专利名称：利用靶信号产生引物进行的靶检测的制作方法
利用靶信号产生引物进行的靶检测
技术领域：
本发明涉及一种利用革巴信号产生引物(Target Signal Generating Primer)进行的靶核酸序列的检测。
背景技术：
用于检测靶核酸的大部分技术包括靶核酸的扩增过程。核酸扩增是在分子生物学领域中所利用的必不可少的过程，并对此提出了多种扩增方法。例如，密勒(Miller)、H. I.等(W089/06700)公开了包括将助催化剂/引物序列与靶单链DNA(〃ssDNA〃)进行杂交之后，转录上述序列的许多RNA复制过程的核酸序列扩增方法。其他公知的核酸扩 增方法包括基于转录的扩增系统(Kwoh，D. etal. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,86 :1173 (1989)；以及 GingerasT. R. etal.，W088/10315)。公知为聚合酶链式反应(以下简称为“PCR”)的最为广泛利用的核酸扩增方法包括双链DNA的变性、向DNA模板进行寡核苷酸引物的退火以及DNA聚合酶引起的引物延长的反复的循环过程(Mullis等，美国专利第4,683,195号，第4，683，202号以及第4,800,159号；Saiki 等，(1985) Science 230，1350-1354)。基于聚合酶链式反应(PCR)的技术不仅利用在靶DNA序列的扩增，还广泛地利用在生物学和医学研究领域中的科学应用或方法中，例如，反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)、分别表示(Differential Display)-聚合酶链式反应(DD-PCR)、公知或未知的利用基因的PCR的克隆、CD NA末端的高速扩增(RACE)、任意的引发-聚合酶链式反应(AP-PCR)、多重PCR、单核苷酸多态性(SNP)基因组分型以及基于PCR的基因组分析等(McPherson and Moller,(2000)PCR. BIOSS cientific Publishers,Springer-Verlag NewYork Berlin Heidelberg, NY)。另一方面，基于至今提出的核酸扩增的靶核酸检测方法进行如下概括。I.急行-聚合酶链式反应(post-PCR)检测方法典型的急行-聚合酶链式反应(post-PCR)方法包括核酸扩增及之后的扩增产物的检测，用于分析靶核酸序列。根据以往的急行-聚合酶链式反应(post-PCR)检测方法，应将扩增产物按其大小差异分离(通常利用凝胶电泳来实施)或通过扩增产物的固定化而分离。但是，分离过程会引起污染以及低工作性等严重的问题。2.实时检测方法为了克服急行-聚合酶链式反应(post-PCR)方法的问题，提出了实时检测扩增产物的实时PCR的方法，以此摆脱污染，能够定量地分析靶核酸序列。2.I基于标记引物的设计方法2.I. I发卡式引物的设计方法该方法利用发卡式引物(sunriseprimer),其通过在5’末端形成发夹环来使一对的突光团以及粹灭剂相邻近，从而表示出减少的突光。这样的引物包含(incorporated)在PCR的产物时，其尾部成为双链，并且其发夹环被解开，以此增加荧光(Nazarenko等，2516-2521NucleicAcids Research, 1997, v. 25no. 12，以及美国专利第 6，117，635 号)。但是，就发卡式引物设计方法而言，使引物包含与靶核酸序列互补的序列及能够在其5’末端形成发夹环的序列，这种设计非常复杂，因此大大降低了便利性。并且，对于引物而言，发夹环的存在将降低对靶核酸的杂交效率。2.I. 2蝎形引物设计方法该方法利用包含集成(integrated)信号系统的蝎形引物。上述引物具有模板结合区域以及尾部，尾部包含连接肽与祀结合区域(region)。祀结合区域在引物的延长产物中与互补的序列进行杂交。之后，靶特意杂交结果与信号系统连接，并且杂交引起可检测的变化。加尾引物的连接肽妨碍引物模板的尾部区域的聚合酶-介质链式复制(Whitcombe等，804-807，Nature Biotechnology v. 17 AUGUST 1999 美国专利第 6. 6，326，145 号)。加尾引物应包含用于产生扩增子-依赖性信号的连接肽及与引物延长产物杂交的靶结合区域，因此类似于发卡式引物方法，难以对引物进行设计以及合成。并且，对于引物而言，发夹环的存在将降低对靶核酸的杂交效率。2.I. 3单一标记引物设计方法(勒克司(Lux)方法)单一标记引物设计方法是利用包含单一荧光标记的引物的方法，通过观察与靶序列杂交的引物上的荧光特性的变化来检测靶序列(美国专利第7，537，886号)。并且，该方法为了有效地产生信号，引物应具有发夹-环结构。不仅如此，标记的种类、荧光标记周围的引物的序列、荧光标记在引物上的位置、周围其他成分等多种因素能使引物上的荧光特性改变，这致使弓I物设计的最优化难以实现。[2. I. 4里昂(Lion)方法(利用3，— 5，核酸酶活性)该方法利用在引物的3’末端人为的错配至少一个核苷酸的标记引物。在充分实现杂交的条件下培养标记引物以及试样，接着，试样暴露于具有3’ 一 5’校正活性的核酸聚合酶，以此放出标记或标记系统的一部分(美国专利第6,248,526号)。但是，错配引物需设计成复杂的形态，即在其3’末端包含错配核苷酸。更为困难的是，在3’ -末端与非-靶序列发生错配的情况下，错配的引物由具有3’ 一 5’校正活性的核酸聚合酶来产生假阳性信号的可能性也大。2.2基于标记探针的设计方法2.2. I 分子信标(Molecular beacon)方法虽然分子信标包含荧光以及猝灭染料，但是只有在猝灭染料与荧光染料邻近的情况下发生突光共振能量转移(FRET, fluorescence resonance energy transfer)。分子信标在溶液内单一存在时被设计成形成发夹结构，由此两个染料相邻近。分子信标与靶进行杂交时，荧光及猝灭染料将会分离。不发生荧光共振能量转移(FRET )，且荧光染料通过照射(irradiation)来发光(Indian J Med Res 124:385-398 (2006)以及 Tyagietal, NatureBiotechnologyv. 14MARCH 1996)。但是，分子信标方法存在如下几个缺点。第一、发夹结构的两个反向重复序列(inverted repeat)应在祀核酸具有互补的配对物，这在靶上也要求通常不存在于靶上的反向重复的存在。第二、具有互补的核酸序列的发夹结构的环部位的Tm以及茎区部位的Tm需仔细地保持均衡，这需从分析温度的观点保持均衡，其无需非特异性伸展Unfolding)，在存在靶的情况下使发夹探针可进行特异性伸展。最终，该方法为了扩增靶核酸序列需要追加的引物。2.2. 2杂交探针的设计方法该方法利用四个寡核苷酸，即为两个引物以及两个探针。这些杂交探针具有单一标记时，一个具有供体荧光团，另一个具有受体荧光团。两个探针的序列被选为，使这些序列以头尾排列方式(head to tail arrangement)与祀序列进行杂交,并使两个染料相邻近来发生荧光共振能量转移(FRET)。探针中一个探针的受体染料转移能量，另一个探针在其他波长放出荧光。荧光的量与在PCR过程中生成的靶DNA的量成正比例(385-398，IndianJ Med Res 124,review article 0ctober2006 以及303-308 以及Bernad等，147-148 ClinChem 2000 ;46)。但是，该方法不适合于多重检测，为了对靶核酸序列进行扩增，需要追加的引物。2.2. 3拖慢(TaqMan)探针方法(利用5’ 一 3’核酸酶活性)这些拖慢(TaqMan)探针制备成，能够在PCR产物的内部进行杂交。在PCR期间，即，聚合酶复制结合有拖慢(TaqMan)探针的模板时，聚合酶的5’外切核酸酶活性用于切割探针。这将分离荧光和猝灭染料，且不再发生荧光共振能量转移(FRET，fluorescenceresonance energy transfer)(385-398,Indian J Med Res 124,review article October2006以及303-308，美国专利第5,210,015号)。但是，该方法在利用三个寡核苷酸(一个双重标记探针以及两个引物)的方面具有限界点。该方法导致探针的设计、合成以及反应条件的最优化变得复杂。2.2.4自身-猝灭探针方法(利用5’ 一3’核酸酶活性)自身-猝灭探针方法利用具有与PCR产物的内部区域(region)杂交的序列的双重-标记探针(美国专利第5，723，591号)。与拖慢(TaqMan)探针方法相同，自身-猝灭探针方法为了能够进行同类试验(homogeneous assay)需要利用三个寡核苷酸(一个双重标记探针以及两个引物)。该方法导致探针的设计以及反应条件的最优化变得非常复杂。
如上所述，至今开发出的以往的大部分靶检测方法具有本质上的缺点，这将被视为难以克服。因此，需要开发出改善了技术性_、时间性-以及比容积-效率性的用于检测靶核酸序列的新颖的接近法。在本说明书全文中参照多个专利及文献，其引用由括号来表示。这些专利及文献，作为参照全部包括在本说明书中，因此能够更加明确地说明本发明所属的技术领域的水准及本发明的内容。发明概述本发明者为了解决用于实时检测靶核酸序列的以往技术的缺点而锐意研究努力。本发明者开发了在对于靶核酸序列的杂交及延长反应中依赖性地产生信号的新颖的TSG引物(Target Signal Generating Primer),并利用该TSG引物定立了用于检测祀核酸序列的多种方案。其结果，本发明者确认了，本发明的新颖的方案或者方法在靶核酸序列的检测，特别是在实时检测的方面呈现出优秀的工作性，并且不仅在液相还在固相中以更强、更快的方式产生用于表示靶核酸序列的信号。因此，本发明的目的在于提供一种利用TSG引物(Target Signal GeneratingPrimer),从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法。本发明的再一目的在于提供一种在扩增反应中利用TSG引物(Target SignalGenerating Primer),从DNA或者核酸混合物中检测祀核酸序列的方法。本发明的另一目的在于提供一种利用TSG引物(Target Signal GeneratingPrimer),从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒。参照所附的权利要求书以及附图，能够更加明确地说明本发明的其他目的及优点。
本发明的基本原理概括在图I-图4。图I表示关于利用TSG引物，来检测靶核酸序列的试验的步骤。图Ia表示具有用于检测靶核酸序列的常规结构的TSG引物的利用。图Ib表示，在靶核酸序列的检测中，为了确保引物退火特异性，具有双重引发寡核苷酸(DPO)结构的TSG引物的利用。图2表示利用本发明的TSG引物及不具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，以实时方式检测靶核酸的实时PCR扩增。图2a表示，为了实现实时PCR扩增，具有常规结构的TSG引物的利用。图2b表示，在实时PCR扩增中，为了确保引物退火特异性，具有双重引发寡核苷酸(DPO)结构的TSG引物的利用。图3表示利用本发明的TSG引物及具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，以实时方式检测靶核酸的实时PCR扩增。图3a表示，为了实施实时PCR扩增，具有常规结构的TSG引物的利用。图3b表示，在实时PCR扩增中，为了确保引物退火特异性，具有双重引发寡核苷酸(DPO)结构的TSG引物的利用。图4表示关于利用固定化在固相基质的TSG引物，来检测靶核酸序列的试验的步骤。图4a表示具有用于检测靶核酸序列的常规结构的TSG引物的利用。图4b表示在靶核酸序列的检测中，为了确保引物退火特异性，具有双重引发寡核苷酸(DPO)结构的TSG引物的利用。图5表示在无变性、杂交及引物延长的反复地实施核酸合成反应的过程中，通过利用不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶，仅依靠TSG引物的杂交 及延长来检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)的结果。图6表示在无变性、杂交及引物延长的反复地实施核酸合成反应的过程中，通过利用不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶，仅依靠TSG引物的杂交及延长来检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)的结果。图7表示利用TSG引物及不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶来检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)的实时PCR扩增的结果。图8表示利用TSG引物及不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶来检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)的实时PCR扩增的结果。图9表示利用TSG引物及不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶来检测淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的实时PCR扩增的结果。图10表示利用TSG引物及不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶来检测脑膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)的实时PCR扩增的结果。
图11表示利用TSG引物及不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶来检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)的实时PCR扩增的结果。图12表示在反复进行变性、杂交及引物延长来实施核酸合成反应的过程中，利用具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶或者利用不具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶产生从TSG引物发出的信号以及积累该信号的结果。图13表示利用TSG引物及具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶来检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)的实时PCR扩增的结果。图14表示利用TSG引物及具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶来检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)的实时PCR扩增的结果。图15表示利用TSG引物及具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶来检测淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的实时PCR扩增的结果。 图16表示利用TSG引物及具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶来检测脑膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)的实时PCR扩增的结果。图17表示利用TSG引物及具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶来检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)的实时PCR灵敏度的结果。发明详述本发明涉及一种利用具有双重标记系统的TSG引物(Target Signal GeneratingPrimer)以及模板-依赖性核酸聚合酶，以实时方式检测靶核酸序列的新颖的方法。根据本发明，如果被命名为TSG引物(Target Signal Generating Primer)的信号被猝灭状态的双重标记引物与靶核酸序列进行杂交，则发生信号不猝灭现象，接着上述双重标记引物被延长，以此合成对于靶核酸序列的互补的序列，最终能够检测用于表示革巴核酸序列存在的信号。S卩，在TSG引物上引起信号不粹灭的结构变化(conformationalchange)及3’ -延长反应均会发生。本发明者首次发现了，作为不具有如发夹环结构等任何变形的结构的引物的TSG引物通过进行杂交及引物延长，从猝灭状态转换为不猝灭状态就能够产生信号。TSG引物及利用该引物的实时方法由本发明者首次提出。TSG引物的优点之一为，TSG引物的3’ -末端的延长，能够抑制根据反应条件(例如，反应温度)的变化而发生的信号强度变化(variation)。TSG引物3’ -末端的延长能够使信号几乎或根本不受反应温度的变化，进而能够得到更可靠、更稳定的信号结果。尤其，TSG引物3’ -末端的延长能够使TSG引物扩增靶核酸序列。扩增反应，尤其对于基于PCR的实时检测方法而言，本发明的TSG引物不仅与信号产生有关，还与祀扩增有关，并且能够顺利达成对于祀序列的同类(homogeneous)试验。有趣的是，利用TSG引物的本发明的新颖的实时PCR检测方法以与通用的实时PCR接近法明显不同的方式起到作用，这克服了以往技术的缺点，并提高实时检测的有效性。与基于TSG引物的设计方法和分子信标以及TaqMan探针方法相同的以往基于探针的设计方法的最明显的区别之处在于，标记探针不扩增靶序列而仅产生靶信号，但是TSG引物则不仅能够产生靶信号，还能够扩增靶序列。