专利名称：苯并噻二唑类化合物及其在植物细胞中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类新型苯并噻二唑化合物及其用途。
目前用于植物细胞培养中的诱导子主要有(1)糖蛋白类如在培养基中加入糖基化的氧化牛血清白蛋白(BSA)和氧化溶菌酶可使烟草叶产生抗原性尼克碱次生代谢产物的产量增加10倍(Lang L.，Aloj L.，Kiesewetter DO.，Nucl MedBiol，1996，23(6)，669～672)。(2)蛋白质类诱导子Jonathan等为了解酪胺代谢途径中某些酶的活性，使用果胶酶及链状蛋白酶作为诱导子来考察烟草细胞悬浮培养情况。(3)多糖类诱导子Daizo等用不同种诱导子分别作用于多种代表单子叶植物和双子叶植物的模型植物上，所用的诱导子有镰刀霉菌丝体、乙烯、水杨酸、几丁质和脱乙酰几丁质及其低聚糖。(4)微生物类诱导子通常是真菌诱导子。它们主要是菌类及生物提取物，真正意义上的人工设计、合成的有机小分子植物细胞诱导激活剂几乎为空白。
在植物细胞体外大规模培养中，紫杉醇的获取最为引人注目。紫杉醇(paclitaxel或taxol)是70年代首次从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中分离到的二萜烯类化合物(Wriekremesinhe E.R.M.，Arteca R.N.，J.Liq.Chromatogr.，1993，16(15)，3263-3274)。其化学结构独特、抗肿瘤效果显著。然而，红豆杉在自然界中生长缓慢且资源日趋匮乏。为了解决紫杉烷类化合物的长期供给问题，人们在红豆杉组织细胞培养领域做了不少工作，取得了一定进展(Japan Patent WO 95/14103；US Patent 5407816)。利用茉莉酮酸酯作为诱导子可有效提高云南紫杉烷(Tc)的生产量(钟建江，董浩迪，中国发明专利申请号00125305.0)。到目前为止，天然的茉莉酮酸酯被认为是最有效的紫杉烷类诱导激活剂。
本发明选取中国红豆杉(T.chinensis)细胞作为应用体系，从免疫激活剂噻二唑的结构出发，设计、合成新型植物细胞诱导激活剂，并且实验结果表明新的苯并噻二唑类化合物促进紫杉烷的生产能力高于甲基茉莉酮酸酯(MJA)。
本发明所说的化合物是一类新型的植物细胞诱导激活剂，其能促进植物细胞次生代谢产物的生长。实验表明本发明所说苯并噻二唑类化合物促进紫杉烷的生产能力类似或高于甲基茉莉酮酸酯(MJA)。
1HNMR(SF500MHz，DMSO-d6)δ(ppm)9.09-9.11(d，1H，J＝8.35Hz)，8.48-8.49(d，1H，J＝7.37Hz)，7.96-7.99(t，1H，J1＝8.25Hz，J2＝7.56Hz)，5.13-5.18(q，2H，J＝9.0Hz)。
HRMS，M+(m/e)262.0026(calc.262.0024)。
实施例2苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸-2，2，3，3，3-五氟丙酯(化合物2)的合成将由7-羧基苯并噻二唑(2.2mmol)制备的酰氯(酰氯的制备与实施例1相同)溶解甲苯中，搅拌下滴加到由五氟丙醇、甲苯和三乙胺组成的溶液中，滴加时间约1小时。继续室温反应5小时。将反应混合物倒到水中，乙酸乙酯萃取，稀K2CO3溶液洗涤、水洗，无水MgSO4干燥。过滤，浓缩，得棕色溶液，300-400目硅胶柱层析分离，得到淡黄色棱状晶体0.23克，收率33.5％，熔点79-80℃。1HNMR(SF500MHz，DMSO-d6)δ(ppm)9.10-9.12(d，1H，J＝8.12Hz)，8.44-8.45(d，1H，J＝7.32Hz)，7.98-8.01(t，1H，J1＝8.23Hz，J2＝7.57Hz)，5.22-5.27(t，2H，J＝13.47Hz)。HRMS，M+(m/e)311.9963(calc.311.9992)。
实施例3苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸-五氟苄酯(化合物3)的合成除五氟苄醇外其它反应条件同实施例1。得到淡黄色针状晶体0.42克，收率53.0％，熔点146-7℃。1HNMR(SF500MHz，DMSO-d6)δ(ppm)9.03-9.05(d，1H，J＝8.10Hz)，8.39-8.41(d，1H，J＝7.35Hz)，7.91-7.94(t，1H，J1＝7.65Hz，J2＝7.83Hz)，5.62(s，2H)。HRMS，M+(m/e)359.9983(calc.369.9992)。
