毁坏在其进程中被认为没有那么严重。2型糖尿病是由胰岛素抵抗与胰岛素分泌受损结合产生的，但是患有2型糖尿病的很多人最终都显示出胰腺β细胞团块与功能的明显减少，转而使得患有2型糖尿病的人胰岛素“相对”不足，这是因为胰腺β细胞仍然产生部分胰岛素，但是这些胰岛素或者太少，或者不能合适地工作以便使葡萄糖充分进入细胞中产生能量。最近的尸检研究中获得明显的证据,显示了在患有2型糖尿病的人体内身体中持续的β细胞死亡(细胞凋亡)。所以，提供更多β细胞的治疗途径可以为逆转或治愈2型糖尿病提供明显的治疗作用。不加以控制的2型糖尿病引起血液中的葡萄糖过量，导致高血糖症。患有2型糖尿病的人会感觉到疲劳、口渴加重、尿频、皮肤干燥发痒、视力模糊、伤口愈合慢、多于正常水平的感染以及足部的麻木刺痛感。如不进行治疗，患有2型糖尿病的人会脱水，且血液总量会发展到危险的低位。如果2型糖尿病的病人在很长时间内不加以控制，会产生更多严重的症状，包括重度高血糖(血糖超过600mg)、昏睡、混乱、颤抖、以及最终的“高渗透压高血糖非酮性昏迷”。持续或不加以控制的高血糖症还与婴儿发病率与死亡率(prematuremorbidity and mortality)的增长相关。因此,对葡萄糖动态平衡、脂质代谢作用、肥胖和高血压的治疗控制在临床管理和糖尿病治疗方面是非常重要的。治疗糖尿病的目标是通过改善高血糖状态来避免出现上述所提及的慢性并发症 (缓慢疾病进程)的出现，或是使其得以逆转/治愈。治疗糖尿病的传统方法包括对于I型糖尿病的情况，给予流食与胰岛素；对于2型糖尿病的情况，给予各种降血糖药。诸如胰岛素制剂、胰岛素促分泌剂、胰岛素增敏剂和α -葡萄糖苷酶抑制剂等降血糖药被广泛地用作临床治疗的方法。其实例包括阿卡波糖(Precose J)、glimeprimide (AmarylJ)、二甲双胍(Glucophage V)、那格列奈(Starlix V)、卩比格列酮(ActosV)、瑞格列奈(PrandinJ)、罗格列酮(AvandiaV)、磺酰脲类、奥利司他(XenicalV)和艾塞那肽(Byetta)等。然而,很多已知的降血糖药都表现出了不合人意的副作用，并且在某些情况下是有毒的。举例而言，对于糖尿病患者患有严重的胰腺胰岛素分泌降低的情况，胰岛素促分泌剂与胰岛素增敏剂的有效性降低。类似地，对于糖尿病患者的胰岛素抵抗明显很高时，胰岛素制剂与胰岛素促分泌剂的有效性降低。原则上，可以采用对含有分泌或产生胰岛素的细胞组织(即胰岛)进行成功移植来治疗糖尿病。对产胰岛素细胞进行移植的方法已经被尝试作为一种用于逆转或治愈I型糖尿病的方法，但是存在与外科手术有关和与有毒的免疫抑制型药物(需要服用该药物来预防或减轻异体移植排异以及自身免疫的复发)有关的显著风险。此外，如今在美国有超过一百万名患有I型糖尿病的人，但是由尸体的胰腺组织供应胰岛却是有限的。例如，每年仅能获得6000个器官，需要2个或3个器官才能提供足够的胰岛来逆转一个人的I型糖尿病。所以，急迫地需要提供具有功能(胰岛素生成)的β细胞的新来源。对于可诱导β细胞增殖的化合物的高通量筛选分析，本领域中只记载了一个实例。这一筛选方法利用了生长阻滞、可逆性永生化的小鼠β细胞。这一方法的主要缺点是经过这种筛选方法鉴定出的化合物对原代β细胞可能不具有相同的效果，也就是说，所鉴定出的化合物只是专门用于在生长阻滞、可逆性永生化的小鼠β细胞中诱导增殖。所以，需要对可诱导原代β细胞(例如，没有发生转化的β细胞)增殖的化合物进行筛选的方法。

发明内容
本发明一方面提供了使胰腺细胞群中的β细胞复制增加的方法，所述方法包括用腺苷激酶(ADK)的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的抑制剂或AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化剂与胰腺细胞群进行接触。本发明另一方面提供了对用于增加β细胞复制的候选化合物进行筛选的方法，所述方法包括如下步骤Ca)将测试化合物与胰腺细胞群进行接触；(b)选择如下化合物(i)使培养物中的细胞总数增加；(ii)相比于未处理的对照，使培养物中表达至少一种β细胞标记的细胞总数增加；(iii)相比于未经处理的对照，使表达至少一种β细胞标记的细胞相对于培养物中细胞总数的比例增加；(iv)相比于未经处理的对照，使表达至少一种细胞复制标记的细胞数增加；或者(V)相比于未经处理的对照，使表达至少一种细胞复制标记的细胞比例增加；并且其中，胰腺细胞是原代胰腺细胞。


图I描述了示出由AlO和B8引起的、PH3相对于TOXl增加的百分比的柱状图。