基于探针的设计方法为了靶扩增还需要使用引物，这一点是与本发明有明确差异的事项。由于利用标记探针的以往的方法为了扩增靶序列还需要引物，因而难以实现探针设计、引物设计、序列的选择及反应的最优化。相反，由于TSG引物方法不另外需要探针，因而可以将这些问题最小化。并且,虽然TSG引物包含(incorporated)在延长产物或扩增产物内，但标记探针不包含在任何产物，所以虽然TGS引物方法能够直接测定扩增产物，但通过标记探针方法发出的信号则不直接反映扩增产物。并且，靶序列和标记探针的杂交随着标记探针及扩增产物的浓度而不同，这使得定量分析难以实现。即使为了提高定量分析的准确性，可以使用过量的标记探针，但引起高本底问题的可能性非常高。相反，TSG引物方法能够利用标记引物直接测定靶扩增，这以更高的准确性来实现靶序列的定量分析。另一方面，发卡式方法以及蝎形方法等几种以往的基于引物的实时检测方法，在与靶序列杂交之前，应具有用于猝灭荧光的发夹结构。但是，在基于标记引物的设计方法中，利用发夹结构不仅会降低杂交有效性还会 降低扩增有效性。并且，适用于标记引物的发夹结构需要追加的序列，因此，引物的设计及制造需要把靶互补序列以及发夹-形成序列全部考虑在内。在这种情况下，设计具有发夹结构的标记引物是难以实现的。相反，TSG引物无需发夹结构的帮助也能产生信号，可以克服因发夹结构随之产生的缺点。在对于产生信号的基本的机制的观点，利用引物的单一标记的勒克司(Lux)方法与利用引物的双重相互作用性标记系统的本发明是不同的。从引物的单一标记分子发出的信号可借助标记的种类、标记周围的引物的序列、引物上的标记的位置、周围其他因素等多种因素来改变，这被视为勒克司方法的缺点。如上所述，本发明的基于TSG引物的实时检测方法具有与以往基于引物及基于探针的设计方法有差别的一些技术特征(尤其是，产生信号的原理、寡核苷酸的结构及寡核苷酸的功能)。本发明的技术特征能够克服以往实时方法的界限，以更有效的方式检测出靶核酸序列。令人惊讶的是，本发明者发现借助具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶在与靶核酸序列杂交的引物的5’ -末端部位发生5’ -切割反应，在靶序列的检测中巧妙采用上述5’ -切割反应来产生对于靶序列的信号(参照PCT/KR2009/007064)。在5’-末端部位具有报道分子及猝灭分子的TSG引物与靶序列(即，模板)杂交时，借助具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，在其5’ -末端部位发生5’ -切割反应，之后，报道分子及猝灭分子互相隔开，这将引起TSG引物的信号不猝灭。发生5’ -切割反应的TSG引物的比例随着模板-依赖性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性、反应条件以及报道分子及猝灭分子之间的距离而不同。在利用具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶以及在5’ -末端部位具有报道分子或者猝灭分子的TSG引物时，考虑到发生5’ -切割反应，本发明能够以两种不同方式提供表示靶核酸序列存在的信号(i)借助根据与靶核酸序列的杂交产生的结构变化引起的，利用TSG引物上的相互作用性标记系统的信号不猝灭(unqunching)的信号产生；以及(ii)利用具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的借助TSG引物5’ -末端部位上的5’ -切割反应的信号产生。在利用具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的本发明中，优选地，5’ -切割反应仅在TSG引物的5’ -末端部位(更为优选地，为5’ -末端)与靶核酸序列互补时发生。根据本发明，能够以极大提高的有效性及可靠度来实时检测靶核酸序列。本发明者可知，这种科学结果以及技术战略由本发明者最初提出。根据本发明的一实施方式，本发明提供一种利用TSG引物(Target Sign alGenerating Primer)从DNA或者核酸混合物中检测祀核酸序列的方法,该方法包括以下步骤步骤(a)，使上述靶核酸序列与上述TSG引物进行杂交，上述TSG引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii )报道分子及猝灭分子；在上述TSG弓丨物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子猝灭(quenching)从上述报道分子发出的信号；在上述TSG引物与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭(unquenching)从上述报道分子发出的信号，由此能够得到表示上述靶核酸序列存在的信号； 步骤(b)，在引物延长条件下，将步骤(a)的结果物与模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，在上述TSG引物的3’ -末端发生3’ -延长反应；以及步骤(C)，对表示上述靶核酸序列存在的信号进行检测，由此，上述信号表示在DNA或者核酸混合物中存在靶核酸序列。本发明者为了克服以往靶核酸序列实时检测技术的问题而锐意研究努力。本发明者研制出了根据对于靶核酸序列的杂交以及延长能够产生信号的新颖的TSG引物(TargetSignal Generating Primer),利用该TSG引物定立了用于检测祀核酸序列的多种方案。其结果，本发明者确认了，本发明的新颖的方案或者方法，在靶核酸序列的检测，特别是在实时检测的方面呈现出优秀的工作性，而且不仅是在液相，在固相也能以更强、更快的方式产生用于表不祀核酸序列的信号。根据本发明，与靶核酸序列杂交的TSG引物具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性标记系统。在上述TSG引物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子猝灭(quenching)从上述报道分子发出的信号；相反，在上述TSG引物与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭(unquenching)从上述报道分子发出的信号，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信号。如此，TSG引物具有双重功能(i)产生对于靶核酸序列的信号；以及(ii)与靶核酸序列互补的序列的合成。因此，将本发明中利用的引物命名为“TSG引物(Target Signal GeneratingPrimer)”，据此将本发明的方法命名为“TSG引物祀检测试验(TSG primer TargetDetection Assay)，，。根据本发明，首先将靶核酸序列与TSG引物进行杂交。在本说明书中使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶序列”意味着所要检测的核酸序列，且，在杂交、退火或者扩增条件下与引物以及探针进行退火或者杂交。在本说明书中使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核酸链(模板)互补的引物延长产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA聚合酶等聚合剂的存在以及适合的温度与PH的条件下，可起到合成的起始点的作用。优选地，引物在扩增中作为具有最大有效性的单链。优选地，引物为寡脱氧核糖核苷酸。在本发明中利用的引物可包含自然(naturallyoccurring)脱氧单磷酸核苷(dNMP)(即，脱氧腺苷酸(dAMP)、dGMP (脱氧鸟苷酸)、dCMP (脱氧胞苷酸)及dTMP (脱氧胸苷酸))、变形的核苷酸或者非-自然核苷酸。并且，引物还可包含核糖核苷酸。就引物而言，应充分长，以便能够在聚合剂的存在之下引发延长产物的合成。引物的适合的长度取决于多个因素，例如，温度、应用领域及引物的根源(source)。在本说明书中使用的术语“退火”或“引发”意味着在模板核酸并置(apposition)寡脱氧核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互补的核酸分子。在本说明书中使用的术语“杂交(hybridization)”意味着互补的单链核酸形成双链核酸。杂交在两个核酸链之间完全互补时(perfect match)产生,或存在部分错配的(mismatch)碱基也会产生杂交。杂交所需的互补程度可随着杂交条件而不同，尤其可以根据温度进行调整。 在本说明书中使用的术语“退火”和“杂交”没有区分，在本说明书中混用。在本说明书中使用的术语“TSG引物”意味着能够进行自身-猝灭、自身-不猝灭以及延长的引物。尤其，在本发明中使用的TSG引物意味着能够产生用于表示与靶序列互补的序列的合成及靶核酸序列的存在的信号的双重-标记引物，在不与靶核酸序列杂交的情况下，将诱导相互作用性标记系统的猝灭，在与靶核酸序列杂交的情况下，将诱导相互作用性标记系统的不猝灭，最终，产生用于表示靶核酸序列存在的信号。本说明书中使用的术语“正向引物”意味着与向3’ 一 5’方向排列的靶核酸序列的单链互补的引物(5’ 一 3’方向)。反向引物在上述核酸序列的另一侧链上具有互补的序列。本说明书中，在提及TSG引物的报道分子及猝灭分子而使用的术语“三维地邻近(three-dimensionalIy adjacent)”意味着在没有如发夹环等引物的任何分子内结构的帮助下，报道分子及猝灭分子结构性地互相邻近。TSG引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii)双重相互作用性标记系统。在本说明书中使用的术语“互补的”意味着在预定的退火条件或者严格条件下引物以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地互补，并包含“实质上互补的(substantially complementary)，，及“完全互补的(perfectly complementary)，，的意义，优选地意味着完全互补的意思。选择性地，TSG引物在其5’ -末端还可包含与靶核酸序列非-互补的非-杂交核苷酸序列。优选地，上述靶信号产生引物的上述报道分子及上述猝灭分子中的一个位于非-杂交核苷酸序列，另一个位于杂交核苷酸序列。TSG引物的非-杂交核苷酸序列优选地不形成发夹-环结构，不参与如发夹-环等的分子内结构的形成。TSG引物的非-杂交核苷酸序列优选地不具有限制酶切位点(restriction site)。优选地，TSG引物不形成发夹-环结构。根据本发明的优选实例，双重标记系统位于TSG引物的靶互补序列。根据本发明的优选实例，TSG引物的5’ -末端或者5’ -末端部位具有与靶核酸序列完美互补的序列。
TSG引物具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性标记系统。上述相互作用性标记系统为能量非-放射性地(non-radioacively)传达到供体分子及受体分子之间的信号产生系统。作为相互作用性标记系统的代表性例子，荧光共振能量转移技术(FRET, fluorescence resonance energy transfer)标记系统包含突光报道分子(供体分子)及猝灭分子(受体分子)。在荧光共振能量转移技术中，能量供体为荧光性，但是，能量受体可以是荧光性或者非-荧光性。在相互作用性标记系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，为发色团(chromophore),能量受体为突光性。在相互作用性标记系统的另一形态中，能量供体为发光性，例如，生物发光性、化学发光性或者电化学发光性，受体为荧光性。优选地，用于表示靶核酸序列存在的信号借助双重相互作用性标记系统来产生，最优选为荧光共振能量转移(FRET)标记系统。将荧光共振能量转移(FRET)标记利用到TSG引物时，在两个标记(荧光报道分子 及粹灭分子)借助TSG引物与祀核酸序列杂交而具有延伸形态(stretch conformation)的情况下，互相隔开，发生信号的不猝灭。在TSG引物不与靶核酸序列杂交而具有扭曲形态(twist conformation)的情况下,两个标记互相邻近,发生信号的粹灭。在本说明书中，术语“猝灭”及“不猝灭”将被解释为相对的概念。例如，“不猝灭”与“猝灭”相比，猝灭效率或水准低。即，从报道分子发出的信号的猝灭并不仅仅意味着上述信号的完全消灭，而是具有包含与没有猝灭现象的情况相比较，信号相对减少的意思。并且，从报道分子发出的信号的不猝灭并不仅仅意味着上述信号的完全恢复，而是具有包含与有猝灭现象的情况相比较，信号相对增加的意思。如上所述，通过信号的猝灭程度的差异能够得到表示靶核酸序列的信号。例如，为了检测靶核酸而测定从上述荧光报道分子发出的相对荧光强度时，由于荧光报道分子及猝灭分子在空间上(或三维地)互相邻近，因此不与靶核酸序列杂交的TSG引物将表现出相对低的荧光强度(猝灭状态)。在TSG引物与靶核酸序列杂交的情况下，由于荧光报道分子及猝灭分子在空间上互相隔开，因而表现出相对高的荧光强度(不猝灭状态)。若能够发生上述猝灭-不猝灭转换现象，则报道分子及猝灭分子均可位于TSG引物的任何位点(site)。根据本发明的优选实例，报道分子及猝灭分子位于互相隔开4-50核苷酸的位置。根据本发明的优选实例，报道分子及猝灭分子将互相隔开最大50核苷酸，更为优选地，互相隔开最大40核苷酸，进而优选地互相隔开最大30核苷酸，最为优选地互相隔开最大25核苷酸。根据本发明的优选实例，报道分子及猝灭分子将隔开最少4核苷酸，更为优选地隔开最少6核苷酸，进而优选地隔开最少10核苷酸，最为优选地隔开最少15核苷酸。根据本发明的优选实例，TSG引物的报道分子及上述猝灭分子位于5’ -末端或者从5’-末端隔开1-5核苷酸的位置。例如，报道分子位于TSG引物的5’-末端或者从5’-末端隔开1-5核苷酸的位置，猝灭分子位于从报道分子隔开4-50核苷酸的位置。根据本发明的优选实例，TSG引物的报道分子位于5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-10核苷酸的位置，更为优选地位于5’ -末端。根据本发明的优选实例，TSG引物的猝灭分子位于5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-10核苷酸的位置，更为优选地位于5’ -末端。在本发明中利用的报道分子及猝灭分子可利用本发明所属技术领域中公知的任何标记。例如Cy2 (506)、YO-PROtm-I (509)、Υ0Υ0 -1 (509),Calcein (517),FITC (518)、FluorX (519),Alexa (520),Rhodamine I1 0(520)、5_FAM(522)'Oregon Green 500(522)、Oregon Green 488 (524)、RiboGreen (525)、Rhodamine Green (527)、Rhodaminel23(529),Magnesium Green (531),Calcium Green (533)、TO-PROtm-I (533),TOTOl (533)、JOE (548)、B0DIPY530/550 (550),Dil (565),BODIPY TMR (568)、B0DIPY558/568 (568)、B0DIPY564/570 (570)、Cy3 (570)、Alexa 546 (570)、TRITC (572)、Magnesium Orange (575)>Phycoerythrin R&B (575)、Rhodamine Phalloidin (575)、Calcium Orange (576)、PyroninY (580)、Rhodamine B (580)、TAMRA (582)、Rhodamine Red (590)、Cy3.5 (596)、ROX (608)、Calcium Crimson (615)、Alexa 594 (615)、Texas Red (615)、Nile Red(628)、Y0-PR0 -3 (631)、Y0Y0 -3 (631)、R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648)、T0-PR0 -3 (660)、T0T03 (660)、DiD DilC (5) (665)、Cy5 (670)、Thiadicarbocyanine(671)以及Cy5. 5 (694)。括号的数字为以纳米单位表示的最大发光波长。适合的一对报道分子-粹灭分子公开在如下的许多文献中Pesce等，editors,FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (MarcelDekker, NewYork, 1971) ；White 等，FLUORESCENCEANALYSIS APRACTICAL APPROACH (MarcelDekker, NewYork,1970) ；Berlman, HANDBOOK OFFLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES，2nd EDITION (AcademicPress, NewYork,1971) Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (AcademicPress,NewYork, 1976)；Bishop, editor, INDICATORS (PergamonPress, Oxford,1972) ；Haugland,HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALSCMolecular Probes,Eugene,1992) ；Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers,NewYork,1949)；Haugland, R. P. , HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCHCHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg. , 1996 ;美国专利第 3,996,345号以及第4,351,760号。本发明中，值得关注的是可以利用能够对广范围波长或者特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光黑猝灭分子。在应用于TSG引物的荧光共振能量转移(FRET)标记中，报道分子包含荧光共振能量转移(FRET)的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移(FRET)的剩余伙伴(受体)。例如，突光素染料(fluorescein dye)利用为报道分子,罗丹明染料(rhodamine dye)利用为粹灭分子。在与靶核酸序列杂交之后，为了延长与靶核酸序列杂交的TSG引物，在引物延长条件下，将步骤(a)的结果物与模板-依赖性核酸聚合酶进行接触。“在引物延长条件下”的内容意味着借助模板-依赖性核酸聚合酶在TSG引物的3’ -末端充分发生延长反应的条件。这些条件可遵循以往核酸聚合酶引起的引物延长所需的条件。例如，这些条件可在 Joseph Sambrook 等、Molecular Cloning、A LaboratoryManualsCoId Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor>N. Y. (2001)中石角认。如实施例所示，条件包含适当时间内在相对高温(例如，50°C -75V )下的靶核酸序列、TSG引物、热稳定性DNA聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶)、dNTPs及MgCl2的培养。