实施例41-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-五氟苯甲酸乙二酯(化合物4)的合成(1)五氟苯甲酸乙二醇单酯的合成五氟苯甲酸(0.014mol)和乙二醇混合，搅拌下加入98％浓硫酸，100℃油浴加热5个小时。反应混合物倒入水中，搅拌下加入NaHCO3至无气泡。乙酸乙酯萃取，K2CO3溶液、水洗，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到无色粘状液体3.4克，收率94.9％。
(2)1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-五氟苯甲酸乙二酯的合成7-羧基苯并噻二唑(0.83mmol)制备的酰氯溶解于甲苯中，在室温条件下，滴加到五氟苯甲酸乙二醇单酯(0.93mmol)、甲苯和三乙胺组成的溶液中。继续反应5小时。将反应混合物倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，水洗，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到棕黄色液体，300-400目硅胶柱层析分离，得到的淡黄色粘状液体0.16克放置几天后形成白色固体，收率46.1％，熔点56-58℃。1HNMR，δ(ppm)9.04-9.06(d，1H，J＝8.37Hz)，8.41-8.43(d，1H，J＝7.30Hz)，7.94-7.97(t，1H，J1＝7.91Hz，J2＝7.62Hz)，4.79-4.80(t，2H)，4.75-4.76(t，2H)。
实施例51-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(2，4-二氯苯氧乙酸)-乙二酯(化合物5)的合成(1)2，4-二氯苯氧乙酸乙二醇单酯的合成2，4-二氯苯氧乙酸(0.01mol)和一定量乙二醇混合后，在搅拌下加入98％浓硫酸，油浴加热至浴温约120℃，维持反应2.5小时。冷却后倾入水中，底部有油状物。搅拌下加入NaHCO3，至无气泡生成。倾掉上层清液，再用稀NaHCO3溶液和水洗涤，溶于乙酸乙酯，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到无色粘状液体2.3克，收率86.8％。
(2)1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(2，4-二氯苯氧乙酸)-乙二酯的合成由0.2克(1.1mmol)7-羧基苯并噻二唑制备的酰氯(酰氯的制备与实施例1相同)溶解于4ml干燥的甲苯中，在室温条件下，滴加到有2，4-二氯苯氧乙酸乙二醇单酯0.3克1.1mmol)，干燥甲苯3ml和0.3ml三乙胺组成的溶液中，滴加时间约40分钟。然后继续反应20小时。将反应混合物倒入冰水中，乙酸乙酯30ml×2萃取，水洗两次，无水MgSO4干燥过夜，过滤浓缩后得到灰白色固体，乙酸乙酯重结晶得到0.26克白色晶体，收率55.5％；熔点119-120℃。1HNMR(SF500MHz，DMSO-d6)(ppm)9.04-9.06(d，1H，J＝8.29Hz)，8.34-8.35(d，1H，J＝7.26Hz)，7.91-7.94(t，1H，J1＝7.85Hz，J2＝7.85Hz)，7.42(s，1H)，7.12-7.14(d，1H，J＝8.96Hz)，7.05-7.07(d，1H，J＝8.98Hz)，4.99(s，2H)，4.62-4.64(t，2H，J1＝3.23Hz，J2＝3.51Hz)，4.55-4.57(t，2H，J1＝4.39Hz，J2＝3.95Hz)。HRMS，M+(m/e)425.9909(calc.425.9844)。
实施例61-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(2-羟基苯甲酸)-乙二酯(化合物6)的合成(1)乙酰水杨酸乙二醇单酯的合成乙酰水杨酸(0.02mol)和乙二醇混合，搅拌下加入一定量浓硫酸，100℃油浴反应1.5小时，冷却后倒入水中，NaHCO3中和，乙酸乙酯萃取，水洗两次，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到无色液体3.0克，收率67.0％。
(2)1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(2-羟基苯甲酸)-乙二酯的合成7-羧基苯并噻二唑(0.83mmol)制备的酰氯(酰氯的制备与实施例1相同)溶解于甲苯中，在室温条件下，滴加到有乙酰水杨酸乙二醇单酯(1.12mmol)、甲苯和三乙胺组成的溶液中。继续反应15小时。将反应混合物倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，水洗，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到无色油状液体，300-400目硅胶柱层析分离，得到的淡黄色粘状液体。再次柱层析分离，得到白色固体0.12克，收率42％，熔点92-94℃。1HNMR(SF500MHz，DMSO-d6)(ppm)10.38(s，1H，OH)，9.03-9.05(d，1H，J＝8.34Hz)，8.44-8.46(d，1H，J＝7.33Hz)，7.92-7.95(t，1H，J1＝7.46Hz，J2＝7.49Hz)，7.77-7.80(t，1H)，7.48-7.51(t，1H)，6.88-6.97(m，2H)，4.78-4.80(t，2H)，4.71-4.72(t，2H，)。HRMS，M+(m/e)344.0451(calc.344.0467)。