图2a和图2b描述了示出化合物AlO (5-IT)的浓度对β细胞增殖(图2a)和小鼠皮肤成纤维细胞增殖(图2b)的影响的曲线图。对β细胞的EC50经测定为O. 47 μ M0图3描述了示出化合物Β8的浓度对β细胞增殖的影响的曲线图(EC50=9. ΙμΜ)。图4描述了示出在处理4天后，化合物AlO和Β8对Ki-67的诱导倍数的折线图。在第O天加入化合物，并在第2天更换介质。图5描述了示出介质的血清浓度对Ki-67诱导作用(由ΙμΜ AlO在β细胞中引起)的影响的柱状图。图6描述了示出葡萄糖对β细胞中的Ki-67诱导作用和Η)Χ+表达(由AlO引起)没有影响的曲线图。图7描述了示出腺苷不以浓度依赖的方式引起对大鼠胰岛中rox+和Ki-67诱导作用的曲线图。图8a和图8b描述了示出腺苷受体拮抗剂对AlO诱导的Ki-67增加作用的影响的柱状图。图8a :以2 μ M、I μ M、O. 2 μ M、O. 04 μ M或O. O μ M (无拮抗剂)浓度的拮抗剂进行试验。图8b :以O. 2 μ M浓度的拮抗剂进行试验。图9描述了示出腺苷激酶抑制剂AlO和腺苷单磷酸活化激酶活化剂AICAR对β细胞复制的影响的柱状图。图10描述了示出AMPK-抑制作用对AlO诱导的β细胞复制的影响的柱状图。图Ila和图Ilb描述了某些示例性腺苷激酶抑制剂的结构，分别为基于核苷的腺苷激酶抑制剂(图Ila)和基于非核苷的腺苷激酶抑制剂(图lib)。图12为示出体内β细胞复制的增加作用的柱状图。图13a-图13d显示出腺苷激酶抑制剂(ADK-Is)诱导了大鼠、小鼠和猪的β细胞的增殖。图13a显示出促进β细胞复制的某些示例性ADK-Is的化学结构与名称。图13b显示出剂量反应曲线，示出了在对ABT-702处理的应答中，鼠β细胞增殖(上图)和猪β细胞增殖(下图)之间的关系。图13c显示出大鼠胰岛培养物的剂量反应曲线，所述曲线示出了用化合物5-IT (左图，EC50=4. 7μΜ)和ABT-702 (右图，EC50=7. O μ Μ)进行处理与β细胞增殖之间的关系。图13d显示出用DMSO或5-ΙΤ (2μΜ)处理96h和144h后对β细胞数的定量。误差棒表示标准差，相对于用辅料进行处理的情况*Ρ〈0. 01。图14a和图14b显示出β细胞表达出核腺苷激酶(ADK)，其作为增殖作用的细胞自主负性调节剂。图14a为示出siRNA介导的ADK下调作用(knockdown)的Western印迹，该下调作用使用来自经稳定转导的细胞的H4IIE (大鼠肝细胞系)裂解物进行评价，所述转导使用阴性对照siRNA (I道和3道)或ADK导向的siRNA (2道和4道)。用Y -微管蛋白将负载标准化。图14b为示出在感染含有对照siRNA序列(左图)或ADK导向的siRNA序列(右图)的病毒后，对β细胞复制进行定量的柱状图。在病毒编码的GFP表达的基础上，分别对同一孔中的未感染细胞和感染细胞的复制速率进行分析。误差棒表示SEM (η=8个独立的孔);*Ρ〈0. 01。图15a和图15b显示出由ADK-Is诱导的β细胞复制对葡萄糖和胰高血糖素样肽-I受体(GLP-IR)激动剂的加合作用。图15a为示出在多种葡萄糖浓度加上DMSO或5-ΙΤ(211|0存在的情况下，对培养2411、4811或9611后的β细胞复制速率进行定量的柱状图。将各时间点的值归一化至5mM葡萄糖加上DMSO处理条件。各处理条件的标准差小于10%，误差棒未示出。在相同葡萄糖浓度和时间点下，当将经5-IT处理的孔与经DMSO处理的孔相比时，*P < O. 01 ;当将经DMSO或5-IT处理的孔与在相同时间点并采用相同处理(DMS0或5-IT)的5mM葡萄糖处理条件相比时，林P < 0.01。图15b为示出在用DMS0、5_IT、GLP-1、 Ex4、5-IT加上GLP-I或5-IT加上Ex4处理24h后，对β细胞复制速率进行定量的柱状图。5-ΙΤ的浓度为2 μ M。GLP-I和Εχ_4的浓度为20ηΜ (左侧柱)和4ηΜ (右侧柱)。将各值归一化至DMSO处理条件。误差棒表示标准差；对于所指示出的比较，*Ρ < O. 01且林P < O. 03。图16a-图16e显示了 ADK-Is在体外和体内选择性地促进β细胞的复制。图16a显示出描述在用DMS0、5-IT (2μΜ)或ABT-702 (15μΜ)处理后，对δ细胞(生长抑素+，左图)、α细胞(胰高血糖素+，中间图)和成纤维细胞(波形蛋白+，右图)的体外复制速率进行定量的柱状图。相比于DMSO处理条件，*Ρ <0.01和#P <0.05。