TSG引物的延长是本发明中非常重要的步骤。在借助TSG引物的延长反应生成延长产物的情况下，将引起包含在延长产物内的TSG引物序列和靶核酸序列的更为稳定的杂交。并且，TSG引物的延长反应使得TSG引物的标记包含于延长产物内，由此与扩增产物的量成正比例地增加信号的强度。本发明中发生的这种耦合现象能够实现更为准确的靶核酸序列的定量分析。根据本发明，与标记探针不同，在TSG引物自身与非-靶序列非-特异性地杂交的情况下，在如高温(例如，50°C -85°C )等严格条件(stringent conditions)下实施信号检测，由此有可能不产生任何假阳性信号。并且，TSG引物的延长能够扩增靶核酸序列，并可同时实现靶扩增和信号扩增。根据本发明，模板-依赖性核酸聚合酶均包含本发明所属技术领域公知的任何核酸聚合酶。本发明的重要优点之一为，在不具有核酸酶活性的情况下利用模板-依赖性核酸聚合酶产生IE信号。根据本发明的优选实例，本发明中所利用的模板-依赖性核酸聚合酶不具有核酸 酶活性。根据本发明的优选实例，本发明中所利用的模板-依赖性核酸聚合酶不具有5’ 一 3’核酸酶活性。本发明中所利用的模板-依赖性核酸聚合酶可以是任何核酸聚合酶，例如包含E. coli DNA聚合酶I的“克列诺(Klenow)”片段、热稳定性DNA聚合酶及噬菌体T7 DNA聚合酶。优选地，聚合酶为能够从多种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶。根据本发明的优选实例，本发明中所利用的模板-依赖性核酸聚合酶具有5’ 一 3’核酸酶活性，上述TSG引物的3’ -末端借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的聚合酶活性而延长，上述TSG引物的5’ -末端由上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’ 一3’核酸酶活性所切割，由此报道分子或猝灭分子被分离，产生用于表示靶核酸序列存在的信号。优选地，具有5’ 一3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶为热稳定性DNA聚合酶，这能够从多种细菌种得到，例如，包含Thermus aquaticus (Taq)、ThermusthermophiIus、Thermus filiformis、Thermus flavus、Thermus antranikianii、Thermuscaldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermusoshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05 以及 Thermus species sps 17。最为优选地，具有 5’ 一 3’ 核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶为Taq DNA聚合酶。有趣的是，本发明者发现仅仅通过将与靶核酸序列杂交的TSG引物与具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶接触，不仅其3’ -末端延长，而且其5’ -末端部位(例如，5’ -末端)将被切割。并且，TSG引物5’ -末端部位的切割反应将导致本发明的信号产生。概括地讲，本发明在与TSG引物的5’-切割反应相关联实施的情况下，本发明能够以两种不同方式提供表示靶核酸序列存在的信号(i)借助根据与靶核酸序列的杂交产生的结构变化来引起的，利用TSG引物上的相互作用性标记系统的信号不粹灭(unqunching)来产生信号；以及(ii)借助利用具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的TSG引物5’ -末端部位上的5’ -切割反应来产生信号。
根据本发明的优选实例，TSG引物在其5’ -末端或者5’ -末端部位具有与靶核酸序列相匹配的序列。在本说明书中提及TSG引物而使用的术语“5’ -末端部位”意味着，从TSG引物的5’ -末端包含某一长度的连续序列的部位或者区域。优选地，TSG引物的5’ -末端部位具有从5’-末端及从5’-末端隔开的包含1-10核苷酸的序列(更优选为1-7核苷酸，进而优选为1-5核苷酸，进一步优选为1-3核苷酸)。选择性地，本发明中可以利用具有3’ 一5’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸
聚合酶。根据本发明的优选实例，在利用具有3’ 一 5’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的情况下，TSG引物在其3’ -末端部位或者3’ -末端包含至少一个错配核苷酸序列。
根据本发明的优选实例，在TSG引物在其3’ -末端部位或者3’ -末端包含至少一个错配核苷酸序列的情况下，错配核苷酸序列不具有标记。错配核苷酸的数量为1-5，优选为1-4，更优选为1-3，进而优选为1_2，最优选为I。在引物中具有至少两个错配核苷酸的情况下，错配核苷酸可连续或非连续地定位。根据本发明的优选实例，在利用具有3’ 一 5’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的情况下，TSG引物在其3’-末端部位具有至少一个错配核苷酸，该错配核苷酸包含对模板-依赖性核酸聚合酶的3’ 一5’核酸酶活性具有耐性的主链(backbone)。根据本发明的优选实例，在利用具有3’ 一5’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的情况下，TSG引物在其3’ -末端具有包含对模板-依赖性核酸聚合酶的3’ 一5’核酸酶活性具有耐性的主链(backbone)的单一匹配-决定核苷酸(singlematch-determinant nucleotide)。TSG引物3’-末端的单一匹配-决定核苷酸只在与存在于相反链的匹配核苷酸杂交的情况下才形成碱基对。但是，在存在于相反链的核苷酸不与单一匹配-决定核苷酸互补的情况下，TSG引物的单一匹配-决定核苷酸不能形成碱基对。在本发明中，在TSG引物的3’ -末端不形成碱基-对的情况下，由于TSG引物3’_末端的单一匹配-决定核苷酸包含对3’一 5’核酸酶活性具有耐性的主链(backbone)，因而不发生切割反应，由此也不会发生延长反应。TSG引物的延长，与没有延长的TSG引物的情况相比能够提供与靶序列的更高稳定性的杂交。因此，通过调节温度，分析信号变化可以检测延长产物(即，靶序列)的存在。优选地，本发明对于检测核苷酸变异非常有用。更为优选地，在本发明中被检测的核苷酸变异为碱基置换，更优选为单核苷酸多态性(SNP, single nucleotidepolymorphism)及点突变。根据本发明的优选实例，可将核苷酸变异置于TSG引物3’ -末端的单一匹配-决定核苷酸的对面。对3’一 5’核酸酶活性具有耐性的主链(backbone)均包含本发明所属技术领域公知的任何主链。例如，上述核苷酸包含多种硫代磷酸酯键合(linkage)、磷酸酯键合、磷酰胺酯键合及2’-碳水化合物改性。根据本发明的优选实例，包含对3’一 5’核酸酶具有耐性的主链的核苷酸包含硫代磷酸酯合(phosphorothioate inkage)、烧基磷酸三酯键合(alkylphosphotriester linkage)、芳基憐酸三酉旨键合(aryl phosphotriester linkage)、烧基憐酸酯键合(alkyl phosphonate linkage)、芳基憐酸酯键合(aryl phosphonatelinkage)、氢磷酸酯键合(hydrogen phosphonate linkage)、烧基磷酰胺酯键合(alkylphosphoroamidate linkage)、芳基憐酉先胺酉旨键合(aryl phosphoroamidate linkage)、憐硒酸酯键合(phosphoroselenate linkage)、2’ _0_ 氨丙基改性(2，-O-aminopropylmodification)、〗’ -O-烧基改性(2，-0-alkyl modification)、〗’ -O-烯丙基改性(2，-0-allyl modification)、〗，-O-丁基改性(2，-0-butyl modification)、α -异头寡核苷酸(α -anomeric oligodeoxynucleotide)及 I- (4，-硫代-β -D-呋喃核糖基)改性(I- (4，-thio-β-D-ribofuranosyl) modification)。根据本发明的优选实例，具有3’ 一5’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶为热稳定性DNA聚合酶,这能够从多种细菌种得到，包含Thermococcus litoralis、Thermococcus barossi、Thermococcus gorgonarius、Thermotoga maritima、Thermotoganeapolitana、 Thermosipho africanus、 Pyrococcus furiosus(Pfu)、 Pyrococcuswoesei、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictium occultum、Aquifexpyrophilus以及Aquifex aeolieus的DNA聚合酶。最为优选地,具有3’一 5’核酸酶活性·的模板-依赖性核酸聚合酶为Pfu DNA聚合酶。根据本发明的优选实例，本发明为了扩增用于表示靶核酸序列存在的信号，在反复循环之间包括变性过程，还包括至少反复进行两次上述步骤(a)_步骤(b)或者步骤(a)_步骤(C)的步骤。反复循环次数没有特别限制，典型为至少2次，优选为至少5次，进而优选为至少10次。变性使通过步骤(b)中形成的双链二聚物变成单链核酸。关于变性的方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙醇酸处理、酶方法(例如，解旋酶反应)及结合蛋白质，但并不局限于此。例如，变性可以通过以80°C至105°C范围的温度进行加热而达成。用于达成这种处理的一般的方法提供在 Joseph Sambrook,等,Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)。最终，检测出表示靶核酸序列存在的信号。信号检测可在反复的各循环中(即，实时方式)、在反复的终点(即，终-点方式)或者在反复过程期间的各个预定时间间隔实施。优选地，信号检测在反复的各循环中实施，这能够提高检测的准确度。对各标记的信号可通过以往方法进行检测或测定。例如荧光信号可通过以往方法，例如利用荧光强度测定仪进行检测或测定。本发明的优点在信号检测步骤中也表现得明确。在如高温(例如，50°C -85°C )等高度严格条件(high stringent conditions)下实施信号检测的情况下,可完全去除与非-革巴核酸序列非特异性地杂交而产生的假阳性信号。根据本发明的优选实例，在由报道分子及猝灭分子组成的标记系统中通过对报道分子的信号的变化进行测定或分析来实施信号检测。根据本发明的优选实例，在猝灭分子为荧光的情况下，通过测定猝灭分子的信号变化或者猝灭分子及报道分子全部的信号变化来实施信号检测。根据本发明的优选实例，猝灭分子为荧光，所检测出的表示靶核酸序列存在的信号为从荧光猝灭分子发出的信号。本发明的突出的特点之一为，在液相以及固相都能成功地取得信号。本发明的方法大体上可以在两种相，即液相以及固相中实施。I.在液相中的靶检测I.利用TSG引物及核酸聚合酶的靶检测根据第一方案，利用TSG引物及模板-依赖性核酸聚合酶检测靶核酸序列(参照图Ia及图lb)。第一方案包括如下步骤步骤(a)，使上述靶核酸序列与上述TSG引物进行杂交，上述TSG引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii )报道分子及猝灭分子；在上述TSG弓丨物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地互 相邻近，上述猝灭分子猝灭(quenching)从上述报道分子发出的信号；在上述TSG引物与靶 核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭(unquenching)从上述报道分子发出的信号，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信号；步骤(b)，在引物延长条件下，将步骤(a)的结果物与模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，在上述TSG引物的3’ -末端发生3’ -延长反应；以及步骤(C)，对表示上述靶核酸序列存在的信号进行检测，由此，上述信号表示在DNA或者核酸混合物中存在靶核酸序列。根据本发明的优选实例，步骤(C)的信号检测以实时方式、终-点方式或者预定时间间隔方式来实施。2.利用TSG引物以及具有5’一 3’核酸酶活性的核酸聚合酶的靶检测根据第二方案，利用TSG引物以及具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶检测靶核酸序列。优选地，第二方案包括如下步骤步骤(a)，使上述靶核酸序列与上述TSG引物进行杂交，上述TSG引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii )报道分子及猝灭分子；在上述TSG弓丨物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子猝灭(quenching)从上述报道分子发出的信号；在上述TSG引物与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭(unquenching)从上述报道分子发出的信号，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信号；步骤(b)，在引物延长及切割条件下，将步骤(a)的结果物与具有5’一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，在上述TSG引物的3’ -末端发生3’ -延长反应，在上述TSG引物的5’ -末端发生5’ -切割反应，由此上述报道分子或上述猝灭分子从上述TSG引物被放出，并产生用于表不祀核酸序列存在的信号；以及步骤(C)，对表示上述靶核酸序列存在的信号进行检测，由此，上述信号表示在DNA或者核酸混合物中存在靶核酸序列。根据本发明的优选实例，本发明在反复循环之间包括变性过程，还包括至少反复进行两次上述步骤(a)_步骤(b)或者步骤(a)_步骤(C)的步骤，以便扩增用于表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的优选实例，步骤(C)的信号检测以实时方式、终-点方式或者预定时间间隔方式来实施。3.利用TSG引物、配对引物以及核酸聚合酶的靶检测本发明的第三方案利用(i )模板-依赖性核酸聚合酶以及(i i )由能够扩增靶核酸序列的TSG弓丨物及该TSG弓丨物的配对引物(counterpart primer )组成的一对弓I物来检测革巴核酸序列，该方案在扩增用于表示这种靶核酸序列存在的信号的同时还扩增靶(参照图2a及图2b)。配对引物可以是TSG引物也可以不是。