用于在木霉属的蛋白酶缺陷突变体中产生多肽的方法

专利名称：用于在木霉属的蛋白酶缺陷突变体中产生多肽的方法
技术领域：
本发明涉及在蛋白酶缺陷的木霉属(Trichoderma)突变体菌株中产生多肽的方法，涉及所述蛋白酶缺陷的木霉属突变体菌株，并涉及获得所述蛋白酶缺陷的木霉属突变体菌株的方法。
背景技术：
已显示木霉属可用作宿主细胞以供重组产生具有生物活性的多肽(W096/00787，WO 97/26330)。具有所需的蛋白表达和分泌增加的性状的木霉属宿主不一定具有对于成功的发酵最需要的特征。由于生物物质例如酶的产生对感兴趣的具体多肽的产生、回收或应用有害，发酵可能不是最佳的。Martinez 等，2008, Nature Biotechnology 26:553-560描述了生物质降解真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的基因组测序和分析。Dienes等，2007,Enzyme and Microbial Technology 40:1087-1094公开了从里氏木霉QM9414鉴定膜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。Eneyskaya 等，1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52:226-231 描述了来自里氏木霉的酸性蛋白酶。Haub等，1990, J。Biotechnology 16:187-198公开了从里氏木霉 QM9414 形成胞外蛋白酶。Hagspiel 等，1989,Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:6
1-67公开了来自里氏木霉QM9414选择体(selectant)的蛋白酶活性和纤维素酶的蛋白水解修饰。W02006/073839公开了真菌酸性蛋白酶。WO 2007/045248描述了真菌突变体用于表达异源多肽的用途。本发明涉及改善的木霉属宿主，其结合了表达商业量的感兴趣的多肽的能力，而在可使得所述多肽的回收和下游加工复杂化的蛋白酶的产生方面有缺陷。

发明内容
本发明涉及亲本木霉属菌株的突变体，其包含编码多肽的多核苷酸，和一种或多种(几种)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述一种或多种(几种)基因经修饰，使得突变体菌株在相同条件下培养时，与亲本木霉属菌株相比，分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。本发明还涉及产生多肽的方法，包括(a)在用于产生所述多肽的培养基中培养亲本木霉属菌株的突变体，其中所述突变体菌株包含编码所述多肽的多核苷酸，和一种或多种(几种)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述一种或多种(几种)基因经修饰，使得突变体菌株在相同条件下培养时，与亲本木霉属菌株相t匕，分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶；和(b)从所述培养基回收所述多肽。本发明进一步涉及获得亲本木霉属菌株的突变体的方法，包括(a)修饰一种或多种(几种)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因；和·(b)鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中所述一种或多种(几种)选自下组的基因经修饰第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，使得突变体菌株在相同条件下培养时，与亲本木霉属菌株相比，分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。


图I显示pDM156. 2的限制图。图2显示pEmY21的限制图。图3显示pEmY23的限制图。图4 显示 pWTY1470-19-07 的限制图。图5显示pWTY1515-2-01的限制图。图6 显示 pJaL504_[Bam HI]的限制图。图7 显示 pJaL504_[BglII]的限制图。图8显示PJaL574的限制图。图9 显示 pWTY1449-02-01 的限制图。图10 显示 pJfyS1540-75_5 的限制图。图11 显示 pJfyS1579-l_13 的限制图。图12 显示 pJfyS1579-8-6 的限制图。图13 显示 pJfyS1579-21_16 的限制图。图14显示pAlLo 1492-24的限制图。图15 显示 pJfyS1579-35_2 的限制图。图16 显示 pJfyS1579-41_ll 的限制图。图17显示pDAtwl8的限制图。图18显示pSaMe-AaXYL的限制图。图19显示pAgJgl 11的限制图。
图20显示pAgJgl 16的限制图。图21显示pAgJgll5的限制图。图22显示pAgJgll7的限制图。图23显示pAgJgl 18的限制图。图24显示来自里氏木霉AgJgl 17-3-10A和里氏木霉AgJgl 18-02-2E的培养液在40°C两周相对于相同条件下的亲本菌株的培养液的残余纤维素酶活性。图25显示pJfyS 152的限制图。图26显示pJfyS 153的限制图。定义枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶术语“枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”意指具有类似于枯草杆菌蛋白酶的底物特异性、使用丝氨酸残基以供催化肽和蛋白中肽键的水解的蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(枯草杆菌酶)是通过三个氨基酸天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸组成的催化三联体表征的丝氨酸蛋白酶。这些催化残基的安排类似于来自地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)的原型枯草杆菌蛋白酶(Siezen 和 Leunissen, 1997,Protein Science6:501-523)。就本发明而言,枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性根据实施例13中所述的步骤确定。天冬氨酸蛋白酶术语“天冬氨酸蛋白酶”意指使用天冬氨酸残基以供催化肽和蛋白中肽键水解的蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶类为使用天冬氨酸残基以供催化其肽底物的蛋白酶家族。一般而言，它们在其活性位点具有两个高度保守的天冬氨酸，并任选地在酸性pH有活性(Szecsi, 1992, Scand. J. Clin. Lab. In vest. Suppl. 210:5 - 22)。就本发明而言，天冬氨酸蛋白酶活性根据Aikawa等，2001，J. Biochem. 129:791-794所述的步骤确定。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶术语“胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶“意指具有类似于胰蛋白酶的底物特异性、使用丝氨酸残基以供催化肽和蛋白中肽键的水解的蛋白酶。就本发明而言，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性根据由Dienes等，2007，上文，或实施例20所述的步骤确定。缺陷术语“缺陷”意指在相同条件下培养时，与亲本木霉属菌株相比较，不产生一种或多种(几种)选自下组的酶的可检测的活性的木霉属突变体菌株第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶，或者，在相同条件下培养时，与亲本木霉属菌株相比较产生优选少至少25%，更优选少至少50%，甚至更优选少至少75%，并且最优选少至少95%的一种或多种(几种)选自下组的酶的木霉属突变体菌株第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。由本发明的木霉属突变体菌株产生的蛋白酶的水平可使用本文中所述或本领域中已知的方法来确定。分离的或纯化的术语“分离的”或“纯化的”意指从与其天然结合(naturallyassociated)的至少一种成分移出的多肽或多核苷酸。举例而言，多肽如通过SDS-PAGE确定的，可为至少1%纯，例如，至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，或至少95%纯，而多核苷酸如通过琼脂糖电泳确定的，可为至少 1%纯，例如，至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，或至少95%纯。成熟多肽术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N端加工，C端截短，糖基化，磷酸化等之后以其最终形式存在的多肽。在一个方面，基于预测SEQ ID N0:2的氨基酸 I 至 19 为信号妝的 SignalP 程序(Nielsen 等，1997, Protein Engineering 10:1-6)，所述成熟多肽为SEQ ID NO:2的氨基酸20至882。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:4的氨基酸I至20为信号肽的SignalP程序，所述成熟多肽为SEQ ID NO:4的氨基酸21至407。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:6的氨基酸I至19为信号肽的SignalP程序，所述成熟多肽为SEQ ID NO:6的氨基酸20至259。在另一个方面，基于预测SEQ ID NOilOO的氨基酸I至15为信号肽的SignalP程序，所述成熟多肽为SEQ ID NO: 100的氨基酸16至540。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO: 108的氨基酸I至17为信号肽的SignalP程序，所述成熟多肽为SEQ ID NO: 108的氨基酸18至395。成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有酶活性的成熟多肽的 多核苷酸。在一个方面，基于预测SEQ IDN0:3的核苷酸I至57编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上文)，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: I的核苷酸58至2774。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO: I的核苷酸I至60编码信号肽的SignalP程序，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID N0:3的核苷酸61至1299。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO: 5的核苷酸I至57编码信号肽的SignalP程序，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 5的核苷酸58至930。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:99的核苷酸I至45编码信号肽的SignalP程序，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:99的核苷酸46至1681。