图16b是显示出对在EGF (40ng/mL)和HGF (20ng/mL)加上DMSO或ABT-702 (15 μ M)存在的情况下生长的经分离鼠肝细胞的复制速率进行定量的柱状图。图16c是显示出在用BRDU以及辅料或ΑΒΤ-702处理24h后，对小鼠胰岛β细胞的体内复制速率进行定量的柱状图。图16d是显示出在用BRDU以及辅料或ABT-702处理24h后，对小鼠外分泌细胞的体内复制速率进行定量的柱状图。图16e是显示出在用BRDU以及辅料或ABT-702处理24h后，对小鼠肝细胞的体内复制速率进行定量的柱状图。误差棒表示标准差，使用双尾t检验得到P值。图17a和17b是显示出ADK-Is使得β细胞复制得以增加的柱状图。图17a显示出在用DMSO或5-ΙΤ (2μΜ)处理后，对β细胞复制进行的定量。通过I3DX-I的存在和胰岛素染色对β细胞进行鉴定。*Ρ<0.001。图1713显示出在用01^0、7-碘-2，3-二脱氧-7-脱氮腺苷(20 μ Μ、10 μ Μ)或芒霉素(6 μ Μ、1 μ Μ)处理后，对β细胞复制进行的定量。误差棒表不标准差。图18a是显示出利用PDX-1和磷酸化组蛋白_H3共表达对β细胞复制进行定量的柱状图。用DMS0、5-IT (2μΜ)或ABT-702 (15 μ Μ)对培养物进行处理。相比于DMSO处理条件，*Ρ < O. 001。图18b是显示出在DMS0、5-IT (2 μ Μ)或ABT-702 (15 μ Μ)存在的情况下利用两天BRDU脉冲，随后继续进行两天而无化合物处理，对β细胞复制进行定量的柱状图。以化合物处理的孔中BRDU+和Η)Χ-Γ细胞相比于DMSO处理的孔所增加的倍数示出数据。相比于 DMSO，*P < O. 002。
图19是显示出在注射对照siRNA或ADK导向的siRNA后，对ADK阳性胰岛细胞百分比进行自动定量的柱状图。误差棒表示标准差；*P < O. 001。图20是显示出用ABT-702对小鼠进行体内处理使β细胞复制得以增加、而不使外分泌细胞的复制增加的柱状图。使用胰岛素免疫染色来鉴定β细胞、并使用BRDU免疫染色来鉴定复制细胞(左图)，从而对体内的β细胞复制速率进行定量。同时，使用相同的组织切片对胰岛外的外分泌细胞的复制速率进行定量(右图)。图21描述了用于鉴定促进β细胞复制的化合物的筛选方案的示意草图。图22描述了示出SAHH抑制剂阿糖腺苷对β细胞增殖的影响的柱状图。图23是对ADK途径进行总览的示意图。
具体实施方式

本发明一方面提供了使胰腺细胞群中的β细胞复制得以增加的方法，所述方法包括用腺苷激酶(ADK)的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的抑制剂或AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化剂与胰腺细胞群或制备品进行接触。本文所使用的“使β细胞复制得以增加”意味着β细胞以更快的速率和/或更高的频率进行复制。在本发明的这一方面或其它方面的一些实施方式中，相对于未经处理的对照，β 细胞复制增加了至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1 倍、I. I 倍、I. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上。可通过测定与本文所述的化合物接触时发生复制的β细胞数目(相对于β细胞不与化合物接触的对照)，从而确定β细胞复制的增加百分比或增加倍数。复制的增加也可基于发生复制的细胞同分别处理的细胞和未经处理的对照中的细胞总数的比值。在一些实施方式中，经处理和未经处理的对照中的细胞总数被用来确定复制频率。在某些实施方式中，“使β细胞复制得以增加”也包括由于β细胞祖细胞分化成β细胞而引起的β细胞数的增加。在可选的实施方式中，“使β细胞复制得以增加”不包括由于β细胞祖细胞分化成β细胞而引起的β细胞数的增加。本文所使用的术语“ β细胞”包括原代胰腺β细胞；由去分化细胞衍生而来的胰腺β样细胞，所述去分化细胞例如诱导的多能干细胞(iPSCs);或者直接由内胚层起源的细胞(例如，肝细胞或外分泌的胰腺细胞)重编程而来的胰腺β样细胞。在一个实施方式中，β细胞不是永生化细胞系(例如在培养物中无限增殖)。在一个实施方式中，β细胞不是经转化的细胞、例如显示出转化特性(如在软琼脂上生长或不存在接触抑制)的细胞。本文所使用的术语“胰腺β样细胞”是指如下细胞表达出内源性胰腺β细胞所表达的胰岛素量的至少15%、或至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或至少约100%或者高于100%、例如是内源性胰腺β细胞所分泌胰岛素的量的至少约I. 