优选地，该第三方案通过利用TSG引物(Target Signal Generating Primer)的 扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列，该方案包括如下步骤步骤(a)，使包含作为能够对上述靶核酸序列进行扩增的正向引物以及反向引物的两个引物的一对引物与上述靶核酸序列进行杂交；在上述两个引物中至少一个是TSG引物；上述TSG引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii)报道分子及猝灭分子；在上述TSG引物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子猝灭从上述报道分子发出的信号；在上述TSG引物与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭从上述报道分子发出的信号，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信号；步骤(b)，在引物延长条件下，将步骤(a)的结果物与模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，在上述两个引物的3’ -末端发生3’ -延长反应；步骤(C)，使步骤(b)的结果物发生变性；步骤(d)，至少反复两次上述步骤(a)-步骤(c)，对上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的信号均进行扩增；以及步骤(e)，用于检测表示上述靶核酸序列存在的信号；上述信号检测在步骤(d)的上述反复的各循环中、在步骤(d)的上述反复的终点或者上述反复期间的各个预定时间间隔内实施，这些信号表不祀核酸序列的存在。4.利用TSG引物、配对引物以及具有5’一 3’核酸酶活性的核酸聚合酶的靶检测本发明的第四方案利用(i)具有5’一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶以及(ii )由能够扩增祀核酸序列的TSG弓丨物及该TSG弓丨物的配对引物(counterpart primer)组成的一对引物来检测靶核酸序列，该方案在扩增用于表示这种靶核酸序列存在的信号的同时还扩增靶(参照图3a以及图3b)。优选地，第四方案包括如下步骤步骤(a)，使包含作为能够对上述靶核酸序列进行扩增的正向引物以及反向引物的两个引物的一对引物与上述靶核酸序列进行杂交；在上述两个引物中至少一个是TSG引物；上述TSG引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii)报道分子及猝灭分子；在上述TSG引物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子猝灭从上述报道分子发出的信号；在上述TSG引物与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭从上述报道分子发出的信号，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信号；步骤(b)，在引物延长及切割的条件下，将步骤(a)的结果物与模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，在上述TSG引物的3 ’ -末端发生3 ’ -延长反应，在上述TSG引物的5 ’ -末端部位发生5’-切割反应，由此上述报道分子或上述猝灭分子从上述TSG引物被放出，并产生用于表不IE核酸序列存在的信号；步骤(C)，使步骤(b)的结果物发生变性；步骤(d)，至少反复两次上述步骤(a)-步骤(c)，对上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的信号均进行扩增；以及步骤(e)，用于检测表示上述靶核酸序列存在的信号；上述信号检测在步骤(d)的上述反复的各循环中、在步骤(d)的上述反复的终点或者上述反复期间的各个预定时间间隔内实施，这些信号表不祀核酸序列的存在。 [II.固相中的靶检测本发明的突出的优点是即使在像微陈列的固相中也能够非常有效地检测靶核酸序列。根据本发明的优选实例，本发明在固相中实施，TSG引物通过其5 ’ -末端在固相基质的表面实现固定化。I.利用TSG引物以及核酸聚合酶的芯片上(On-Chip)靶检测根据第一固相方案，在固相中利用TSG引物以及模板-依赖性聚合酶来检测靶核酸序列(参照图4a及图4b)。优选地，第一方案包括如下步骤步骤(a)，使上述靶核酸序列与上述TSG引物进行杂交，上述TSG引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii)报道分子及猝灭分子；上述TSG引物通过其5’ -末端在固相基质的表面实现固定化；在上述TSG引物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子粹灭(quenching)从上述报道分子发出的信号；在上述TSG引物与祀核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭(unquenching)从上述报道分子发出的信号，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信号;步骤(b)，在引物延长条件下，将步骤(a)的结果物与模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，在上述TSG引物的3’ -末端发生3’ -延长反应；以及步骤(C)，在上述固相中对表示上述靶核酸序列存在的信号进行检测，由此，上述信号表示在DNA或者核酸混合物中存在靶核酸序列。2.利用TSG引物、配对引物以及核酸聚合酶的芯片上(On-Chip)靶检测本发明的第二固相方案利用(i)模板-依赖性核酸聚合酶以及(ii)由能够扩增靶核酸序列的TSG引物及该TSG引物的配对引物(counterpart primer)组成的一对引物来检测靶核酸序列，该方案在扩增用于表示这种靶核酸序列存在的信号的同时还扩增靶。S卩，第二固相方案能够实现芯片上实时PCR技术。优选地，第二固相方案包括如下步骤
步骤(a)，使包含作为能够对上述靶核酸序列进行扩增的正向引物以及反向引物的两个引物的一对引物与上述靶核酸序列进行杂交；在上述两个引物中至少一个是TSG引物；上述TSG引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii)报道分子及猝灭分子；上述两个引物中的至少一个通过其5’ -末端在固相基质的表面实现固定化，实现固定化的上述引物为TSG引物；在上述TSG引物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子猝灭(quenching)从上述报道分子发出的信号；在上述TSG引物与祀核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭(unquenching)从上述报道分子发出的信号，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信号;步骤(b)，在引物延长条件下，将步骤(a)的结果物与模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，在上述两个引物的3’ -末端发生3’ -延长反应；步骤(C)，使步骤(b)的结果物发生变性； 步骤(d)，至少反复两次上述步骤(a)_步骤(C)，对上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的信号均进行扩增；以及步骤(e)，用于检测表示靶核酸序列存在的信号；上述信号检测在步骤(d)的上述反复的各循环中、在步骤(d)的上述反复的终点或者上述反复期间的各个预定时间间隔内实施，这些信号表示靶核酸序列的存在。根据本发明的优选实例，上述TSG引物通过其5’ -末端在固相基质的表面实现固定化，另一个引物则未被固定化，也不是TSG引物。根据本发明的优选实例，TSG引物及配对引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸(DPO)结构5，-Xp-YfZr-3，(I)上述通式中，Xp为具有与靶核酸互补的杂交核苷酸序列的5’ -第一次引发部位(5，-first priming portion) ;Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位(separationportion) ;Z,为具有与靶核酸互补的杂交核苷酸序列的3’ -第二次引发部位(3’ -secondpriming portion) ;p、q以及r表示核苷酸的数量,X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm ;上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引发部位从上述3’ -第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’ -第一次引发部位以及上述3’ -第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述引物的整体退火特异性得到提高。双重引发寡核苷酸(DPO)结构为双重特异性寡核苷酸(DS0, dual specificityoligonucleotide)的引物形态，首次由本发明者所提出(W0 2006/095981 ;Chun等,Dualpriming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratoryviruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research，35 :6e40(2007))o双重引发寡核苷酸(DPO)体现杂交或退火借助分离区域相互分离的5’ _高Tm特异性部位(或者5’ -第一次引发部位)及3’ -低Tm特异性部位(或者3’ -第二次引发部位)双重性地决定的新颖的概念，表示出非常惊人的杂交特异性(参照WO 2006/095981 ；Kim 等，Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants bymultiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of VirologicalMethods,149 :76-84 (2008) ；Kim 等，Rapid detection and identification of 12respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplexPCR assay, Journal of Virological Methods, doi 10.1016/j.jviromet. 2008. 11. 007(2008);Horii 等，Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplexsexualIy transmitted pathogens in clinical specimens,Letters in AppliedMicrobiology, doi :10. 111/j. 1472-765X2009. 02618x (2009))。如上所述，双重引发寡核苷酸(DPO)最终获得具有相互不同的杂交特性的两个引物片段，其为如下造成初期的稳定的杂交的5’ -第一次引发部位及决定靶特异性的3’ -第二次引发部位。在利用具有本发明的上述DPO结构的引物进行扩增(尤其，进行多重扩增)的情况下，可无假阳性或者假阴性结果地成功获得扩增子。根据本发明的优选实例，位于分离部位的通用碱基选自包含脱氧肌苷 (deoxyinosine)、肌苷(inosine)、7_ 去氮-2，-脱氧肌苷(7-deaza_2，-deoxyinosine)、2-氮杂-2’ -脱氧肌苷(2_aza_2’ -deoxyinosine)Λ2^ -甲氧基肌苷(2’ -OMe inosine)、2’ -F 肌苷(2’ -F inosine)、脱氧 3-硝基卩比咯(deoxy 3-nitropyrrole)、3-硝基 P比咯(3-nitropyrrole)、2，-甲氧基 3_ 硝基卩比咯(2，-0Me3-nitropyrrole)、2，_F3_ 硝基吡咯(2’ -F 3-nitropyrrole)U- (2’ -脱氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(I- (2，-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)、脱氧 5_ 硝基批咯(deoxy5_nitroindole)、5-硝基口引哚(5_nitroindole)、2’ -甲氧基 5-硝基口引哚(2，-OMe5_nitroindole)、2’ -F5-硝基口引哚(2，-F 5_nitroindole)、脱氧 4-硝基苯并咪唑(deoxy4-nitrobenzimidazole)λ4-硝基苯并咪唑(4_nitrobenzimidazole)、脱氧 4_ 氨基苯并咪唑(deoxy 4-aminobenzimidazole)、4_ 氨基苯并咪唑(4_aminobenzimidazole)、脱氧水粉蕈素(deoxy nebularine)、2’ -F 水粉蕈素(2’ -F nebularine)、2’ -F 4_ 硝基苯并咪唑(2’ -F4_nitrobenzimidazole)、妝核酸 _5_ 硝基卩引哚(PNA-5-nitroindole)、妝核酸-水粉蕈素(PNA-nebularine)、肽核酸-肌苷(PNA-inosine)、肽核酸_4_硝基苯并咪唑(PNA-4-nitrobenzimidazole)、妝核酸 _3_ 硝基卩比咯(PNA-3-nitropyrrole)、吗啉基 _5硝基卩引哚(morpholino-5-nitroindole)、吗啉基 _ 水粉蕈素(morpholino-nebularine)、吗啉基-肌苷(morpholino-inosine)、吗啉基-4-硝基苯并咪唑(morpholino-4-nitrobenzimidazole)λ 吗啉基-3-硝基卩比咯(morpholino-3-nitropyrrole)、氨基磷酸酯_5_硝基卩引哚(phosphoramidate-5-nitroindole)、氨基磷酸酯-水粉蕈素(phosphoramidate-nebularine)、氨基憐酸酉旨-肌苷(phosphoramidate-inosine)、氨基憐酸酯_4_硝基苯并咪唑(phosphoramidate-4-nitrobenzimidazole)、氨基憐酸酯_3_硝基批咯(phosphoramidate-3-nitropyrrole)、2’ -O-甲氧基乙基肌苷(2’ -0-methoxyethylinosine)、2，-O-甲氧基乙基水粉蕈素(2’ 0-methoxyethyl nebularine)、2’ -O-甲氧基乙基5_硝基卩引哚(2’ -0-methoxyethyl 5_nitroindole)、2’ -O-甲氧基乙基4_硝基-苯并咪唑(2’ -0-methoxyethyl 4-nitro_benzimidazole)、2’ -O-甲氧基乙基 3_ 硝基卩比咯(2’ -0-methoxyethyl 3-nitropyrrole)及上述碱基的组合的群。更优选地，位于分离部位的通用碱基为脱氧肌苷(deoxyinosine)、肌苷(inosine)、I- (2’ -脱氧-β -D-呋喃核糖)-3-硝基卩比咯(I- (2，-deoxybeta-D-ribofuranosyl) -3-nitropyrroIe)或者 5-硝基口引哚(5_ni troindole),最优选为脱氧肌苷(deoxy inosine)。优选地，上述分离部位包含具有至少三个通用碱基的连续的核苷酸，更优选为至少四个通用碱基，最优选为至少五个通用碱基。优选地，双重引发寡核苷酸(DPO)的结构的5’ -第一次引发部位的长度比3’ -第二次引发部位的长度更长。上述5’-第一次引发部位优选地具有15-60核苷酸的长度，更优选地具有15-40核苷酸的长度，进而优选地具有15-25核苷酸的长度。优选地，上述3’-第二次引发部位具有3-15核苷酸的长度，更优选地具有5-15核苷酸的长度，进而优选地具有6-13核苷酸的长度。优选地，上述分离部位具有3-10核苷酸的长度，更优选地具有4-8核苷酸的长度，最优选地具有5-7核苷酸的长度。根据本发明的优选实例，上述5’-第一次引发部位具有40°C -80°C的Tm，更优选地具有45°C _65°C的Tm。上述3’ -第二次引发部位优选地具有10°C -40°C的Tm。上述分离部位优选地具有3°C -15°C的Tm。 根据本发明的优选实例，上述3’ -第一次引发部位具有4(TC-80t^^Tm，更优选地具有45°C -65°C的Tm。上述5’ -第二次引发部位优选地具有10°C _40°C的Tm。上述分离部位优选地具有3°C -15°C的Tm。根据本发明的优选实例，在本发明的上述扩增中所利用的两个引物都具有双重引发寡核苷酸(DPO)结构。利用引物检测靶核酸序列的以往技术，因所使用的引物以及探针的内在的局限性，并不能完全去除错误信号。但是包含这种刻意设计的双重引发核苷酸(DPO)结构的引物，以戏剧性地提高的特异度与靶核酸序列杂交，以便无错误信号地检测出靶核酸序列。在本发明中涉及引物而使用的术语“常规的”意味着不具有双重引发核苷酸(DPO)结构的所有引物。这些在本说明书中被解释为常规弓I物。根据本发明的优选实例，上述报道分子及上述猝灭分子中的一个位于上述5’ -第一次引发部位，另一个位于上述5’ -第一次引发部位、上述3’ -第二次引发部位或者上述分离部位。本发明对要检测和/或扩增的靶核酸序列不需要任何特定序列或者长度。将mRNA利用为初期物质时，在实施退火步骤之前需要进行反转录步骤，对此的详细内容公开在 Joseph Sambrook,等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001);及 Noonan, K. F.