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO: 107的核苷酸I至51编码信号肽的SignalP程序，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 107的核苷酸52至1339。同一性两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数”同一性”所描述。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件组(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite), Rice 等，2000, Trends in Genetics 16:276-277)的 Needle 程序，优选为 3. 0. 0 版或之后的版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和 Wunsch, 1970, J0 Mol。Biol。48 :443-453)确定。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty) 10,缺口延伸罚分(gap extension penalty) O. 5，和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并计算如下(相同的残基X100)/(比对长度-比对中缺口总数)就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件组(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite), Rice等,2000,见上)的Needle程序,优选为3. 0. 0版或之后的版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970,见上)确定。所用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0. 5，和EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为”最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并计算如下
(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中缺口总数)多肽片段术语“多肽片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有酶活性，例如枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶活性。在一个方面，所述片段含有SEQ ID N0:2的成熟多肽或其同源序列的至少740个氨基酸残基，例如至少780个氨基酸残基或至少820个氨基酸残基。在另一个方面，所述片段含有SEQ ID N0:4的成熟多肽或其同源序列的至少320个氨基酸残基，例如至少340个氨基酸残基或至少360个氨基酸残基。在另一个方面，所述片段含有SEQ ID N0:6的成熟多肽或其同源序列的至少210个氨基酸残基，例如至少220个氨基酸残基或至少230个氨基酸残基。在另一个方面，所述片段含有SEQ ID NO: 100的成熟多肽或其同源序列的至少460个氨基酸残基，例如至少480个氨基酸残基或至少500 个氨基酸残基。在另一个方面，所述片段含有SEQ ID NO: 108的成熟多肽或其同源序列的至少320个氨基酸残基，例如至少340个氨基酸残基或至少360个氨基酸残基。亚序列术语“亚序列(subsequence) ”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有酶活性，例如枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶活性的多肽片段。在一个方面，亚序列含有SEQ ID NO: I的成熟多肽编码序列或其cDNA序列，或它们的同源序列的至少2220个核苷酸，例如至少2340个核苷酸或至少2460个核苷酸。在另一个方面，亚序列含有SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列或其cDNA序列，或它们的同源序列的至少960个核苷酸，例如至少1020个核苷酸或至少1080个核苷酸。在另一个方面，亚序列含有SEQID NO: 5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列，或它们的同源序列的至少630个核苷酸，例如至少660个核苷酸或至少690个核苷酸。在另一个方面，亚序列含有SEQ ID NO:99的成熟多肽编码序列或其cDNA序列，或它们的同源序列的至少1380个核苷酸，例如至少1440个核苷酸或至少1500个核苷酸。在另一个方面，亚序列含有SEQ ID NO: 107的成熟多肽编码序列或其cDNA序列，或它们的同源序列的至少960个核苷酸，例如至少1020个核苷酸或至少1080个核苷酸。等位变体(allelic variant):术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。编码序列术语“编码序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的或其组合。cDNA :术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体,其通过一系列的步骤包括间接进行加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。核酸构建体术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。调控序列(control sequence):术语“调控序列”意指包括编码多肽的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。可操作地连接术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽的编码序列的表达。表达术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。宿主细胞术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞的任何后代。修饰术语“修饰”意指在基因或其转录或表达所需的调控序列中导入、取代或去除一个或多个(几个)核苷酸，或基因破坏，基因转换，基因缺失，或基因的随机或特异性诱变，所述基因例如第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二天冬氨酸蛋白酶基因，或其组合。所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和/或第二天冬氨酸蛋白酶基因中的一种或多种(几种)的缺失可为部分的或完全的。所述修饰导致所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二天冬氨酸蛋白酶基因，或其组合的表达的减少或消除(失活)。在一个优选的方面，所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二天冬氨酸蛋白酶基因中的一种或多种(几种)失活。
具体实施例方式本发明涉及亲本木霉属菌株的突变体，其包含编码多肽的多核苷酸，和一种或多种(几种)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述一种或多种(几种)基因经修饰，使得突变体菌株在相同条件下培养时，与亲本木霉属菌株相比，分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。本发明还涉及产生多肽的方法，包括(a)在用于产生所述多肽的培养基中培养亲本木霉属菌株的突变体，其中所述突变体菌株包含编码所述多肽的多核苷酸，和一种或多种(几种)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述一种或多种(几种)基因经修饰，使得突变体菌株在相同条件下培养时，与亲本木霉属菌株相比，分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶；和(b)从所述培养基回收所述多肽。本发明进一步涉及获得亲本木霉属菌株的突变体的方法，包括(a)修饰一种或多种(几种)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因；和(b)鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中所述一种或多种(几种)基因经修饰，使得突变体菌株在相同条件下培养时，与亲本木霉属菌株相比，分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和·第二天冬氨酸蛋白酶。本发明的优点在于消除或减少了一种或多种(几种)酶活性，其可对感兴趣的具体多肽的产生，下游加工例如回收，和/或应用是有害的。在本发明的方法中，未本木霉属菌株可为任何木霉属菌株，如野生型木霉属菌株或其突变体。亲本木霉属菌株可为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma Iongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride);或其可替换的有性形式，即肉座菌属(Hypocrea)。在另一个方面,亲本木霉属菌株是哈茨木霉。在另一个方面，亲本木霉属菌株是康宁木霉。在另一个方面，亲本木霉属菌株是长枝木霉。在另一个方面，亲本木霉属菌株是里氏木霉。在另一个方面，亲本木霉属菌株是绿色木霉。在另一个方面，亲本里氏木霉菌株是里氏木霉RutC30。在另一个方面，亲本里氏木霉菌株是里氏木霉TV10。在另一个方面，亲本里氏木霉菌株是里氏木霉的突变体。在另一个方面，亲本里氏木霉菌株是里氏木霉的形态突变体(参见WO 97/26330)。蛋白酶缺陷的木霉属突变体菌株可通过使用本领域公知的方法，如插入、破坏、替代或缺失来减少或消除一种或多种(几种)选自下组的基因的表达来构建第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因。可修饰一部分基因，如编码区或编码区表达所需的调控区。基因的此种调控序列可为启动子序列或其功能性部分，即足以影响基因表达的部分。举例而言，可使得启动子序列失活，导致无表达，或可用较弱的启动子替代天然启动子序列以减少编码序列的表达。可修饰的其他调控序列包括但不限于前导序列，前肽序列，信号序列，转录终止子和转录激活子。所述木霉属突变体菌株可通过消除或减少基因表达的基因缺失技术来构建。基因缺失技术使得可以部分或全部去除基因，从而消除其表达。在此类方法中，基因的缺失通过使用经构建连续地含有基因侧翼的5’和3’区的质粒进行同源重组来实现。所述木霉属突变体菌株亦可通过在基因或其转录或翻译所需的其调控序列中导入、取代和/或去除一个或多个(几个)核苷酸来构建。举例而言，可插入或去除核苷酸以供导入终止密码子，去除起始密码子，或使得开读框移码。此种修饰可依照本领域已知技术通过定点诱变或PCR生成的诱变来实现。参见，例如Botstein和Shortle，1985，Science 229:4719;Lo 等，1985, Proceedings of National Academy of Sciences USA81:2285;Higuchi 等，1988, Nucleic AcidsResearch 16:7351;Shimada,1996, Meth。Mol Biol。 57:157;Ho 等，1989， Gene 77:61;Horton 等，1989， Gene 77:61;以及 Sarkar 和Sommer,1990, BioTechniques 8:404。所述木霉属突变体菌株亦可通过基因破坏技术来构建，即将包含与基因同源的核酸片段的破坏性核酸构建体插入所述基因，这会构建同源区的重复，并在重复的区之间并入构建体DNA。