实施例71-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(1-萘乙酸)-乙二酯(化合物7)的合成(1)萘乙酸乙二醇单酯的合成萘乙酸(0.01mol)和乙二醇混合，搅拌下加入一定量浓硫酸，120℃油浴反应2.5小时，冷却后倒入水中，NaHCO3中和，乙酸乙酯萃取，水洗，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到淡黄色液体2.2克，收率95.7％。
(2)1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(1-萘乙酸)-乙二酯的合成7-羧基苯并噻二唑(0.83mmol)制备的酰氯(酰氯的制备与实施例1相同)溶解于甲苯中，在室温条件下，滴加到有萘乙酸乙二醇单酯(1.0mmol)、甲苯和三乙胺组成的溶液中，继续反应16小时。将反应混合物倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，水洗，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到无色油状液体，300-400目硅胶柱层析分离，得到的淡黄色粘状液体。再次柱层析分离，得到无色液体，加少量乙醚析出白色固体0.14克，收率43.0％，熔点111-113℃。1HNMR(SF500MHz，DMSO-d6)(ppm)9.01-9.03(d，1H，J＝8.51Hz)，8.11-8.12(d，1H，J＝7.30Hz)，7.89-7.91(t，1H，J1＝4.26Hz，J2＝5.15Hz)，7.82-7.85(t，1H)，7.73-7.75(d，1H)，7.73-7.74(d，1H)，7.70-7.71(d，1H)，7.40-7.42(d，1H)，7.32-7.35(m，3H)，4.57-4.59(t，2H)，4.46-4.48(t，2H)，4.16(s，2H)。HRMS，M+(m/e)392.0828(calc.392.0831)。
苯并噻二唑类化合物应用实施例(中国红豆杉细胞的培养，Tc的生产及测定方法参见钟建江，董浩迪，中国发明专利申请号00125305.0)实施例8采用从植株幼茎外植体诱导愈伤组织得到的中国红豆杉细胞。250mL摇瓶培养，采用MS培养基，另添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.2mg/L萘乙酸，100mg/L抗坏血酸及30mg/L蔗糖。
将真空过滤得到的5g湿细胞接种到含有50mL上述培养基的摇瓶中，在旋转式摇床转速为110rpm、25℃中暗培养。第一组作为对照；第二组在第7天添加化合物1至最终浓度为100μM，第三组在第7天添加化合物5至最终浓度为50μM，继续培养至第21天结束，收获细胞并在40℃干燥至恒重。实验结果表明，第一组细胞密度在第12天达到最高，为12.7g干重/L；第二组细胞密度在第15天达到最高，为12.2g干重/L，第三组细胞密度在第12天达到最高，为14.3g干重/L。细胞Tc分析结果如下表所示(*代表最大值)。第一组(对照)Tc含量Tc生产量培养时间(天) [mg·(g DW)-1] (mg·L-1)127.9±0.4 101.1±3.8157.6±0.2 94.2±5.31810.3±0.7*121.9±10.9*217.7±0.1 89.0±2.6第二组(化合物1)Tc含量 Tc生产量培养时间(天) [mg·(g DW)-1] (mg·L-1)12 13.0±0.8 195.0±4.615 10.5±0.0 127.1±3.318 19.8±1.5 225.7±15.521 21.3±0.3*228.3±2.2*第三组(化合物5)Tc含量Tc生产量培养时间(天)[mg·(g DW)-1](mg·L-1)12 7.2±0.8103.0±10.515 3.1±1.138.7±4.218 12.1±0.1 147.7±9.221 13.8±0.2*147.8±8.3*实施例9培养条件同实例8。第一组作为对照；第二组在第7天添加MJA化合物至100μM；继续培养至第21天结束。