等，Nucleic Acids Res. 16 :10366 (1988)。为了反转录反应，可利用与随机六聚体或者mRNA杂交的寡核苷酸dT引物。寡核苷酸dT引物由dTMPs构成，且在dT弓丨物可以起到引物作用的范围内其dTMPs的一个或者其以上可由其他脱氧单磷酸核苷(dNMP)来代替。反转录可以由具有核糖核酸酶(RNase H Ribonuclease H)活性的反转录酶来实施。利用具有核糖核酸酶(RNaseH Ribonuclease H)活性的酶时,慎重地选择反应条件,从而可以省略额外的核糖核酸酶(RNase H Ribonuclease H)切割过程。尤其，在本发明中可检测及/或扩增的靶核酸序列还都包含任何自然(naturallyoccurring)原核细胞核酸、真核细胞(例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物)核酸、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS)、流感病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等)核酸或者类病毒核酸。能够同时检测(多重检测)出至少两个靶核酸序列，从这一点上更能显示出本发明的优点。根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，TSG引物包含至少两种引物(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)。根据本发明的优选实例，与TSG引物成对且能够扩增靶核酸序列的配对引物包含至少两种引物(更优选为三种，进而优选为5种)。例如，在利用包含五种TSG引物(是包含具有各个不同发光波长的荧光报道分子的TSG引物)、五种配对引物以及核酸试样的反应容器实施本发明的情况下，产生相当于五种不同的靶核酸序列的五种不同的荧光信号，以实时方式同时检测五种不同的靶核酸序列。在此情况下，可将所使用的猝灭分子选择为均具有各自互相不同的特性。选择性地，可 将所使用的猝灭分子选择为全部或一部分具有相同的特性。并且，本发明对核苷酸变异的检测而言非常有用。在本发明中使用的术语“核苷酸变异”意味着在连续的DNA片段或者序列类似的DNA片段中存在于特定位点的DNA序列的核苷酸的多样性。这种连续的DNA片段包含一个基因或者一个染色体的任意其他部位。例如，可以通过本发明的方法而检测的核苷酸变异包括单核苷酸多态性(SNP，single nucleotide polymorphism)、缺失、插入、置换及易位。核苷酸变异的例子包括人类基因组的多种变异(例如，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR, methyIenetetrahydrofolatereductase)基因的变异)、药物耐性病原体的核苷酸变异及癌产生_相关核苷酸的变异。根据本发明的优选实例，在本发明中所使用的靶核酸序列为预-扩增的(pre-ampIified)核酸序列。利用预_扩增的核酸序列能够使得本发明的祀检测的灵敏度以及特异性大大增加。对少量的靶核酸序列以适当的水准进行预-扩增，接着根据本发明来进行检测，就会提高本发明的靶检测的灵敏度以及特异性。有趣的是，在利用与位于在预-扩增中利用的引物的下游的序列杂交的TSG引物的情况下，上述TSG引物将起到套式弓I物的作用来增加本发明的靶检测的特异性。根据本发明的优选实例，在为了利用扩增反应来检测靶核酸序列而在本发明中利用预-扩增的核酸序列的情况下，本发明中所使用的引物对为用于套式扩增的引物对。根据本发明的另一实施方式，本发明提供利用TSG引物(Target SignalGenerating Primer)从DNA或者核酸混合物中检测祀核酸序列的试剂盒,包括(a) TSG引物；上述TSG引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii)报道分子及猝灭分子；在上述TSG引物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子猝灭从上述报道分子发出的信号；在上述TSG引物与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述TSG引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭(unquenching)从上述报道分子发出的信号，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信号；以及(b)模板-依赖性核酸聚合酶；上述模板-依赖性核酸聚合酶作用于上述TSG引物和上述靶核酸序列间的杂交结果物，由此能够在上述TSG引物的3’ -末端引起3’ -延长反应。本发明的试剂盒是为了能够实施上述的本发明的检测方法而构成的，为了避免本说明书的过度复杂性，故省略共同的内容。本发明的试剂盒可选择性地包含在靶扩增聚合酶链式反应(PCR)(例如，聚合酶链式反应)中所需的如缓冲液、DNA聚合酶辅因子及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等试剂。选择性地，本发明的试剂盒还可包含多种多聚核苷酸分子、反转录酶、多种缓冲液、试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。并且，试剂盒可包含实施阳性对照组及阴性对照组反应时所需的试剂。熟知本说明书的公开事项的本技术领域的普通技术人员能够容易地决定在任意一个特定反应中使用的试剂的最适量。典型的是，本发明的试剂盒由包含在前面揭示的组成成分的额外的包 装体或者组分(compartment)所制备。对本发明的特征及优点如下进行概括(a)本发明对用于检测靶核酸序列的新颖的实时PCR方法接近研究。TSG引物可以产生用于表示从双重相互作用性标记系统发出的靶核酸序列存在的信号，在PCR反应期间，可借助其3’-延长反应来扩增靶核酸序列。因此，本发明可以提供以实时方式扩增靶的同时能够检测靶核酸序列的新颖的方法。(b) TSG引物的延长反应能够使得延长产物内包含(incorporated)双重标记TSG引物，由此与扩增产物的量成正比例地产生信号的强度。应用于本发明的这种耦合现象可实现更加准确的靶核酸序列的定量分析。(C)与标记探针不同，TSG引物自身在无任何引物延长反应地与非-靶核酸序列非-特异性地杂交的情况下，通过在高温等高度严格条件(high stringent conditions)下实施信号检测，由此有可能不产生假阳性信号。(d)本发明的信号产生可在没有借助核酸酶活性的切割反应的情况下，仅依靠与靶核酸序列的杂交来达成。在这种情况下，本发明并不是必须需要具有5’ 一 3’核酸酶活性或者3’ 一5’核酸酶活性的核酸聚合酶，因此为了多种应用可利用多种核酸聚合酶。(e)在利用具有5’ 一 3’核酸酶活性的核酸聚合酶的情况下，本发明能够从与靶核酸序列杂交的TSG引物的5’ -切割反应得到信号，这将提高靶检测效率。(f)以往的实时PCR方法需要如标记探针或者发夹结构一样复杂地变形的引物结构，这导致难以实现探针及引物的设计、合成或者序列选择。但是，就本发明的TSG引物而言，没有追加的标记探针或者复杂地变形的引物结构地，不仅利用于靶扩增，而且还可利用于信号扩增，并且相对简单而容易地实现用于实时PCR的引物的设计、合成及序列选择。因此，本发明提供与以往实时PCR技术相比能够以更加便利的方式实施的新颖的实时PCR方法。(g)就以往基于探针的实时PCR方法而言，由于使不仅对引物还对探针的杂交条件最优化是必不可少的过程，因而难以实现以往基于探针的实时PCR方法的最优化。利用具有形成发夹环的尾部的引物的以往的实时PCR方法，考虑到在引物中的发夹环形成及变形，应实现反应条件的最优化。相反，由于本发明无任何结构性变形地仅考虑对引物的最优化，因此可以完全摆脱关于以往的实时PCR方法的最优化的顽固性问题及缺点。(h)就以往的实时PCR方法而言，由于难以实现引物或者探针设计及最优化，因此不适于多重试验。相反，本发明在实时PCR中没有追加的探针或者复杂地变形的引物结构地，仅利用标记的引物，因此，能够以多重方式，卓越地实时进行靶检测。(i)与以往的实时PCR探针相比较，在进行过程中TSG引物被延长，延长的TSG引物对靶核酸序列呈现更加高的结合力。以往的实时PCR引物需要如发夹结构一样复杂地变形的结构，这妨碍与靶核酸序列的结合。相反，TSG引物不需要那种变形，因而具有TSG引物与靶核酸序列的更好的结合效率。这一特征得以提高基于本发明的方法的靶检测效率。(j)本发明的方法，将设计成利用于常规PCR反应的引物实现标记化，并将该标记引物作为TSG引物用于实时PCR反应，由此能够容易地实施实时PCR反应。简言之，用合适的标记容易地对在以往PCR反应中生成扩增子的引物进行标记后，根据本发明利用于基于 实时PCR反应的靶核酸序列的检测。因此，本发明的方法在实时PCR试验的开发中，具有时间有效性及费用有效性。(k)如上所述，具有在本发明中使用的DPO结构的引物提高了结合特异性，由此去除在实时PCR反应中关于引物的非-靶结合的假阳性信号。下面，将通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于更加具体说明本发明，根据本发明的宗旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例实施例I:对在靶核酸序列的检测中利用不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的靶信号产生(TSG)引物的评价在利用不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的情况下，对本发明的TSG引物仅依靠TSG引物的靶杂交及延长，能否产生充分检测靶核酸序列的信号的情况进行了评价。为了对此评价进行实验，本发明者将肺炎链球菌(Streptococcus. Pneumoniae)基因或者金黄色葡萄球菌(Staphylococcus, aureus)基因用作祀模板。为了确保实验的简便，将对于肺炎链球菌(Streptococcus. Pneumoniae)基因或者金黄色葡萄球菌(Staphylococcus, aureus)基因的合成寡核苷酸用作模板。将不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的斯托菲尔片段(Stoffel fragment)用作DNA聚合酶。将报道分子及粹灭分子之间隔开的程度不同的两个TSG引物对各个靶分别进行了实验。将6-羧基荧光素(6-FAM，6-carboxyfluorescein)用作突光报道分子，并置于TSG引物的5’ -末端。将黑洞粹灭剂(BHQ-1, Black Hole Quencher I)用作猝灭分子。没有反复进行变性、杂交及引物延长地实施了核酸合成反应。在预定时间间隔(predetermined time interval)内测定了信号。A.用于检测肺炎链球菌(S.pneumoniae)基因的核酸合成反应将肺炎链球菌(S. pneumoniae)基因的祀核酸序列作为模板利用时,在本实施例中利用的合成模板及TSG引物的序列如下SP_T1055，-TTACTGAAAGACAATGAAGACAACCTAACAGGGGAAGATGTTCGCGAAGGCTTAACTGCAGTTATCTCAGTTAAACACCCAAATCCACAGTTTGAAGGACAAACC-3’ (SEQ ID NO :1)SP_TSG(9)5’-[6-FAM]TCCTTCAAAC[T(BHQ-l)]GTGGATTTGGGTGT-3’(SEQ ID NO :2)SP_TSG (21) 5’-[6-FAM] TCCTTCAAACTGTGGATTTGGG [T(BHQ-I) ]GT-3’ (SEQ ID NO:3)(括号内的数字9或者21意味着报道分子及猝灭分子之间的隔开的核苷酸数量。)以含有模板(SEQ ID NO :l)2pmole、10X斯托菲尔缓冲液(Stoffel buffer)含有IOOmM 三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl )(ρΗ8· 3)及 IOOmM 氯化钾(KCl)2 μ l、AmpHTaq DNA聚合酶、斯托菲尔片段(美国应用生物系统公司，美国Applied BioSystems, US) I单元、4 种 dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200 μ M、5mM 氯化镁(MgCl2)及 TSG 引物(SEQID NO 2或者3)5pmole的20 μ I的最终体积实施了利用TSG引物的核酸合成反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司Bio-Rad);在951下对上述反应混合物进行2分钟变性后，在50°C下进行40分钟的培养(incubation)。以I分钟为间隔检测所产生的信号。如图5所示，两个TGS引物分别在有模板的情况下(No. I及No. 3)比在没有模板的情况(No. 2及No. 4)表现出更高的荧光强度。因此，可以得知，TSG引物在核酸合成反应期间通过TSG引物的杂交及延长能够对检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)基因提供充 分的信号。对模板的有无而言，值得关注的是比起在从猝灭分子隔开9核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :2)，在从猝灭分子隔开21核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :3)呈现出更明显的信号强度的差异(B卩，荧光强度(RFU)值的差异)。B.用于检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因的核酸合成反应将金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因的靶核酸序列作为模板利用时，在本实施例中利用的合成模板及TSG引物的序列如下SA_T2005，-GCCAATAAAACTAGGAGGAAATTTAAATGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATCATTTAGCGACTTTAAAGGTCATTGGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTATCGCTATCAACACAGACGGTCAAGCTTTAAACTTATCTAMGCTGAATCTAAA-3’(SEQ ID NO
4)SA_TSG(6) 5’-[6-FAM]CATTCCG[T(BHQ-I) ]GGTCAATCATTCGGTT-3’ (SEQ ID NO :5)SA_TSG(21)5，-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGG[T(BHQ-1) ]T-3，(SEQ ID NO :6)(括号内的数字6或者21意味着报道分子及猝灭分子之间的隔开的核苷酸数量。)除了模板金黄色葡萄球菌(S. aureus O. 2pmole)及TSG引物(SEQ ID NO :5或者6)以外,通过在检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)时所利用的相同的方案实施了核酸合成反应。如图6所示，两个TGS引物分别在有模板的情况下(No. I及No. 3)比在没有模板的情况(No. 2及No. 4)表现出更高的荧光强度。因此，可以得知，TSG引物在核酸合成反应期间通过TSG引物的杂交及延长，能够对检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因提供充分的信号。对模板的有无而言，值得关注的是比起在从猝灭分子隔开6核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :5)，在从猝灭分子隔开21核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :6)呈现出更明显的信号强度的差异(B卩，荧光强度(RFU)值的差异)。实施例2:对在用于靶核酸的检测的实时聚合酶链式反应(PCR)条件下，利用不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的TSG引物的评价
对在实时聚合酶链式反应(PCR)期间利用不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的情况下，本发明的TSG引物能否产生充分检测靶核酸序列的信号的情况进行了实验。为了对该评价进行实验，利用包含TSG引物的引物对，分别实施了用于检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)>淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)及脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)基因的实时聚合酶链式反应(PCR)0将不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的斯托菲尔片段(Stoffel fragment)用作DNA聚合酶。将报道分子及猝灭分子间隔开的程度不同的两个TSG引物对各个靶基因分别进行了实验。A.用于检测肺炎链球菌(S.pneumoniae)基因的实时聚合酶链式反应(PCR)将肺炎链球菌(S. pneumoniae)基因的祀核酸序列作为模板利用时,在本实施例中利用的正向引物及TSG引物(反向引物)的序列如下 SP_F15’-GGTTTCCGTACAGCCTTGAIIIIIGTTATCAATG-3’ (SEQ ID NO :7)SP_TSG(9)5’-[6-FAM]TCCTTCAAAC[T(BHQ-l)]GTGGATTTGGGTGT-3’(SEQ ID NO :2)SP_TSG (21) 5’-[6-FAM] TCCTTCAAACTGTGGATTTGGG [T(BHQ-I) ]GT-3’ (SEQ ID NO:
3)(I表示脱氧肌苷，括号内的数字9或者21意味着报道分子及猝灭分子之间的隔开的核苷酸数量。)以含有肺炎链球菌(S. pneumoniae)基因组DNAlOng、10X斯托菲尔缓冲液(Stoffel buffer)含有IOOmM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.3)及IOOmM氯化钾(KCi)2μ l.AmpliTaq dna聚合酶、斯托菲尔片段(美国应用生物系统公司，美国Applied BioSystems, USA) I 单元、4 种 dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200 μ M、5mM氯化镁(MgCl2)、正向引物(SEQ ID NO :7) 5pmole及作为反向引物的TSG弓丨物(SEQ ID NO:2或3) 5pmole的20 μ I的最终体积，实施了用于检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)的实时聚合酶链式反应(PCR);将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司Bio-Rad);在95°C下对上述反应混合物进行2分钟变性后，在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的过程实施了 30次。由此检测了在各循环的退火步骤(55°C)中产生的信号。如图7所示，在利用TSG引物及不具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶的实时聚合酶链式反应(PCR)中，在有肺炎链球菌(S. pneumoniae)模板的情况下观察到了对肺炎链球菌(S. pneumoniae)的荧光信号(No. I及No. 3)，相反在没有靶模板的阴性对照组中则没有出现荧光信号(No. 2及No. 4)。比起在从猝灭分子隔开9核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO 2),在从猝灭分子隔开21核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :3)呈现出了更低的Ct值和更高的荧光强度(RFU)值。B.用于检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因的实时聚合酶链式反应(PCR)将金黄色葡萄球菌(S. aureus)的靶核酸序列作为模板利用时，在本实施例中利用的正向引物及TSG引物(反向引物)的序列如下SA_F15，-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAI111ITAGCGACTTT-3J (SEQ ID NO 8)
SA_TSG(6) 5’-[6-FAM]CATTCCG[T(BHQ-I) ]GGTCAATCATTCGGTT-3’ (SEQ ID NO :5)SA_TSG(21)5，-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGG[T(BHQ-1) ]T-3，(SEQ ID NO :6)(I表示脱氧肌苷，括号内的数字6或者21意味着报道分子及猝灭分子之间的隔开的核苷酸数量。)除了模板(S. aureus)、正向引物(SEQ ID NO :8)及作为反向引物的TSG引物(SEQID NO 5或者6)以外，通过在检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)时所利用的相同的方案实施了实时聚合酶链式反应(PCR)。如图8所示，在利用TSG引物及不具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶的实时聚合酶链式反应(PCR)中，在有金黄色葡萄球菌(S. aureus)模板的情况下观察到了对金黄色葡萄球菌(S. aureus)的荧光信号(No. I及No. 3)，相反在没有靶模板的阴性对照组中则没有出现荧光信号(No. 2及No. 4)。 比起在从猝灭分子隔开6核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO 5),在从猝灭分子隔开21核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :6)呈现出了更低的Ct值和更高的荧光强度(RFU)值。C.用于检测淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)基因的实时聚合酶链式反应(PCR)将淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的祀核酸序列作为模板利用时,在本实施例中利用的正向引物及TSG引物(反向引物)的序列如下NG_F15，-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGAT-3，(SEQ ID NO :9)NG_TSG (4) 5，- [6-FAM] CTCAT [T (BHQ-1) ] GGCGTGTTTCGCATATTTAAG-3，(SEQ ID NO 10)NG_TSG(22)5， -[6-FAM]CTCATTGGCGTGTTTCGCATATT[T(BHQ-I)]AAG-3’ (SEQ IDNO 11)(I表示脱氧肌苷，括号内的数字4或者22意味着报道分子及猝灭分子之间的隔开的核苷酸数量。)除了模板(N. gonorrhoeae)、正向引物(SEQ ID NO :9)及作为反向引物的TSG引物(SEQ ID NO 10或者11)以外，通过在检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)时所利用的相同的方案实施了实时聚合酶链式反应(PCR)。如图9所示，在利用TSG引物及不具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶的实时聚合酶链式反应(PCR)中，在有淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)模板的情况下观察到了对淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的突光信号(No. I及No. 3),相反在没有革巴模板的阴性对照组中则没有出现荧光信号(No. 2及No. 4)。并且，如图9所示，比起在从猝灭分子隔开4核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :10)，在从猝灭分子隔开22核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ IDN011)呈现出了更低的Ct值和更高的荧光强度(RFU)值。D.用于检测脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)基因的实时聚合酶链式反应(PCR)]将脑膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)的祀核酸序列作为模板利用时,在本实施例中利用的反向引物及TSG引物(正向引物)的序列如下NM_R15，-CCATAACCTTGAGCAATCCAIIIIICCTGACGTTC-3，(SEQ ID NO :12)
NM_TSG(7) 5’-[6-FAM]CTTATCGC[T(BHQ-I) ]TTCTGAAGCCATTG-3’ (SEQ ID NO :13)NM_TSG(20)5，-[6-FAM]CTTATCGCTTTCTGAAGCCAT[T(BHQ-1)]G_3，(SEQ ID NO : 14)(I表示脱氧肌苷，括号内的数字7或者20意味着报道分子及猝灭分子之间的隔开的核苷酸数量。)除了模板(N. meningitidis)、反向引物(SEQ ID NO :12)及作为正向引物的TSG弓丨物(SEQ ID NO 13或者14)以外，通过在检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)时所利用的相同的方案实施了实时聚合酶链式反应(PCR)。如图10所示，在利用TSG引物及不具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶的实时聚合酶链式反应(PCR)中,在有脑膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)模板的情况下观察到了对脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的突光信号(No. I及No. 3),相反在没有靶模板的阴性对照组中则没有出现荧光信号(No. 2及No. 4)。 并且，如图10所示，比起在从猝灭分子隔开7核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :13)，在从猝灭分子隔开20核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQID NO 14)呈现出了更低的Ct值和更高的荧光强度(RFU)值。实施例3:为了检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)，利用TSG引物及不具有5’一 3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的实时聚合酶链式反应(PCR)的灵敏度通过检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因的靶核酸序列，确认了利用TSG引物及不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的实时聚合酶链式反应(PCR)的灵敏度。为了此实验，在实时聚合酶链式反应(PCR)中作为反向引物利用了 TSG引物(SEQ ID NO :6)。将从IOOpg连续稀释到IOfg的(分别稀释为10倍)金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因组DNA用作模板。在本实施例中利用的正向引物及TSG引物(反向引物)的序列如下SA_F15’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT-3’ (SEQ ID NO :8)SA_TSG(21)5，-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGG[T(BHQ-1) ]T-3，(SEQ ID NO :6)(I表示脱氧肌苷，括号内的数字21意味着报道分子及猝灭分子之间的隔开的核
苷酸数量。)以含有连续稀释的金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因组DNA(从IOOpg稀释到IOfg ；分别稀释为10倍)、IOX斯托菲尔缓冲液(Stoffel buffer)含有IOOmM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH 8. 3)及 IOOmM 氯化钾(KC1)2 μ l、AmpIiTaq DNA 聚合酶、斯托菲尔片段(美国应用生物系统公司，美国Applied BioSystems，USA) I单元、4种dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200 μ M、5mM 氯化镁(MgCl2)、正向引物(SEQ ID NO :8) 5pmole 及作为反向引物的TSG引物(SEQ ID勵6)5 111016的2(^1的最终体积实施了实时聚合酶链式反应(PCR);将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司=Bio-Rad);在95°C下对上述反应混合物进行2分钟变性后，在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的过程实施了 40次。由此检测了在各循环的退火步骤(55°C )中产生的信号。如图11所示，在利用一系列稀释的金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因组DNA实施实时聚合酶链式反应(PCR)的情况下，在稀释到IOOfg时也检测出靶核酸序列(No. I-No.4)。实施例4:借助利用具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的TSG引物5’ -末端部位的5’ -切割反应的信号产生本发明者发现借助模板-依赖性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性，在与靶核酸序列杂交的标记引物的5’ -末端部位发生5’ -切割反应，上述5’ -切割反应被巧妙地应用到靶核酸序列的检测来产生对于靶序列的信号(参考PCT/KR2009/007064)。因此，本发明者对借助具有5’ 一3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶在TSG引物5’ -末端部位发生5’ -切割反应，由此能否产生信号的情况进行了实验。为了对此评价进行实验，本发明者为了确保实验的方便，将肺炎链球菌(S. pneumoniae)作为祀,将对于肺炎链球菌(S. pneumoniae)基因的合成寡核苷酸用作模板。对报道分子及猝灭分子之间隔开的程度不同的两个TSG引物分别进行了实验。将6-羧基突光素(6-FAM,6-carboxyfluorescein)用作突光报道分子，并置于TSG引物的5’ -末端。将黑洞猝灭剂(BHQ-l，Black Hole Quencher I)用作猝灭分子。反复进行变性、杂交及引物延长来实施了核酸合成反应。在各反复的杂交步骤中测定了信号。将不具有5’一 3’ 外切核酸酶活性的斯托菲尔片段(Stoffel fragment)及有5’ 一 3’外切核酸酶活性的TaqDNA聚合酶用作DNA聚合酶。在本实施例中利用的合成模板及TSG引物的序列如下SP_T1055，-TTACTGAAAGACAATGAAGACAACCTAACAGGGGAAGATGTTCGCGAAGGCTTAACTGCAGTTATCTCAGTTAAACACCCAAATCCACAGTTTGAAGGACAAACC-3’ (SEQ ID NO :1)SP_TSG(9)5，-[6-FAM]TCCTTCAAAC[T(BHQ-l)]GTGGATTTGGGTGT-3，(SEQ ID NO :2)SP_TSG (21) 5’-[6-FAM] TCCTTCAAACTGTGGATTTGGG [T(BHQ-I) ]GT-3’ (SEQ ID NO:3)(括号内的数字9或者21意味着报道分子及猝灭分子之间的隔开的核苷酸数量。)A.利用不具有5’一 3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，反复进行变性、杂交及引物延长的核酸合成反应以含有模板(SEQID NO :1) 2pmole、IOX 斯托菲尔缓冲液(Stoffel buffer)含有IOOmM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH 8. 3)及IOOmM氯化钾(KCl)2 μ I、AmpliTaq dna聚合酶、斯托菲尔片段(美国应用生物系统公司，美国AppiiedBioSystems, US) I 单元、4 种 dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200μΜ、5πιΜ 氯化镁(MgCl2)及TSG引物(SEQ ID NO 2或者3) 5pmole的20 μ I的最终体积实施了核酸合成反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司=Bio-Rad);在95°〇下对上述反应混合物进行2分钟变性后，将在94°C下30秒、在50°C下60秒的过程实施了 40次。由此检测了在各循环的退火步骤(50°C)中产生的信号。正常化(normalization)之后的结果如图12所示,在将不具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的斯托菲尔片段(Stoffel fragment)用作DNA聚合酶的情况下，即使有模板也未出现 目号的差异(No. I及No. 5)。这种结果显示，仅依靠杂交及引物延长产生的信号的强度不随着反应循环的增加而发生变化，这是因为在核酸反应期间模板未被扩增的原因。因此，在核酸合成反应的循环反复中可知，仅依靠TSG引物的杂交及引物延长，SP使存在靶核酸序列也不会累积可检测的信号(No. I及No. 5)。B.利用具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶反复进行变性、杂交及引物延长的核酸合成反应以含有模板(SEQ ID NO :1) 2pmole、2XDiaStarTaq PCR主混合液(索尔杰恩特公司，韩国(Solgent,Korea))含有 12mM氯化续(MgCl2)、DiaStarTaq PCR缓冲液、DiaStarTaqDNA聚合酶2U及dNTP混合液10 μ I及TSG引物(SEQ ID NO 2或者3) 5pmole的20 μ I的最终体积实施了核酸合成反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司=Bio-Rad);在95°C下对上述反应混合物进行15分钟变性后，将在94°C下30秒、在50°C下60秒的过程实施了 40次。