5倍、或至少约2倍、或至少约2. 5倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或者高于约5倍。在一个实施方式中，胰腺β样细胞表现出内源性胰腺β细胞的至少一种或至少两种特性，例如但不限于作为对葡萄糖的响应而分泌出胰岛素，和表达β细胞标记物(例如c-肽、Pdx-I和glut-2)。本文中胰腺β样细胞有时是指“重编程β细胞”，本文中该术语可与术语“胰腺β样细胞”互换使用。在一个实施方式中，胰腺β样细胞不是永生细胞(例如在培养物中无限增殖)。在一个实施方式中，胰腺β样细胞不是经转化的细胞、例如显示出转化特性(如在软琼脂上生长或不存在接触抑制)的细胞。本文所使用的术语“去分化细胞(de-differentiated cell)”指的是由已分化细胞重编程的细胞。本文所使用的术语“经重编程”或“重编程”是指改变或逆转体细胞分化状态的方法。在重编程前，细胞可部分分化或终末分化。重编程涵盖了将体细胞分化状态完全逆转为多能细胞。分化作用的这种完全逆转产生了经诱导的多能(iPS)细胞。重编程还涵盖了分化状态的部分逆转，例如逆转至多功能状态(multipotent state)或逆转至既非多能也非多功能的体细胞(丧失了其所来源的已分化细胞的一种或多种特征的细胞)，例如由已分化细胞直接重编程至不同的体细胞类型。重编程通常包括改变(例如逆转)至少一些可遗传类型的核酸修饰(例如甲基化)、染色质凝聚、表观遗传变化、基因组印记等，上述作用发生在作为受精卵发育为成体的细胞分化期间。本文所述的方法可应用于由重编程(去分化)细胞衍生而来的胰腺β样细胞。例如，通过使用本领域技术人员已知的因子和条件分化成胰腺β样细胞的iPS细胞得到。也可通过对内胚层体细胞/外分泌体细胞直接进行重编程而无需逆转至多能干细胞状态(例 如，iPS细胞)来衍生得到胰腺β样细胞，例如在Zhou等，Nature，第455卷，2008年10月2日，第627-633页中所述，以引用的方式将其整体并入本文。本文所使用的术语“iPS细胞”和“诱导的多能干细胞”可以互换使用，是指由非多能细胞(通常为成年体细胞)人工衍生(即，去分化、重编程)得到的多能干细胞，例如通过诱导一个或多个基因的强制表达。本文所使用的术语“内源性胰腺β细胞”或者“原代胰腺β细胞”是指哺乳动物胰腺的产胰岛素细胞或者哺乳动物的胰腺β细胞表型的细胞。胰腺β细胞表型是本领域普通技术人员所公知的，包括例如作为对葡萄糖水平增高的响应而分泌胰岛素、表达出标记物(如C-肽、PDX-I多肽和Glut2)、以及显著的形态特征(如排布在体内胰腺的胰岛中、通常具有直径约9-15 μ m的小的纺锤样细胞)。可在胰岛中发现内源性胰腺β细胞。在本发明的方法中，作为胰岛的一部分，原代胰腺β细胞可在体外被接触。本文所使用的术语“产胰岛素细胞”包括本文所述的术语原代β细胞以及本文所述的术语胰腺β样细胞，所述“产胰岛素细胞”以组成型或可诱导型方式来合成(即，转录胰岛素基因、翻译胰岛素原mRNA、将胰岛素原mRNA修饰为胰岛素蛋白)、表达(即,表明由胰岛素基因携带的表型性状)或分泌(将胰岛素释放至胞外空间)胰岛素。本文所使用的术语“内胚层起源的细胞”是指包含由内胚层细胞发育而来的任何细胞在内的内胚层起源的细胞，是来自处于极早期胚胎中的三个原胚层之一的细胞，分化形成胚胎内脏、然后再形成呼吸道和消化道的内层以及肝脏和胰脏。对不同模型的生物体和人进行的研究提示出，在进化上保守的诱导信号和转录因子网络诱发了肝细胞和胰腺细胞的分化，并且对如何促进来自不同干细胞类型和祖细胞类型的肝细胞和β细胞分化提供了指导。在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，相对于未经抑制的对照，腺苷激酶的活性被抑制或被降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100% (即，完全丧失活性)。不希望受理论的束缚，可通过使用本领域已知的测定该类磷酸化反应的方法来测定腺苷的磷酸化，从而测定腺苷激酶的活性。在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，腺苷激酶抑制剂的IC50小于或等于500nM、小于或等于250nM、小于或等于ΙΟΟηΜ、小于或等于50nM、小于或等于ΙΟηΜ、小于或等于InM、小于或等于O. InM、小于或等于O. OlnM或者小于或等于O. OOlnM。