若插入的构建体使得基因启动子与编码区分开，或打断编码序列使得产生非功能性基因产物，则此种基因破坏可消除基因表达。破坏构建体可简单地为伴以同源于基因的5’和3’区的选择性标记基因。所述选择性标记基因使得能够鉴定含有破坏的基因的 转化体。所述木霉属突变体菌株亦可通过基因转换的工艺构建(参见，例如Iglesias和Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189:73-76)。举例而言，在基因转换方法中，在体外对对应于基因的核苷酸序列进行诱变，以产生缺陷的核苷酸序列，然后将其转化入木霉属菌株以产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷的核苷酸序列取代了内源基因。可为理想的是所述缺陷的核苷酸序列亦包含标记以供选择含有缺陷基因的转化体。所述木霉属突变体菌株亦可通过已确立的使用互补于基因核苷酸序列的核苷酸序列的反义技术来构建(Parish 和 Stoker, 1997, FEMS Microbiology Letters154:151-157)。更具体而言，木霉属菌株的基因表达可通过导入互补于基因核苷酸序列、可在菌株中转录并能够杂交于菌株中产生的mRNA的核苷酸序列来减少或失活。在允许互补性反义核苷酸序列杂交于mRNA的条件下，由此减少或消除了翻译的蛋白的量。所述木霉属突变体菌株亦可通过已确立的RNA干扰(RNAi)技术来构建(参见，例如 WO 2005/056772 和 WO 2008/080017)。所述木霉属突变体菌株亦可进一步通过使用本领域中公知方法的随机或特异性诱变(包括但不限于化学诱变)来构建(参见，例如Hopwood, Isolation of Mutants inMethods in Microbiology (J. R。Norris 和 D. W。Ribbons 编)pp. 363-433，Academic Press,New York，1970)。对基因的修饰通过对亲本菌株进行诱变，并筛选其中基因表达减少或失活的突变体菌株来进行。可为特异性或随机的诱变可通过例如使用合适的物理或化学诱变齐IJ，使用合适的寡核苷酸，或对DNA序列进行PCR生成的诱变来进行。此外，诱变可通过使用任何这些诱变方法的组合来进行。适于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外(UV)辐照，羟胺，N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，N-甲基-N’ -亚硝基胍(NTG)，O-甲基羟胺，亚硝酸，甲磺酸乙酯(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸，和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，诱变通常通过在所选诱变剂存在下在合适条件下温育待诱变的亲本菌株，并选择呈现基因表达减少或无表达的突变体来进行。
在一个方面，修饰导致一个或多个(几个)选自下组的基因的失活第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因。在另一个方面，修饰导致一个或多个(几个)选自下组的基因的表达的减少第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨 酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因。在另一个方面，修饰导致一个或多个(几个)选自下组的基因的表达的减少，失活，或其组合第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第一天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一天冬氨酸蛋白酶基因和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一天冬氨酸蛋白酶基因和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一天冬氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一天冬氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。在另一个方面，突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因。 在一个方面，所述枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因编码具有枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其包含或组成为与SEQ ID NO:2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因编码包含或组成为SEQID N0:2的具有枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性的多肽。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因编码包含或组成为SEQ ID NO: 2的成熟多肽的具有枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性的多肽。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或组成为与SEQ ID NO: I或其成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID N0:1。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO: I的成熟多肽编码序列。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:1 ；(ii)SEQ ID NO: I的成熟多肽编码序列；
(iii)(i)或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii)或(iii)的全长互补链。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含或组成为与SEQ IDNO: 2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含或组成为SEQ ID NO:2。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQ ID NO: I或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO: I。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO: I的成熟多肽编码序列。在另一个方面，第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:1 ；(ii)SEQ ID NO: I的成熟多肽编码序列
(i)或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii)或(iii)的全长互补链。 在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因编码具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为与SEQ ID NO: 4或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因编码具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为SEQ ID N0:4。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因编码具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为SEQ ID N0:4的成熟多肽。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或组成为与SEQ ID NO: 3或其cDNA序列，或其成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因包含或组成为SEQ ID N0:3。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因包含或组成为SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID N0:3 ；(ii)SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全长互补链。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶包含或组成为与SEQ ID N0:4或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96 %，至少97 %，至少98 %，至少99 %，或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶包含或组成为SEQ ID N0:4。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶包含或组成为SEQ ID N0:4的成熟多肽。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQ ID NO: 3或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID N0:3。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID N0:3 ；(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全长互补链。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因编码具有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为与SEQ ID N0:6或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因编码具有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为SEQ ID N0:6。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因编码具有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为SEQ ID N0:6的成熟 多肽。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或组成为与SEQ ID NO: 5或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%,至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或组成为SEQID N0:5。在另一个方面,胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸,所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:5 ；(ii)SEQ ID NO: 5的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或