由此检测了在各循环的退火步骤(50°C)中产生的信号。如图12所示，在将具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的Taq DNA聚合酶用作DNA聚合酶的情况下，观察到了对于肺炎链球菌(S. pneumoniae)的信号的差异(No. 3及No. 7)。这种结果显示，利用具有5’一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶可在TSG引物5’ -末端部位上引起5’ -切割反应。因此，在每个循环中，信号从TSG引物放出的标·记片段产生，并被累积，最终会导致能够表示靶核酸序列存在的可观察的信号(No. 3及No.7)。另一方面，比起在从猝灭分子隔开21核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQID :3)，在从猝灭分子隔开9核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID :2)呈现出了更低的Ct值。这种结果显示，对猝灭程度而言，TSG引物的报道及猝灭之间的距离越短，比起报道及猝灭之间的距离远时，在5’ -切割反应前后呈现出较大的差异。实施例5:在用于靶核酸检测的实时聚合酶链式反应(PCR)条件下，利用具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的TSG引物的实验对利用具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，本发明的TSG引物在实时聚合酶链式反应(PCR)期间，能否产生充分检测靶核酸序列的信号的情况进行了评价。为了对此评价进行实验，本发明者除了具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶及反应条件以外，利用了与在实施例2中所利用的相同的模板及引物。A.用于检测肺炎链球菌(S.pneumoniae)的实时聚合酶链式反应(PCR)以含有肺炎链球菌(S.pneumoniae)基因组 DNA 10ng、2X DiaStarTaq PCR 主混合液10μ I(索尔杰恩特公司，韩国(Solgent，Korea))含有12mM氯化镁(MgCl2)、DiaStarTaqPCR缓冲液、DiaStarTaq DNA聚合酶2U及dNTP混合液、正向引物(SEQ ID NO 7) 5pmole及作为反向引物的TSG引物(SEQ ID勵2或者3)5 111016的2(^1的最终体积实施了实时聚合酶链式反应(PCR);将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司Bio-Rad);在95°C下对上述反应混合物进行15分钟变性后，将在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的过程实施了 30次。由此检测了在各循环的退火步骤(55°C)中产生的信号。如图13所示,在有肺炎链球菌(S. pneumoniae)模板的情况下观察到了对于肺炎链球菌(S. pneumoniae)的荧光信号(No. I及No. 3)，相反在没有模板的阴性对照组中则没有出现荧光信号(No. 2及No. 4)。并且，比起在从猝灭分子隔开9核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ IDNO :2)，在从猝灭分子隔开21核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :3)呈现出了更低的Ct值和更高的荧光强度(RFU)值。B.用于检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)的实时聚合酶链式反应(PCR)除了模板(S. aureus)、正向引物(SEQ ID NO :8)及作为反向引物的TSG引物(SEQID NO 5或者6)以外，通过在检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)时所利用的方案实施了实时聚合酶链式反应(PCR)。如图14所示，在有金黄色葡萄球菌(S. aureus)模板的情况下观察到了对于金黄色葡萄球菌(S. aureus)的荧光信号(No. I及No. 3)，相反在没有模板的阴性对照组中则没有出现荧光信号(No. 2及No. 4)。并且，比起在从猝灭分子隔开6核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :5),在从粹灭分子隔开21核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :6)呈现出了更低的Ct值和更高的荧光强度(RFU)值。C.用于检测淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的实时聚合酶链式反应(PCR)
除了模板淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)、正向引物(SEQ ID NO :9)及作为反向引物的TSG引物(SEQ ID NO 10或者11)以外，通过在检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)时所利用的方案实施了实时聚合酶链式反应(PCR)。如图15所示,在有淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)模板的情况下观察到了对于淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的突光信号(No. I及No. 3),相反在没有模板的阴性对照组中则没有出现荧光信号(No. 2及No. 4)。并且，比起在从猝灭分子隔开4核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO: 10)，在从猝灭分子隔开22核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :11)呈现出了更低的Ct值和更高的荧光强度(RFU)值。D.用于检测脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的实时聚合酶链式反应(PCR)除了模板(N. meningitidis)、反向引物(SEQ ID NO :12)及作为正向引物的TSG弓丨物(SEQ ID NO 13或者14)以外，通过在检测肺炎链球菌(S. pneumoniae)时所利用的方案实施了实时聚合酶链式反应(PCR)。如图16所示，在有脑膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)模板的情况下观察到了对于脑膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)的荧光信号(No. I及No. 3)，相反在没有模板的阴性对照组中则没有出现荧光信号(No. 2及No. 4)。并且，比起在从猝灭分子隔开7核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :13)，在从猝灭分子隔开20核苷酸的位置具有报道分子的TSG引物(SEQ ID NO :14)呈现出了更低的Ct值和更高的荧光强度(RFU)值。结论性地，在利用具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶的情况下，可通过两种不同的方式呈现用于表示靶核酸序列存在的信号(i)借助根据与靶核酸序列的杂交产生的结构变化引起的TSG引物上的相互作用性标记系统的信号不猝灭(unqunching)的信号产生；以及(ii )借助利用具有5’一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的TSG引物5’ -末端部位上的5’ -切割反应的信号产生。实施例6:为了检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)利用TSG引物及具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的实时聚合酶链式反应(PCR)的灵敏度通过检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因的靶核酸序列，确认了利用TSG引物及具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的实时聚合酶链式反应(PCR)的灵敏度。为了对此评价进行实验，本发明者除了具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶及反应条件以外，利用了与实施例3中所利用的相同的模板及引物。
以含有连续稀释的金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因组DNA(从IOOpg稀释到IOfg ；分别稀释为10倍)、2X QuantiTect多重PCR主混合液(凯杰公司=Qiagen)含有IlmM氯化镁(MgCl2)、QuantiTect多重PCR缓冲液、HotstartTaq DNA聚合酶以及dNTP混合液10μ I、正向引物(SEQ ID NO :8)5pmole及作为反向引物的TSG引物(SEQ ID NO 6)5pmole的20 μ I的最终体积实施了实时聚合酶链式反应(PCR);将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司=Bio-Rad);在95°C下对上述反应混合物进行15分钟变性后，将在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的过程实施了 40次。由此检测了在各循环的退火步骤(55°C)中产生的信号。图17如同图11所示，在利用连续稀释的金黄色葡萄球菌(S. aureus)基因组DNA实施实时聚合酶链式反应(PCR)的情况下，在稀释到IOOfg时也能检测出靶核酸序列(No.I-No. 4)。实施例7:用于检测芯片上的靶核酸序列的TSG引物评价
将肺炎链球菌(S. pneumoniae)基因的祀核酸序列作为模板利用时,在本实施例中利用的合成模板及TSG引物的序列如下SP_T1055，-TTACTGAAAGACAATGAAGACAACCTAACAGGGGAAGATGTTCGCGAAGGCTTAACTGCAGTTATCTCAGTTAAACACCCAAATCCACAGTTTGAAGGACAAACC-3’ (SEQ ID NO :1)SP_TSG(21)_S5，-[氨基AminoC6]TTTTT[T (荧光 % =Fluoresceine)]CCTTCAAACTGTGGATTTGGG[T(BHQ-1)]GT(SEQ ID NO : 15)(括号内的数字21意味着报道分子及猝灭分子之间的隔开的核苷酸数量。)A.芯片载玻片上的TSG引物的固定化用I型杰诺拉马(Genorama)测定点位溶液溶解TSG引物(SEQ ID NO :15)，以使该TSG引物的最终浓度达到50 μ M0在常温下，以70%的相对湿度，将溶解后的TSG引物在玻璃载玻片(杰诺拉马Genorama,爱沙尼亚Estonia)上进行测定点位(spotting)。在37°C的恒湿器中对载玻片进行两个小时培养。之后将载玻片放在1%氨溶液10分钟，在常温下用蒸馏水进行清洗。B.芯片上的核酸合成反应以含有模板(SEQ ID NO :1) 2pmole、IOX斯托菲尔缓冲液(Stoffelbuffer)含有IOOmM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HClXpH 8. 3)及 IOOmM氯化钾(KCl)2 μ I,AmpliTaq DNA聚合酶、斯托菲尔片段(美国应用生物系统公司，美国Applied BioSystems, US) I单元、4 种 dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200 μ M 以及 5mM 氯化镁(MgCl2)的 20 μ I 的最终体积实施了核酸合成反应；将上述反应混合物移至载玻片。将上述载玻片位于原位(insitu)PCR仪(基因扩增仪原位GeneAmp in situ,钼金埃尔默Perkin Elmer);为了实现变性，在95°C下对上述载玻片进行2分钟培养，在50°C下培养40分钟。核酸合成反应后清洗上述载玻片(在70°C下),利用微阵列扫描仪(ScanArray4000,钼金埃尔默Perkin Elmer)检测载玻片的信号，并对图像进行了分析。对本发明的优选实例进行了详细记述，可以进行根据本发明的原理的变形及修正，本发明的范围借助所附的权利要求和与其均等的内容而定义，这对于本发明所属的技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
权利要求
1.一种利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于， 包括以下的步骤 步骤(a)，使上述靶核酸序列与上述靶信号产生引物进行杂交，上述靶信号产生引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii)报道分子及猝灭分子；在上述靶信号产生引物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述靶信号产生引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子猝灭从上述报道分子发出的信号；在上述靶信号产生引物与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述靶信号产生引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭从上述报道分子发出的信号，由此能够得到表示上述靶核酸序列存在的信号； 步骤(b)，在引物延长条件下，将步骤(a)的结果物与模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，在上述靶信号产生引物的3’ -末端发生3’ -延长反应；以及 步骤(C)，对表示上述靶核酸序列存在的信号进行检测，由此，上述信号表示在DNA或者核酸混合物中存在靶核酸序列。
2.根据权利要求I所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述模板-依赖性核酸聚合酶具有5’ 一3’核酸酶活性，上述靶信号产生引物的3’ -末端借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的聚合酶活性而延长，上述靶信号产生引物的5’ -末端由上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’ 一3’核酸酶活性所切割，由此，从上述靶信号产生引物放出上述报道分子或上述猝灭分子，并产生用于表示靶核酸序列存在的信号。
3.根据权利要求2所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括至少反复进行两次上述步骤(a)_步骤(b)或者步骤(a)_步骤(C)的步骤，以便扩增用于表示靶核酸序列存在的信号。
4.根据权利要求1、2或3所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤(c)的信号检测以实时方式、终-点方式或者预定时间间隔方式来实施。
5.根据权利要求I所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述模板-依赖性核酸聚合酶为不具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
6.根据权利要求I所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物，具有以下通式I的双重引发寡核苷酸结构 .5，-Xp-Yq-ZrJ (I) 上述通式中，Xp为具有与靶核酸互补的杂交核苷酸序列的5’ -第一次引发部位；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位；&为具有与靶核酸互补的杂交核苷酸序列的3，-第二次引发部位；P、q以及r表示核苷酸的数量，X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引发部位的Tm高于3’ -第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm;上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引发部位从上述3’ -第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’ -第一次引发部位以及上述3’ -第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶信号产生引物的整体退火特异性得到提高。
7.根据权利要求I或2所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物的上述报道分子或上述猝灭分子位于5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-5核苷酸的位置。