在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，相对于未经活化的对照，AMP活化激酶的活性增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少I倍、至少I. I倍、至少I. 5倍、至少2倍、 至少3倍、至少4倍、至少5倍以上。在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，AMP活化激酶的活化剂的EC50小于或等于500nM、小于或等于250nM、小于或等于ΙΟΟηΜ、小于或等于50nM、小于或等于ΙΟηΜ、小于或等于InM、小于或等于0. InM、小于或等于0. OlnM或者小于或等于0. OOlnM。在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，相对于未经抑制的对照，SAHH的活性被抑制或被降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或者100% (即，完全丧失活性)。可使用例如下述文献中描述的方法测定SAHH的活性美国专利申请号10/836,953和11/389，393，以引用的方式将二者的内容并入本文。在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，SAHH抑制剂的IC50小于或等于500nM、小于或等于250nM、小于或等于ΙΟΟηΜ、小于或等于50ηΜ、小于或等于ΙΟηΜ、小于或等于InM、小于或等于0. InM、小于或等于0. OlnM或者小于或等于0. OOlnM。将认识到的是，本文所述的许多化合物可对细胞施加多重影响。例如，SAHH类似物和杀结核菌素在甲基化途径中的多个点发挥作用。因此，将化合物和分子分入某些组(例如ADK抑制剂或SAHH抑制剂)并非意在进行精确的、不重叠的科学分组。对这类信息进行阐明以协助本领域技术人员理解发明人所考虑的某些科学数据。例如，本文所述的许多ADK抑制剂也可作为SAHH抑制剂适合于本发明。在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，腺苷激酶抑制剂为式(I)及其药学上可接受的盐和酰胺
权利要求
1.一种使胰腺细胞群中的3细胞复制得以增加的方法，所述方法包括用腺苷激酶(ADK)的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的抑制剂或AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化剂与胰腺细胞群进行接触。
2.权利要求I中所述的方法，其中，所述腺苷激酶抑制剂为式(I)及其药学上可以接受的盐和酰胺
3.权利要求I中所述的方法，其中，所述腺苷激酶抑制剂为式(II)及其药学上可以接受的盐和酰胺
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述ADK抑制剂的IC50为小于或等于500nM、250nM、200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、lnM、0. lnM、0. 01nM、0. OOlnM0
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，相对于未被抑制的对照，所述ADK的活性被抑制或降低至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98% 或 100% (例如完全丧失活性)。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述ADK抑制剂选自于由下列化合物所组成的组芒霉素、5'-脱氧腺苷、5'-氨基腺苷、5'-脱氧-5-碘代杀結核菌素、5-碘代杀結核菌素(A10)、7-脱氮-7-碘-2'，3' - ニ脱氧腺苷、去甲芒霉素、去甲杀結核菌素、A-134974、丰加霉素、GP-515 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2-(4-氨基-3-溴-IH-吡唑并[3，4_d]嘧啶-I-基) -5-(氨基甲基)—四氢呋喃 _3，4- ニ醇)、GP-3269( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4- (4-氟苯基氨基)-5_苯基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-四氢-5-甲基呋喃-3，4-ニ醇)、GP-683 ( (2R, 3S, 4R, 5R)-四氢_2_甲基-5-(5-苯基-4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)呋喃-3，4- ニ醇)、GP-947( (2S, 3S, 4R, 5R)-四氢-2-甲基-5-(5-苯基-4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)呋喃-3，4- ニ醇)、ABT-702(5-(3-溴苯基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺，B8)、化合物I((2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3，4- ニ醇)、化合物 2 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3，4- ニ醇)、化合物3 ( (1S，2R, 3S, 5R) -3-氨基-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)环戊烷-1，2-ニ醇)、化合物4 ( (1S，2R，3S，5R)-3-氨基-5-(7-氨基-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶_3_基)环戊烷_1，2-ニ醇)、化合物5((IS, 2R, 3S, 4R) -4- (4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 ~7~ 基)环戊烷-I, 2，3-三醇)、化合物6( 7- (4- (ニ甲基氨基)苯基)蝶啶-4-胺)、化合物7( 5- (3-溴苯基)~7~ (4~ (ニ甲基氨基)苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物8(5-(2-溴苄基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物9(5-环己基-7-(6-吗啉代吡啶_3_基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物10 (5-(四氢-2H-吡喃-4-基)~7~ (6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物11(5-(I-(2-溴苯基)こ基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物12(5-(2-甲基戊-4-烯-2-基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物13 (N5-((1H-吲哚_3_基)甲基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4，5- ニ胺)、以及上述物质的组合。
7.权利要求I中所述的方法，其中，所述AMPK的活化剂为式(III)及其药学上可接受的盐和酰胺
8.权利要求I或7中所述的方法，其中，相对于未被活化的对照，所述AMP活化激酶的活性增加至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、I 倍、I. I 倍、I. 5 倍、2 倍、3 倍、4倍、5倍以上。
9.权利要求1、7和8中任一项所述的方法，其中，所述AMPK的活化剂的EC50小于或等于 500nM、250nM、100nM、50nM、10nM、lnM、0. lnM、0. OlnM 或 0. OOlnM0
10.权利要求I和7-9中任一项所述的方法，其中，所述AMPKI活化剂是5_氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷(AICAR)。
11.权利要求I中所述的方法，其中，所述SAHH的抑制剂的IC50小于或等于500nM、250nM、200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、lnM、0. lnM、0. 01nM、0. OOlnM。
12.权利要求I或11中所述的方法，其中，相对于未被抑制的对照，所述SAHH的活性被抑制或降低至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98% 或 100% (例如完全丧失活性)。