(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全长互补链。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含或组成为与SEQ ID N0:6或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶包含或组成为SEQ IDN0:6。在另一个方面，第一天冬氨酸蛋白酶包含或组成为SEQ ID N0:6的成熟多肽。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQ ID N0:5或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%,至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQID N0:5。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列。在另一个方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:5 ；(ii)SEQ ID NO: 5的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全长互补链。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因编码具有枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为与SEQ ID N0:100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因编码具有枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO: 100。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因编码具有枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO: 100的成熟多肽。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或组成为与SEQ ID N0:99或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%,例如，至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的 核苷酸序列。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含或组成为SEQID N0:99。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含或组成为SEQ IDNO:99的成熟多肽编码序列。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:99 ；(ii)SEQ ID N0:99的成熟多肽编码序列，
(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全长互补链。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含或组成为与SEQ IDNO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含或组成为SEQ ID NO: 100。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含或组成为SEQ ID NO: 100的成熟多肽。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQ ID NO:99或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID N0:99o在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:99的成熟多肽编码序列。在另一个方面，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:99 ；(ii)SEQ ID N0:99的成熟多肽编码序列，
(111)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)(i), (ii),或(iii)的全长互补链。在一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因编码具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为与SEQ ID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个
方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因编码具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO: 108。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因编码具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO: 108的成熟多肽。 在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或组成为与SEQ ID NO: 107或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%,至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因包含或组成为SEQ ID N0:107。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因包含或组成为SEQ ID NO: 107的成熟多肽编码序列。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID N0:107 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或
(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全长互补链。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶包含或组成为与SEQ ID N0:108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶包含或组成为SEQ ID N0:108。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶包含或组成为SEQ ID N0:108的成熟多肽。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为与SEQ ID NO: 107或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID N0:107。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ IDNO: 107的成熟多肽编码序列。在另一个方面，第二天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID N0:107 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全长互补链。本文中公开的核苷酸序列或其亚序列，及其氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆如上所述的基因的同源DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。因此，可从由这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组DNA或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与本文中公开的核苷酸序列或其亚序列同源的克隆或DNA,将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。就本发明而言，杂交表示核酸序列在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应本文中公开的核苷酸序列，其互补链，或其亚序列。使用X射线片(X-rayfilm)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42°C，在5X SSPE、0. 3%SDS、200 μ g/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺,根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用 2X SSC、0. 2%SDS在45。。(非常低严格性)，在50°C (低严格性)，在55°C (中严格性)，在60°C (中-高严格性)，在65°C (高严格性)，并且在70°C (非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比根据 Bolton 和 McCarthy 计算法(1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA48:1390)得出的 Tm低大约 5 °C 至大约 10 °C，在 O. 9M NaCl,O. 09M Tris-HCl ρΗ7· 6，6mM EDTA，O. 5%NP_40，I XDenhardt 溶液，ImM 焦憐酸钠(sodium pyrophosphate), ImM 憐酸二氢钠(sodiummonobasic phosphate), O. ImM ATP 和 O. 2mg 每 ml 的酵母 RNA 中，根据标准的 Southern 印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6X SSC加O. 1%SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6XSSC在比计算的Tm低5°C至I (TC的温度洗涤两次，每次15分钟。同源于或互补于本文中所述的基因的核苷酸序列可使用来自其他微生物来源的以修饰所选的木霉属菌株中的相应基因。在另一个方面，木霉属突变体菌株中基因的修饰去除选择性标记。选择性标记基因的去除可通过在反选择培养基上培养突变体来实现。在选择性标记基因含有在其5’和3’端侧翼的重复时，当对突变体菌株进行反选择时，重复会协助选择性标记基因通过同源重组的环出(looping out)。选择性标记基因亦可通过同源重组去除，即将包含缺陷基因的5’和3’区、但缺乏选择性标记基因的核酸片段导入突变体菌株，然后在反选择培养基上选择。通过同源重组，用缺乏选择性标记基因的核酸片段替代了含有选择性标记基因的缺陷基因。亦可使用其他本领域中已知的方法。应理解本发明的方法并不特别限于获得木霉属突变体菌株的特定顺序。可在构建用于产生感兴趣的多肽的菌株中的任意步骤向亲本菌株导入基因的修饰。优选木霉属突变体菌株在此种构建之前已经制成蛋白酶缺陷的。在本发明的进一步的方面，木霉属菌株的突变体可含有对可编码有害于感兴趣的多肽的产生、回收或应用的物质的其他基因的其他修饰，例如缺失或破坏。