8.根据权利要求7所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物的上述报道分子或上述猝灭分子位于5’ -末端。
9.根据权利要求I所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物在其5’-末端还包含与上述靶核酸序列非-互补的非-杂交核苷酸序列，上述非-杂交核苷酸序列不形成发夹-环结构。
10.根据权利要求9所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物的上述报道分子及上述猝灭分子中的一个位于非-杂交核苷酸序列，另一个位于杂交核苷酸序列。
11.根据权利要求I所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述猝灭分子为荧光，在步骤(c)中检测的表示靶核酸序列存在的信号为从上述荧光猝灭分子发出的信号。
12.根据权利要求I所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述模板-依赖性核酸聚合酶为具有3’ 一 5’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
13.根据权利要求12所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物在其3’ -末端部位具有至少一个错配核苷酸，该错配核苷酸包含对上述模板-依赖性核酸聚合酶的3’ 一 5’外切核酸酶活性具有耐性的主链。
14.根据权利要求I所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法在液相或固相中实施。
15.根据权利要求14所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法在固相中实施，上述靶信号产生引物通过其5’ -末端在固相基质的表面实现固定化。
16.根据权利要求I或15所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述靶信号产生引物包含至少两种引物。
17.根据权利要求I或15所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
18.根据权利要求I或15所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
19.一种通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于， 包括以下步骤步骤(a)，使包含作为能够对上述靶核酸序列进行扩增的正向引物以及反向引物的两个引物的一对引物与上述靶核酸序列进行杂交；在上述两个引物中至少一个是靶信号产生引物；上述靶信号产生引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii)报道分子及猝灭分子；在上述靶信号产生引物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述靶信号产生引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子猝灭从上述报道分子发出的信号；在上述靶信号产生引物与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述靶信号产生引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭从上述报道分子发出的信号，由此能够得到表示上述靶核酸序列存在的信号； 步骤(b)，在引物延长条件下，将步骤(a)的结果物与模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，在上述两个引物的3’ -末端发生3’ -延长反应； 步骤(c)，使步骤(b)的结果物发生变性； 步骤(d)，至少反复两次上述步骤(a)-步骤(c)，对上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的信号均进行扩增；以及 步骤(e)，用于检测表示上述靶核酸序列存在的信号；上述信号检测在步骤(d)的上述反复的各循环中、在步骤(d)的上述反复的终点或者上述反复期间的各个预定时间间隔内实施，这些信号表示靶核酸序列的存在。
20.根据权利要求19所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述模板-依赖性核酸聚合酶具有5’ 一 3’核酸酶活性，上述靶信号产生引物的3’ -末端借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的聚合酶活性而延长，上述祀信号产生引物的5’ -末端由上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性所切割，由此，从上述靶信号产生引物放出上述报道分子或上述猝灭分子，并产生用于表7]^祀核酸序列存在的信号。
21.根据权利要求19所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述模板-依赖性核酸聚合酶是不具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
22.根据权利要求19所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，在上述两个引物中，至少一个引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸结构 5，-Xp-Yq-ZrI，(I) 上述通式中，Xp为具有与靶核酸互补的杂交核苷酸序列的5’ -第一次引发部位；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位；&为具有与靶核酸互补的杂交核苷酸序列的3，-第二次引发部位；P、q以及r表示核苷酸的数量，X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引发部位的Tm高于3’ -第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm;上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引发部位从上述3’ -第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’ -第一次引发部位以及上述3’ -第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶信号产生引物的整体退火特异性得到提高。
23.根据权利要求19或20所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物的上述报道分子或上述猝灭分子位于5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-5核苷酸的位置。
24.根据权利要求23所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物的上述报道分子或上述猝灭分子位于5’ -末端。
25.根据权利要求19所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物在其5’ -末端还包含与上述核酸序列非-互补的非-杂交核苷酸序列，上述非-杂交核苷酸序列不形成发夹-环结构。
26.根据权利要求25所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物的上述报道分子及上述猝灭分子中的一个位于非-杂交核苷酸序列，另一个位于杂交核苷酸序列。
27.根据权利要求19所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述猝灭分子为荧光，在步骤(e)中检测的表示靶核酸序列存在的信号为从上述荧光猝灭分子发出的信号。
28.根据权利要求19所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述模板-依赖性核酸聚合酶为具有3’ 一 5’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
29.根据权利要求28所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶信号产生引物在其3’ -末端部位具有至少一个错配核苷酸，该错配核苷酸包含对上述模板-依赖性核酸聚合酶的3’ 一 5’核酸酶活性具有耐性的主链。
30.根据权利要求19所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法在液相或固相中实施。
31.根据权利要求30所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法在固相中实施，上述两个引物中的至少一个通过其5’ -末端在固相基质的表面实现固定化，上述实现固定化的引物为靶信号产生引物。
32.根据权利要求19或31所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述引物对包含至少两个引物对，在各引物对中的至少一个引物为靶信号产生引物。
33.根据权利要求19或31所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
34.根据权利要求19或31所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
35.根据权利要求34所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述引物对为用于嵌套扩增的引物对。
36.根据权利要求19或31所述的通过利用靶信号产生引物的扩增反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述扩增根据聚合酶链式反应实施。
37.一种利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于， 包括 Ca)靶信号产生引物；上述靶信号产生引物包含(i)杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及(ii)报道分子及猝灭分子；在上述靶信号产生引物不与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述靶信号产生引物中三维地互相邻近，上述猝灭分子猝灭从上述报道分子发出的信号；在上述靶信号产生引物与靶核酸序列杂交的情况下，上述报道分子及上述猝灭分子在上述靶信号产生引物中三维地隔开，上述猝灭分子不猝灭从上述报道分子发出的信号，由此能够得到表示上述靶核酸序列存在的信号；以及 (b)模板-依赖性核酸聚合酶；上述模板-依赖性核酸聚合酶作用于上述IE信号产生引物和上述靶核酸序列间的杂交结果物，由此能够在上述靶信号产生引物的3’ -末端引起3’ -延长反应。
38.根据权利要求37所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒包含一对引物，该一对引物包含能够对上述靶核酸序列进行扩增的作为正向引物以及反向引物的两个引物；在上述两个引物中至少一个为上述革G信号产生引物。
39.根据权利要求37或38所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述模板-依赖性核酸聚合酶具有5’ 一 3’核酸酶活性，借助其聚合酶活性在靶信号产生引物的3’ -末端发生3’ -延长反应，以及借助其5’ 一3’核酸酶活性在靶信号产生引物的5’ -末端均发生5’ -切割反应。
40.根据权利要求37或38所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述模板-依赖性核酸聚合酶为不具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
41.根据权利要求37或38所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述靶信号产生引物或上述两个引物中的至少一个，具有以下通式I的双重引发寡核苷酸结构 5，-Xp-Yq-ZrI，(I) 上述通式中，Xp为具有与靶核酸互补的杂交核苷酸序列的5’ -第一次引发部位；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位；&为具有与靶核酸互补的杂交核苷酸序列的3，-第二次引发部位；P、q以及r表示核苷酸的数量，X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引发部位的Tm高于3’ -第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm;上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引发部位从上述3’ -第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’ -第一次引发部位以及上述3’ -第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶信号产生引物的整体退火特异性得到提高。
42.根据权利要求37至39中任一项所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述靶信号产生引物的上述报道分子或上述粹灭分子位于5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-5核苷酸的位置。
43.根据权利要求42所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述靶信号产生引物的上述报道分子或上述猝灭分子位于-5，-末端ο
44.根据权利要求37或38所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述靶信号产生引物在其5’ -末端还包含与上述核酸序列非-互补的非-杂交核苷酸序列，上述非-杂交核苷酸序列不形成发夹-环结构。
45.根据权利要求44所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述靶信号产生引物的上述报道分子及上述猝灭分子中的一个位于非-杂交核苷酸序列，另一个位于杂交核苷酸序列。
46.根据权利要求37或38所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述模板-依赖性核酸聚合酶为具有3’ 一 5’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
47.根据权利要求46所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述靶信号产生引物在其3’ -末端部位具有至少一个错配核 苷酸，该错配核苷酸包含对模板-依赖性核酸聚合酶的3’ 一 5’核酸酶活性具有耐性的主链。
48.根据权利要求37或38所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒用于液相反应或固相反应。
49.根据权利要求37所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒用于固相反应，上述靶信号产生引物通过5’ -末端在固相基质的表面实现固定化。
50.根据权利要求38所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒用于固相反应，上述两个引物中的至少一个通过-5’ -末端在固相基质的表面实现固定化，上述实现固定化的引物为靶信号产生引物。
51.根据权利要求37或49所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述靶信号产生引物包含至少两种引物。
52.根据权利要求38或50所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述引物对包含至少两个引物对，在各引物对中至少一个引物为靶信号产生引物。
53.根据权利要求37、38、49以及50中的任一项所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
54.根据权利要求37、38、49以及50中的任一项所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
55.根据权利要求54所述的利用靶信号产生引物从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述权利要求38或50所述的引物对为用于嵌套扩增的引物对。
全文摘要
本发明涉及一种利用靶信号产生引物进行的靶检测。本发明通过在聚合酶链式反应(PCR)中使用的引物内引入双重相互作用性标记，使靶以及信号均得到扩增，并无需使用复杂的寡核苷酸，利用聚合酶链式反应(PCR)也可进行实时靶检测。本发明摆脱以往的实时聚合酶链式反应(PCR)方法的顽固的问题以及缺点。本发明仅利用标记引物成功地进行实时靶检测。并且，本发明不仅在液相还可以在固相中得到表示靶核酸序列存在的强信号。
文档编号C12N15/11GK102762744SQ201080064263
公开日2012年10月31日 申请日期2010年3月26日 优先权日2009年12月21日
发明者千钟润, 黄仁泽 申请人:Seegene株式会社