13.权利要求1、11和12中任一项所述的方法，其中，所述SAHH的抑制剂选自于由下列化合物所组成的组9(S)-(2，3-ニ羟基丙基)腺嘌呤[(S)-DHPA] ;D_香菇嘌呤；(R，S)-3-腺嘌呤-9-基-2-羟基丙酸[(R，S)-AHPA];腺苷(Ado) 二醛；3-脱氮腺苷(c3-Ado);芒霉素(Ari);瓶菌素A (NPA或NpcA) ;ニ羟基环戊烯基腺嘌呤(DHCeA) ;ニ羟基环戊烯基-3_脱氮腺嘌呤(c3-DHCeA) ; ニ羟基环戊烷基腺嘌呤(DHCaA) ; ニ羟基环戊烷基-3-脱氮腺嘌呤(c3-DHCaA) ;3_脱氮瓶菌素A (c3_NpcA) ;3_脱氮芒霉素(c3Ari);碳环-3-脱氮腺苷(C-c3Ado);6' -C甲基瓶菌素A ;2'-脱氧腺苷；杀結核菌素；利巴韦林；pyraazofurin ；2'-脱氧-2'-氯腺苷；异戍烯基腺苷；甲硫基腺苷(MTA) ；9-^ -阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤(Ara-A，阿糖腺苷);2'-脱氧腺苷；N_甲基芒霉素、8-氮杂芒霉素和3-脱氮芒霉素，以及它们的ニ醛和ニ醇衍生物；(±) -5-去甲芒霉素及其2，6- ニ氨基类似物；2'-脱氧芒霉素；3'-脱氧芒霉素；3'-氨基-3'-脱氧芒霉素；3'-氨基-3'-脱氧阿拉伯呋喃糖基-芒霉素；6'-羟基芒霉素；6'-巯基芒霉素；8'-溴芒霉素；8-羟基芒霉素、芒霉素-3'-环磷酸酷、芒霉素-6'-环磷酸酷；2-氟-S-腺苷同型半胱氨酸(2-FSAH) ；S-腺苷-L-同型半胱氨酸亚砜；S-腺苷-L-同型半胱氨酸砜；S_芒霉素-L-同型半胱氨酸；5' -S-(3-羰基-4-硝基苯基)硫代腺苷；5' -S-(甲基)-5' -S-(丁基)硫代腺苷；以及上述物质的任意組合。
14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞来自受试者，其中所述受试者需要额外的0细胞。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞来自受试者，其中所述受试者不需要额外的P细胞。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
17.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。
18.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者是小鼠。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞是原代胰腺细胞。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞由去分化细胞衍生。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述接触在体外进行。
22.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述接触离体进行。
23.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述接触在体内进行。
24.权利要求23所述的方法，其中，所述体内接触在哺乳动物体内进行。
25.权利要求24中所述的方法，其中，所述体内接触在小鼠体内进行。
26.权利要求24中所述的方法，其中，所述体内接触在人类体内进行。
27.权利要求23中所述的方法，其中，所述体内接触在受试者内进行，所述受试者需要额外的P细胞。
28.权利要求27中所述的方法，其中，所述受试者患有I型糖尿病。
29.权利要求27中所述的方法，其中，所述受试者患有2型糖尿病。
30.权利要求27中所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
31.权利要求27-30中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。
32.权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，相对于对照，^细胞复制增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1 倍、I. I 倍、I. 5 倍、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍以上。