在一个方面，木霉属菌株进一步包含一个或多个(几个)编码选自下组的蛋白水解活性的基因的修饰，例如破坏或缺失氨肽酶，二肽基氨肽酶，三肽基氨肽酶，羧肽酶，金属蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，和液泡蛋白酶。在另一个方面，木霉属菌株进一步包含编码氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶的一种或多种(几种)其他基因的修饰，例如破坏或缺失。在另一个方面，木霉属菌株进一步包含编码选自下组的酶的一种或多种(几种)其他基因的修饰，例如破坏或缺失α -淀粉酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，糖酶，过氧化氢酶，纤维二糖水解酶，纤维素酶，甲壳酶，环糊精糖基转移酶，角质酶，环糊精糖基转移酶，脱氧核糖核酸酶，内切葡聚糖酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，葡糖脑苷脂酶，葡糖氧化酶，α-葡糖苷酶，β_葡糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，卤素过氧化物酶，半纤维素酶，转化酶，异构酶，漆酶，连接酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，变聚糖酶(mutanase),氧化酶,果胶分解酶,过氧化物酶，磷脂酶，肌醇六磷酸酶，酚氧化酶，多酚氧化酶，核糖核酸酶，α -I, 6-转糖苷酶，转谷氨酰胺酶，尿激酶，木聚糖酶，和木糖苷酶。
在另一个方面，木霉属菌株进一步包含编码选自下组的酶的一个或多个(几个)其他基因的修饰，例如破坏或缺失内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和葡糖苷酶。在本发明的方法中，木霉属突变体菌株在相同产生条件下培养时，优选产生与相应的亲本木霉属菌株至少相同量的感兴趣的生物活性多肽。在另一个方面，突变体菌株在相同产生条件下培养时，与相应的亲本木霉属菌株相比产生优选多至少5%，更优选多至少10%,更优选多至少25%，更优选多至少50%，甚至更优选多至少75%，且最优选多至少100%生物活性多肽。将木霉属突变体菌株在营养培养基中使用本领域已知方法培养以供产生感兴趣的多肽。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。分泌的多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，可从细胞裂解物(lysate)获得。感兴趣的多肽可使用对于多肽具特异性的本领域中已知方法来检测。这些检测方法可包括使用特异性抗体，高效液相色谱，毛细管色谱，酶产物的形成，酶底物的消失，或SDS-PAGE。举例而言,可使用酶测定来确定酶活性。对于许多酶,确定酶活性的步骤在本领域中是已知的(参见，例如D. Schomburg和M. Salzmann (编)，Enzyme Handbook,Springer-Verlag, New York,1990)。可通过本领域中已知的方法来分离所得的多肽。举例而言，感兴趣的多肽可从培养基通过常规方法分离，所述方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。然后，分离的多肽可进一步通过多种本领域中已知的方法来纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦(IEF))、差示溶解度(例如,硫酸铵沉淀)、或提取(参见,例如，Protein Purification, J.-C. Janson和 Lars Ryden编，VCH Publishers, New York, 1989)。感兴趣的多肽可为任何对于木霉属菌株是天然或外源(异源)的多肽。所述多肽可由单个基因或两个或更多个基因编码。术语“编码多肽的多核苷酸”应理解为涵盖涉及多肽产生的一个或多个(几个)基因。术语“异源多肽”在本文中定义为对于宿主菌株并非天然的多肽，其中进行了结构修饰以改变天然多肽(例如天然多肽的蛋白序列)的天然多肽；或由于通过重组DNA技术(例如，较强的启动子，编码多肽的DNA的多拷贝)操纵多核苷酸或宿主菌株的结果其表达发生数量上变化的天然多肽。因此，本发明在术语“异源多肽”的范围内还涵盖天然多肽的重组产生，只要此种表达涉及使用对于木霉属菌株并非天然的基因元件(genetic element)，或使用经操纵以不同于宿主株中正常发生的方式发挥功能的天然元件。在一个方面，多肽是对于木霉属菌株的天然多肽。在另一个方面，多肽是对于木霉属菌株的异源多肽。所述多肽可为任何具有感兴趣的生物活性的多肽。术语多肽在本文中并不意指特定长度的编码产物，因此，涵盖肽、寡肽和蛋白质。术语“多肽”亦涵盖组合以形成编码产物的两个或更多个多肽。多肽还包括融合多肽，其包含由至少两个不同多肽获得的部分或完整的多肽序列的组合，其中一种或多种(几种)对于木霉属菌株可为异源的。多肽进一步包括上述提及的多肽的天然出现的等位变体和工程改造变体，和杂合多肽。 在一个方面，多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂(immunodiIator)、神经递质、受体、报道蛋白、结构蛋白或转录因子。在另一个方面,多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在另一个方面，多肽是乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、氨肽酶、α -淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、香豆酸酯酶、环糊精糖基转移酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖脑苷酯酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、齒素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧还酶、果胶水解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、α -I, 6-转糖苷酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、木聚糖酶或木糖苷酶。在另一个方面，多肽是白蛋白、胶原、原弹性蛋白、弹性蛋白或明胶。在另一个方面，多肽是内切葡聚糖酶。在另一个方面，多肽是纤维二糖水解酶。在另一个方面，多肽是β -葡糖苷酶。在另一个方面，多肽是具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个方面，多肽是木聚糖酶。在另一个方面，多肽是β_木糖苷酶。在另一个方面，多肽是乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面，多肽是阿魏酸酯酶。在另一个方面，多肽是阿拉伯呋喃糖苷酶。在另一个方面，多肽是葡糖醛酸糖苷酶。在另一个方面，多肽是乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面，多肽是阿拉伯聚糖酶。在另一个方面，多肽是香豆酸酯酶。在另一个方面，多肽是半乳糖苷酶。在另一个方面，多肽是葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，多肽是甘露聚糖酶。在另一个方面，多肽是甘露糖苷酶。在本发明的方法中，木霉属菌株的突变体是重组菌株，其包含编码异源多肽的多核苷酸，并有利地用于多肽的重组产生。菌株优选用包含编码异源多肽的多核苷酸的载体转化，接着将载体整合入染色体。“转化”意指将包含多核苷酸的载体导入宿主株，使得载体作为染色体整合物或作为自主复制的染色体外载体维持。整合一般认为是有利的，因为多核苷酸更可能在菌株中稳定维持。载体对染色体的整合可通过同源重组、非同源重组或转座进行。编码异源多肽的多核苷酸可从任何原核、真核或其他来源例如古菌(archaeabacteria)获得。就本发明而言，术语“从…获得”用于本文中与给定来源相联意指多肽是由所述来源产生的，或由插入来自所述来源的基因的菌株产生的。在本发明的方法中，多肽亦可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽融合于本发明多肽的N端或C端。所述融合多肽是通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生的。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码所述多肽的编码序列，从而使得其符合读框，且融合多肽的表达处于相同启动子和终止子调控之下。融合多肽亦可使用内蛋白(intein)技术来构建，其中融合体在翻译后构建(Cooper 等，1993，EMBO J. 12:2575-2583;Dawson 等，1994，Science 266:776-779)。融合多肽可进一步在两个多肽之间包含切割位点。在融合蛋白分泌之后，该位点受切割，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括但不限于Martin等，2003，J.Ind. Microbiol. Biotechnol. 3:568-576 ;Svetina 等，2000，J.Biotechnol. 76:245-251 ；Rasmussen-ffiIson 等，1997，Appl.Environ.Microbiol. 63:3488-3493 ；ffard等，1995，Biotechnology 13:498-503 ；以及 Contreras 等，1991，Biotechnology9:378-381 ； Eaton 等，1986，Biochemistry 25 : 505-512 ； Co 11ins-Rac i e等，1995, Biotechnology 13:982-987 ；Carter 等，1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6:240-248 ;以及Stevens, 2003，Drug Discovery World 4:35-48 中公开的位点。
在本发明的方法中，本发明的突变体木霉属菌株亦可用于重组产生对于木霉属菌株是天然的多肽。天然多肽可通过重组方式产生，即，例如将编码多肽的基因置于不同启动子的调控之下以增强物质的表达，通过例如使用信号序列加速其从菌株输出，或增加编码木霉属菌株通常产生的多肽的基因的拷贝数。用于分离或克隆编码感兴趣的多肽的多核苷酸的技术在本领域是已知的，并包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)实现从此种基因组DNA克隆此种多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR:A Guide toMethods and Application, Academic Press, New York。克隆方法可涉及将包含编码多妝的多核苷酸的所需的核酸片段切出并分离，将片段插入载体分子，并将重组载体并入本发明的突变体木霉属菌株，其中会复制多核苷酸的多重拷贝或克隆。多核苷酸可为基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任意组合。可以以多种方式操纵编码异源多肽的分离的多核苷酸以提供多肽在本发明的突变体木霉属菌株中的表达。取决于表达载体，在将多核苷酸序列插入载体之前对其进行操纵可为期望的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域是公知的。可将包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列能够在与调控序列相容的条件下指导编码序列在本发明的突变体木霉属菌株中的表达。所述调控序列可为合适的启动子序列，其为由本发明的突变体木霉属菌株识别、用于表达编码多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可为任何在突变体木霉属菌株中显示转录活性的核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并可从编码对突变体木霉属菌株天然或异源(外源)的胞外或胞内多妝的基因获得。