实验结果表明，细胞密度均在第12天达到最高，依次分别为15.3g干重/L、15.3g干重/L、13.9g干重/L。第三组Tc产量和生产率均在第18天达到最高，分别为427.4mg/L和30.2mg/(L·d)；而对照培养Tc最高产量(第21天达到)和最高生产率(第15天达到)仅为149.5mg/L和6.8mg/(L·d)。各组的Tc生产能力(以含量mg/g DW表示)见下表。第一组(对照)Tc含量Tc生产量培养时间(天) [mg·(g DW)-1] (mg·L-1) Tc生产率(mg·L-1·d-1)12 5.5±0.584.6±8.4 4.1±0.915 9.9±0.7137.0±6.56.8±0.2*18 10.4±0.8 126.7±11.3 5.1±0.721 14.0±0.1*149.5±4.5*5.4±0.2第二组(MJA诱导)Tc含量 Tc生产量 Tc生产率培养时间(天) [mg·(g DW)-1] (mg·L-1) (mg·L-1·d-1)12 25.7±0.2 393.9±1.529.9±0.3*15 30.3±2.1 400.2±29.9 24.3±2.218 33.7±1.6*402.0±22.5*20.4±1.421 32.4±0.8 332.5±29.3 14.1±1.5实施例10培养条件同实例8。第一组作为对照；第二组在第7天添加化合物6至100μM；第三组在第7天添加化合物7至75μM，继续培养至第21天结束。各组细胞密度和Tc分析结果如下表所示。
最大细胞密度 最高Tc含量 最高Tc生产量条件 (g DW·L-1) [mg·(g DW)-1] (mg·L-1)第一组(对照) 15.6±0.5(day 12)9.6±1.9(day 18)121.4±25(day 18)第二组(化合物6)16.2±0.2(day 12)39.4±3.3(day 21) 454.5±31(day 21)第三组(化合物7)13.1±0.2(day 21)17.6±0.4(day 21) 146.8±18(day 15)实施例11培养条件同实例8。第一组作为对照；第二组在第7天添加化合物2至100μM；第三组在第7天添加化合物3至100μM，继续培养至第21天结束。各组细胞密度和Tc分析结果如下表所示。
最大细胞密度 最高Tc含量 最高Tc生产量条件 (g DW·L-1) [mg·(g DW)-1](mg·L-1)第一组(对照) 15.1±0.3(day 12)13.7±1.4(day 21)153.6±12(day 21)第二组(化合物2)12.5±0.1(day 15)) 19.1±2.6(day 21)208.4±27(day 21)第三组(化合物3)15.3±0.5(day 12)17.6±0.4(day 21)204.0±4.8(day 21)
权利要求
1.一种苯并噻二唑类化合物，其特征在于，所说化合物具有如下结构式 式中R为CH2CH3，CH2CF3，CH2CF2CF3，C6H5CH2，(CH2)nOCOR1，(CH2)nOCOCH2OR1或(CH2)nOCOCH2OCH2OCOR1其中n＝1或2，R1为取代苯或取代芳稠杂环。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R为(CH2)nOCOR1，其中n＝2，R1为取代苯基。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R1为C6H5CH2。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R为(CH2)nOCOCH2OR1，其中n＝2，R1为取代苯基。
5.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，R1为氯代苯基或羟基取代苯基。
6.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R为(CH2)nOCOCH2OCH2OCOR1，其中n＝2，R1为萘卞基。
7.如权利要求1-6所述的任意一种化合物的应用，其特征在于，所述的化合物能促进植物细胞次生代谢产物生长，是植物细胞诱导激活剂。
全文摘要
本发明公开了一类苯并噻二唑类新化合物的结构及其在促进植物细胞次生代谢产物生长中用途，本发明选取中国红豆杉(T.chinensis)细胞作为应用体系，从免疫激活剂噻二唑的结构出发，设计、合成新型植物细胞诱导激活剂，实验结果表明发明人所设计、合成的苯并噻二唑类化合物的促进紫杉烷生产能力类似或高于现有的甲基茉莉酮酸酯。
文档编号C07D285/00GK1450057SQ03116948
公开日2003年10月22日 申请日期2003年5月16日 优先权日2003年5月16日
发明者钱旭红, 钟建江, 赵振江, 钱志刚, 徐玉芳, 田文红 申请人:华东理工大学, 大连理工大学