33.一种用于对增加胰腺细胞群中的P细胞复制的化合物进行筛选的高通量分析方法，所述分析方法包括如下步骤 (a)用测试化合物与胰腺细胞群或胰腺细胞制剂进行接触，其中所述胰腺细胞是原代胰腺细胞； (b)对P细胞的复制或生长进行评价；以及(C)选择使3细胞的复制或生长得以增加或增强的化合物。
34.权利要求33中所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞在细胞培养容器中进行培养，所述容器的表面包被有来自大鼠膀胱癌细胞系804G的条件培养基。
35.权利要求33-34中任一项所述的分析方法，其中，对3细胞复制进行评价的步骤包括检测3细胞标记和细胞复制标记。
36.权利要求35中所述的分析方法，其中，所述细胞复制标记是Ki-67或PH3。
37.权利要求35-36中任一项所述的分析方法，其中，所述P细胞标记选自于由下列标记所组成的组rox-l、胰岛素、C-肽、胰淀素、E-钙粘着蛋白、Hnf3P、PCI/3、Beta2、Nkx2. 2、Nkx6. I、GLUT2、PC2、ZnT_8、MAFA、MAFB、以及上述标记的任意组合。
38.权利要求35-37中任一项所述的分析方法，其中，所述P细胞标记为H)X-1。
39.权利要求35-38中任一项所述的分析方法，其中，所述P细胞标记不是胰岛素。
40.权利要求33-39中任一项所述的分析方法，其中，所述测试化合物的浓度范围是0.InM 到 IOOOnM0
41.权利要求33-40中任一项所述的分析方法，其中，所述分析方法在约15°C到约55°C的温度范围下进行。
42.权利要求33-41中任一项所述的分析方法，其中所述测试化合物与所述胰腺细胞接触至少I个小时。
43.权利要求30-42中任一项所述的分析方法，其中，相对于未被处理的对照，所述测试化合物使P细胞的复制或生长增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、I. I倍、I. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上。
44.权利要求33-43中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞不是胰腺细胞系。
45.权利要求33-44中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞群是胰岛或其片段。
46.权利要求33-45中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞是原代胰腺@细胞。
47.权利要求33-46中任一项所述的分析方法，其中，在与所述测试化合物接触前，将所述胰腺细胞附着到所述细胞培养容器表面约12-48小吋。
48.权利要求33-47中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞由去分化细胞衍生。
49.权利要求33-48中任一项所述的分析方法，其中，所述去分化细胞是诱导的多能干细胞。
50.权利要求33-49中任一项所述的分析方法，其中，所述分析方法包括如下步骤 Ca)将胰岛用胰蛋白酶消化成1-3个细胞的细胞集落； (b)使细胞过夜恢复； (c)将从步骤(b)得到的细胞向96孔板的孔中点板，其中将所述孔用804G条件培养基包被，细胞点板密度为60k个细胞/孔； Cd)将细胞附着至所述孔的表面48小时； Ce)使测试化合物与所述P细胞接触24小时； Cf)用PDX-I抗体与Ki-67和/或PH3抗体对细胞进行染色；(g)对0细胞的复制进行评价；以及 (h)选择使P细胞复制得以增加或增强的化合物。
全文摘要
本发明提供了一种通过用腺苷激酶(ADK)的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的抑制剂或AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化剂与β细胞进行接触，从而使β细胞的复制或生长得以刺激或增加的方法。
文档编号C12N5/02GK102803474SQ201080064348
公开日2012年11月28日 申请日期2010年12月17日 优先权日2009年12月18日
发明者贾斯廷·P·安斯, 道格拉斯·A·梅尔顿, 李·L·鲁宾, 戈登·韦尔 申请人:哈佛大学校长及研究员协会, 布里格姆及妇女医院股份有限公司, 乔斯林糖尿病中心有限公司