用于在本发明的方法中指导核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(W0 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W0 96/00787)、里氏木霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其包含在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属(Aspergilli)中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其包含在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导 序列由在构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由本发明的突变体木霉属菌株识别以终止转录。所述终止子序列与编码异源多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在木霉属菌株中有功能的任何终止子用在本发明中。优选的终止子从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于本发明的突变体木霉属菌株的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码异源多肽的核苷酸序列的5’-末端。可在本发明中使用在突变体木霉属菌株中有功能的任何前导序列。对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，突变体木霉属菌株将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可在本发明中使用在突变体木霉属菌株中有功能的任何聚腺苷酸化序列。对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基端相连的氨基酸序列，并且指导编码多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌的多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可在本发明中使用指导表达的多肽进入突变体木霉属菌株的分泌途径，即分泌至培养基的任何信号肽编码序列。对于突变体木霉属菌株有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽N端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟、活性多肽。可以从酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(W095/33836)的基因获得前肽编码区。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽氨基端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基端。所述核酸构建体亦可包含一个或多个(几个)编码一个或多个(几个)因子的多核苷酸，所述因子有利于指导异源多肽的表达，例如，转录激活子(例如，反式作用因子)，分子伴侣，和加工蛋白酶。任何在突变体木霉属菌株中起作用的因子可用于本发明。编码一种或多种(几种)这些因子的核酸并不需要与编码异源多肽的核苷酸序列串联。同样理想的是添加调节或调控序列，其允许相对于突变体木霉属菌株的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。丝状真菌中的调节系统如TAKAa-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。在本发明的方法中，包含核苷酸序列、启动子和转录和翻译终止信号的重组表达载体可用于重组产生感兴趣的多肽。多种核酸和本文中所述的调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入核苷酸序列或包含所述序列的核酸构建体来表达所述核苷酸序列。在表达载体的制备中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够达成核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于其与将引入该载体的突变体木霉属菌株的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入突变体木霉属菌株中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此夕卜，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入突变体木霉属菌株基因组的完整DNA (total DNA),或可以使用转座子(transposon)。所述载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化的突变体木霉属菌株。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。用于突变体木霉属菌株的选择性标记的实例包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB (鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar (草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hpt (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG (乳清酸核苷_5’_磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC (硫酸腺苷酸转移酶)和 trpC (邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用于突变体木霉属菌株的是构巢曲霉的amdS基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入突变体木霉属菌株的基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额 外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入突变体木霉属菌株基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至
10,000碱基对，优选400至10，000碱基对，和最优选800至10，000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与突变体木霉属菌株基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到突变体木霉属菌株的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在突变体木霉属菌株中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator),其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文中定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。可用于突变体木霉属菌株的复制起点的实例是AMAl和ANSI (Gems等，1991，Gene98:61-67 ;Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15:9163-9175 ；W0 00/24883)。分离AMAl基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。用于连接本文中所述元件以构建重组表达载体的方法对本领域技术人员是公知的(参见，例如，J. Sambrook, E. F. Fritsch,和 T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning,Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, New York)。包含核苷酸序列的载体可通过例如转化导入突变体木霉属菌株，使得所述载体作为染色体整合物或作为自主复制的染色体外载体维持。整合一般认为是有利的，因为核苷酸序列更可能稳定维持于菌株中。载体整合入染色体通过同源重组、非同源重组或转座发生。将表达载体导入突变体木霉属菌株可涉及包括原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的本身已知的过程。用于转化木霉属菌株的合适方法描述于Malardier等，1989,Gene 78:147-156，和 WO 96/00787。本发明通过下述实施例进一步描述，其不应视作对本发明范围的限制。实施例菌株里氏木霉菌株981-0-8 (D4)是里氏木霉 RutC30(ATCC 56765;Montenecourt 和Eveleigh, 1979, Adv. Chem. Ser. 181:289-301)的诱变菌株。培养基和缓冲溶液LB培养基包含IOg的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，和5g的氯化钠，和去离子水加至I升。LB平板包含IOg的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的NaCl，15g的Bacto琼脂，和去离子水加至I升。PDA平板包含39g的Potato Dextrose Agar (Difco)和去离子水加至I升。NZY顶层琼脂糖包含5g的NaCl，5g的酵母提取物，IOg的NZ胺，2g的MgSO4, 7g的琼脂糖，和去离子水加至I升。
YEG培养基包含5g的酵母提取物，20g的葡萄糖，和去离子水加至I升。2X YT琼脂平板包含16g的胰蛋白胨，IOg的酵母提取物，5g的氯化钠，15g的Bacto琼脂,和去离子水加至I升。木霉属基本培养基平板包含30g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，O. 6g的CaCl2 ·2Η20，6g的(NH4)2SO4, 25g的Noble琼脂,和去离子水加至I升。COVE平板包含每升342. 3g的蔗糖，25g的Noble琼脂，20ml的COVE盐溶液，IOmM乙酰胺，和15或20mM CsCl0在高压灭菌之前，将溶液调整至pH 7.0。C0VE2平板包含30g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，IOmM乙酰胺，25g或30g的Noble琼脂，和去离子水加至I升。COVE 盐溶液包含 26g 的 KCl，26g 的 MgSO4 · 7H20, 76g 的 KH2PO4, 50ml 的 COVE 痕量金属溶液，和去离子水加至I升。COVE 痕量金属溶液包含 O. 04g 的 NaB4O7 · IOH2O, O. 4g 的 CuSO4 · 5H20,1. 2g 的FeSO4 · 7H20,0. 7g 或 Ig 的 MnSO4 · H2O, O. 8g 的 Na2MoO2 · 2H20, IOg 的 ZnSO4 · 7H20,和去离子水加至I升。COVE顶层琼脂糖包含342. 3g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，IOmM乙酰胺，IOg的低熔点琼脂糖，和去离子水加至I升。纤维素酶诱导培养基包含20g的Arbocel-天然纤维素纤维(J. Rettenmaier USALP, Schoolcraft, MI, USA), IOg 的玉米浸溃固形物(corn steep solids) (Sigma ChemicalCo.，St. Louis, MO, USA), I. 45g 的(NH4)2SO4, 2. 08g 的 KH2PO4,0. 28g 的 CaCl2,0. 42g 的MgSO4 · 7H20,0. 42ml的痕量金属溶液,2滴Pluronic Acid,和去离子水加至I升。在高压灭菌之前，将pH用ION NaOH调整至6. O。摇瓶培养基包含20g的右旋糖，IOg的玉米浸溃固形物，I. 45g的(NH4)2SO4, 2. 08g的 KH2PO4,0. 36g 的 CaCl2,0. 42g 的 MgSO4 · 7H20，和 0. 42ml 的痕量金属溶液。发酵分批培养基包含每升30g的纤维素，4g的右旋糖，IOg的玉米浸溃固形物，3. 8g 的(NH4)2SO4, 2. 8g 的 KH2PO4, 2. 64g 的 CaCl2,1. 63g 的 MgSO4 · 7H20，I. 8ml 的消泡剂，0. 66ml的痕量金属溶液，和去离子水加至I升。发酵补料培养基包含右旋糖。痕量金属溶液包含216g 的 FeCl3 *6H20,58g 的 ZnSO4 *7H20,27g 的 MnSO4 ·Η20，IOg的CuSO4 · 5H20, 2. 4g的H3BO3, 336g的柠檬酸，和去离子水加至I升。YP培养基包含IOg的酵母提取物，20g的Bacto蛋白胨，和去离子水加至I升。
YP+2%葡萄糖培养基包含去离子水中的1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖。YP+2%麦芽糊精培养基包含去离子水中的2%蛋白胨，2%麦芽糊精，和1%酵母提取物。DAP-2C-1培养基包含去离子水中的2%葡萄糖，I. 1%硫酸镁，I. 0%麦芽糖，O. 52%磷酸三钾，O. 2%柠檬酸，O. 1%磷酸二氢钾，O. l%Dowfax 63N10，O. 05%酵母提取物，和O. 05%的痕量元素溶液(I. 39%硫酸亚铁，O. 845%硫酸锰，O. 68%氯化锌，O. 3%柠檬酸，O. 25%硫酸铜，和O. 013%氯化镍)。PEG 缓冲液包含 500g 的 PEG 4000, IOmM CaCl2, IOmM Tris-HCl pH7. 5，和去离子水加至I升；并过滤灭菌。STC 包含(λ 8M 或 IM 山梨醇，IOmM 或 25mM CaCl2，和 IOmM 或 25mM Tris-HCl，pH7. 5或pH 8 ;并过滤灭菌。
TE 缓冲液包含 IM Tris pH 8. O 和 O. 5M EDTA pH 8. O20X SSC包含175. 3g NaCl，88. 2g的柠檬酸钠，和去离子水加至I升。实施例I :质粒pDM156. 2的构建粗糙脉孢菌乳清苷核苷-5’-单磷酸脱羧酶(pyr-4)基因(SEQ ID NO: 7为DNA序列，而SEQ ID N0:8为推导的氨基酸序列)的探针使用如下所述的引物通过PCR并入异羟洋地黄毒苷配基-标记的脱氧尿苷-三磷酸(dUTP)来制备。引物(有义)5，-GTCAGGAAACGCAGCCACAC-3，(SEQ ID NO:9)引物(反义)5，-AGGCAGCCCTTGGACGACAT-3，(SEQ ID NO: 10)将质粒pFB6 (Buxton 等，1983, Molecular and General Genetics 190:403-405)用Hind III消化并将消化物通过使用40mM Tris碱_20mM乙酸钠-ImM 二钠盐EDTA(TAE)缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳纯化。将I. Ikb pyr-4片段从凝胶切出并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc. , Valencia CA, USA)依照生产商提出的实验方案提取。扩增反应物(50μ1)包含IX Taq DNA聚合酶缓冲液(New England BiolabsInc. ,Ipswich,MA,USA),5 μ I的PCR DIG Labeling Mix(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis, IN, USA)，IOng 的 I. Ikb Hind III pyr-4 片段，IOpmol 的有义引物，IOpmol的反义引物，和 I 单位的 Taq DNA 聚合酶(New England Biolabs Inc. , Ipswich,MA,USA)。将反应物在ROBOCYCLER (StrataGene，La Jolla, CA，USA)中温育，程序如下1 个循环在95°C进行3分钟，接着35个循环，每个在95°C进行30秒，55°C进行I分钟，和72 °C进行I分钟。在72 °C进行最终延伸5分钟。扩增反应产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化。将大约0. 78kb的异羟洋地黄毒苷配基(DIG)标记的探针从凝胶切出并使用QIAQUlCK GelExtraction Kit 提取。生成镶片镰孢菌株A3/5的基因组DNA文库并克隆入λ载体EMBL4，如WO99/60137中所述。将DIG标记的探针用于筛选克隆入λ载体EMBL4的镶片镰孢A3/5DNA的基因组文库。将λ卩遼菌体与大肠杆菌Κ802细胞(New England Biolabs, Ipswich,MA, USA)铺板于含NZY顶层琼脂糖的 LB 平板上。使用 Sambrook等(Molecular Cloning, Laboratory Manual,第 2 版；J. Sambrook, E. F. Fritsch,和 T. Maniatis; Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)的技术将卩遼菌斑转印至HYBOND N尼龙膜(Amersham Biosciences,Buckinghamshire，UK)。DNA 通过使用 UVSTRATALINKER (StrataGene, La Jolla, CA, USA)的UV交联结合于膜。然后将滤纸与0.78kb DIG标记的粗糙脉孢菌pyr-4探针杂交。pyrG克隆的杂交和检测依照GENIUS System User’s Guide (Boehringer Hammheim,Manheim,Germany)在42°C用包含5X SSC, 35%甲酰胺，0. 1%L_月桂酰肌氨酸，0. 02%SDS，和1%封闭剂(Boehringer Hammheim, Manheim, Germany)的杂交溶液进行。使用的DIG-标记的探针的浓度为2. 5ng每ml的杂交溶液。杂交DNA用碱性磷酸酶缀合的抗异轻洋地黄毒苷配基抗体(Boehringer Hammheim,Manheim,Germany)免疫检测并用 Lumiphos 530, 一种化学发光底物(Boehringer Hammheim, Manheim, Germany)显影。DNA制备物从推定的阳性λ克隆使用 Lambda Midi Kit (QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)制备。来自上述鉴定的克隆的λ DNA用Eco RI消化并对其进行TAE缓冲液中的1%的琼月旨糖凝胶电泳。将3. 9kb片段切出并使用QiAEX Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc.,Valencia, CA, USA)提取。然后将片段克隆入 pUC18 (Viera 和 Messing，1987，Methods in Enzymology 153 :3-11)的 Eco RI 位点，并用 2 μ I 的克隆反应物转化 ONE SHOT TOPlO感受态细胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。将来自八个所得的转化体的质粒DNA通过DNA测序进行分析。选择一个具有所需序列的克隆，并命名为pDM156.2(图I)。pyrG片段携带整个编码区加上I. 3kb的启动子和I. 5kb的终止子。实施例2 :质粒pEmY21的构建将大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因(SEQ ID NO: 11为DNA序列，而SEQ IDNO: 12 为推导的氨基酸序列)从质粒 pPHTI (Cummings 等，1999, Current Genetics 36:371-382)使用下述引物扩增正向引物5’ -GGGttcgaaTTCATTTAAACGGCT-3’ (SEQ ID NO:13)反向引物5’ -GGGagcgctCAATATTCATCTCTC-3’ (SEQ ID NO: 14)将由下划线序列表示的限制性酶位点Bst BI (正向引物)和EC047III(反向引物)通过工程引入引物以供克隆。PCR反应物(用于扩增hpt基因)包含IX ThermoPol反应缓冲液(New EnglandBiolabs, Inc, Ipswich, MA, USA)，各 200 μ M 的 dNTP, 50 pmol 的正向和反向引物，100 pg 的pPHTI, I 单位的VENT' DNA 聚合酶(NewEngland Biolabs Inc. , Ipswich, MAUSA),和灭菌蒸馏水，总体积为100μ I。扩增反应使用ROBOCYCLER 进行，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；25个循环，每个在95°C进行I分钟，51°C进行I分钟，和72°C进行2分钟；和I个循环在72°C进行7分钟。PCR产物通过TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳分离。将I. 8kb片段从凝胶切出并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit提取。然后将凝胶纯化的片段使用TOPO Blunt Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)克隆入 pCR; -BluntII-TOPO(il!(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。所得质粒命名为 pEmYlO。然后将 Eco RI 位点从pEmYlO 中的 hpt 基因的编码序列使用QUIKCHANGE Site-Directed MutagenesisKit (StrataGene, La Jolla, CA, USA)依照生产商的指示使用如下所示的引物去除,其中小写字母代表靶Eco RI位点的未突变的核苷酸，而下划线字母代表突变的核苷酸。所得质粒命名为pBK3。正向引物5’-GGGTACCCCAAGGGCgTattcTGCAGATGGG-3’ (SEQ ID NO:15)反向引物5， -CCCATCTGCAgaatAcGCCCTTGGGGTACCC-3， (SEQ ID NO:16)将所得的不含Eco RI位点的hpt基因使用如下所示的正向和反向引物从pBK3PCR 扩增。正向引物5，-GGggtaccTTCATTTAAACGGCTTCAC-3，(SEQ ID NO:17)反向引物5’ -GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3 (SEQ ID NO:18)下划线部分代表导入的用于克隆的KpnI位点。米曲霉pyrG基因的部分用于生成直接重复并使用下述弓I物从pS02 (W098/12300)PCR扩增重复I :正向引物5，-TCCcccgggTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO: 19)反向引物5’ -GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3 (SEQ ID NO :20)重复2:正向引物5，-GGggtaccTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO:21)反向引物5，-TCCcccgggCGACCAGCAGACGGCCC-3，(SEQ ID NO :22)下划线部分代表导入的用于克隆的限制位点Sma I (cccggg)或KpnI (ggtacc)。将三个片段(hpt，重复#1和重复#2)在不同反应中扩增(各50 μ I)，所述反应物包含IX ThermoPol反应缓冲液，200 μ M dNTP,各O. 25 μ M的引物，50ng的模板DNA,和I单位的VENT DNA聚合酶。扩增反应使用ROBOCYCLER 进行，程序如下I个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行I分钟，61°C进行I分钟，和72°C进行2分钟；和I个循环在72°C进行7分钟。PCR产物通过TAE缓冲液中的I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离。将大约2kb扩增的hpt片段和大约O. 2kb重复片段从凝胶切出并使用MINELUTE GelExtraction Kit (QIAGENInc. , Valencia, CA, USA)提取。将两个pyrG重复片段用KpnI消化,用小牛肠磷酸酶(NewEngland Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA)脱憐酸，和用MINELUTE. Reaction CleanupKit (QIAGEN Inc.，Valencia, CA，USA)依照生产商的指示处理。然后将携带重复#1和hpt的片段使用 QUICKLIGATION Kit (New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA, USA)依照生产商的指示连接在一起，并用MINELUTE Reaction Cleanup Kit处理，并将所得连接物使用TOPO Blunt Cloning Kit克隆入pCR II Blunt。序列分析确认一个克隆，其中重复#1和hpt片段在pCR⑧II Blunt中连接在一起。该质粒命名为pEmY18。为了将第二重复克隆入pEmY18，将pEmyl8用Eco RV消化并将消化物通过TAE缓冲液中的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化。将5. 6kb片段从凝胶切出并使用QIAQUICK GelExtraction Kit提取。将O. 2kb重复2片段(如上所述)和消化的pEmY18使用QUICKLIGATION Kit连接在一起。将连接混合物用于转化SOLOPACIC G0ld Supercompetent细胞(StrataGene,La Jolla,CA,USA)。序列分析鉴定了其中三个组分(重复#1,hpt和重复#2)处于所需顺序和取向，且没有PCR错误的质粒。所得质粒命名为pEmY20。为了确保PEmY20用EcoRI的后续消化会释放单一片段，使用QUIKCHANGE 位点-Directed Mutagenesis Kit和如下所示的正向和反向引物依照生产商的指示去除Eco RI位点。在序列验证之后将所得质粒命名为pEmY21 (图2)。
正向引物5’-GGGTACCCCAAGGGCQTATTCTGCAGATGGG-3’ (SEQ ID NO :23)反向引物5’-CCCATCTGCAGAATACGCCCTTGGGGTACCC-3’ (SEQ ID NO :24)实施例3 :质粒pEmY23的构建将镶片镰孢pyrG编码序列(2，678bp)从pDM156. 2(实施例I)通过用EcoRV和StuI限制内切酶消化而切出，并将剩余的4，398bp载体使用QIAQUICK (id ExtractionKit依照生产商的指示凝胶纯化。将pEmY21的Sma I片段分离并使用QIAQUICK GelExtraction Kit凝胶纯化,并将两个凝胶纯化的片段连接在一起。对其就插入取向进行筛选，就错误存在与否进行测序，并选择一个具有正确插入序列的克隆，并命名为pEmY23(图3)。实施例4 :质粒pWTY1470-19-07的构建将携带镶片镰孢单端孢霉烯合酶(tri5)基因(SEQ ID NO:25为DNA序列，而SEQ ID NO: 26为推导的氨基酸序列)的5’和3’侧翼序列的质粒pJRoy40 (美国专利号7，332，341)用作模板以供扩增5’tri5基因侧翼序列的部分。PCR反应含有200 μ M dNTPs,IX Taq DNA聚合酶缓冲液，125pg的pJRoy40DNA，50pmol的各下述引物，和I单位的Taq DNA聚合酶，最终体积为50 μ I。正向引物5 -GGGAGATCTTCGTTATCTGTGCC-3 (SEQ ID NO:27)反向引物5，-GGGAGATCTTAGTAGTCGGCATTTGAAAC-3，(SEQ ID NO :28)(下划线核苷酸指示导入的BglII位点)。扩增反应物在ROBOCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行3分钟；10个循环，每个在95°c进行30秒，52 °C进行45秒，和7°C进行2分钟；20个循环，每个在95°C进行30秒，52°C进行45秒，和72°C进行5分钟；和I个循环在72°C进行7分钟。PCR产物通过使用TBE缓冲液的I. 5%琼脂糖凝胶电泳分离。将大约600bp的片段从凝胶切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit提取。将片段使用TOPO TACloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)插入 pCR_ 2. I (Invitrogen, Carlsbad,CA，USA)，并将ONE SHOT TOPlO感受态细胞用2pl的TOPO TA克隆反应液转化。将来自八个所得转化体的质粒DNA用Eco RI和Bgl II在不同反应中消化，并通过DNA测序确证三个具有正确限制消化样式的转化体的插入。选择一个具有所需序列的克隆并命名为pffTY1470-09-05o将携带tri5基因5’重复的608bpBlII片段从pWTY1470-09_05通过用BglII消化释放，通过使用TBE缓冲液的1.0%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit 提取。将质粒pJRoy40通过用Bgl II消化而直链化，之后将其使用虾碱性磷酸酶(RocheDiagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生产商的指示脱磷酸，并使用QIAQlJ ICK PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)纯化。将直链化的pJRoy40和凝胶纯化的BglII片段使用T4DNA连接酶(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA)依照生产商的指示连接在一起。大肠杆菌SURE⑧化学感受态细胞(StrataGene, La Jolla, CA, USA)的转化依照生产商的指示进行。一个转化体通过DNA测序确认含有所需载体，即，携带tri5 5’和3’侧翼序列和部分5’侧翼序列的重复。所得质粒命名为 pWTY1470-19-07(图 4)。实施例5 :质粒pWTY1515-02-01的构建对质粒pWTY1470-19_07 使用 QUIKCHANGE Site-Directed MutagenesisKit和如下所示的正向和反向引物依照生产商的指示进行体外诱变。正向引物5’-CAAGTAACAGACGCGACAGCTTGCAAAATCTTCGTTATCTGTG-3’ (SEQ ID NO :29)反向引物5’-CACAGATAACGAAGATTTTGCAAGCTGTCGCGTCTGTTACTTG-3’ (SEQ ID NO :30)诱变去除在1779bp的Bgl II位点，并使得在2386bp的Bgl 11位点称为独特的，并可用于后续操纵以插入携带胸腺嘧啶激酶(tk)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因盒的片段。将诱变反应用于依照生产商提出的实验方案转化试剂盒提供的大肠杆菌XL lO-GOLD Ultra-感受态细胞(StrataGene, La Jolla, CA, USA)。通过序列分析验证，一个转化体携带如上所示的突变，将其命名为pWTY1515-2-01(图5)并在实施例8中用作骨架。实施例6 :质粒pJaL574的构建质粒pDV8 (美国专利号6，806，062)携带单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus)类型I胸腺嘧啶激酶(HSV1-TK ;tk)基因(SEQ ID NO: 31为DNA序列，而SEQ ID NO: 32为推导的氨基酸序列)作为插入构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpdA)启动子的l.OkbXho Ι/BglII片段和携带三功能性构巢曲霉吲哚甘油磷酸合酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶和谷氨酰胺酰胺基转移酶(trpC)转录终止子的1.8kb Bam HI/Hind III片段之间的I. 2kbBgl 11/Bam HI片段。将质粒pDV8用Bam HI消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用Klenow聚合酶(StrataGene, La Jolla, CA, USA)填充。将消化的质粒使用QUICK LIGATION Kit遵循生产商的实验方案重新连接，用MINELUTE. GelExtractionKit处理，并将所得连接产物使用TOPO Blunt Cloning Kit依照生产商的指示克隆入pCR 4Blunt-T0P0 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。将克隆反应物依照生产商的指示转化入ONE SHOT 化学感受态T0P10细胞。从八个所得转化体使用BIOROBOT 9600 (QIAGEN Inc, Valencia, CA, USA)提取质粒 DNA 并通过使用 Xho I/Bam HI 和 Xho I/Hind III的限制性消化筛选。来自两个具有正确的限制性消化样式的转化体的质粒DNA的DNA测序确证两者均携带所需序列。将一个命名为pJaL504-[BamHI](图6)。将质粒PJaL504_[Bam HI]用Bgl II消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用Klenow聚合酶填充。将消化的质粒使用QUICK LIGATION Kit遵循生产商的实验方案重新连接，用MINELUTE Reaction Cleanup Kit处理，并将所得连接物使用TOPO Blunt Cloning Kit依照生产商的指示克隆入pCR 4Blunt-TOPO 。将克隆反应物依照生产商的指示转化入ONE SHOT 化学感受态大肠杆菌T0P10细胞。从八个所得转化体使用BIOROBOT 9600提取质粒DNA，并通过使用Xho I/Bgl 11和Xho I/Hindi 11的限制性消化筛选。来自两个具有正确的限制性消化样式的转化体的质粒DNA的DNA测序确认两者均携带所需序列。将一个命名为 pJaL504-[BglII](图 7)。Punt 等(1990,Gene 3 =101-109)之前显示可缺失构巢曲霉gpdA启动子的364 bp而不影响启动子强度。基于这些研究者的 观察，设计了如下所示的引物#172450以截短构巢曲霉gpdA启动子并减小载体大小。引物172450:5，-GACGAATTCTCTAGAAGATCTCTCGAGGAGCTCAAGCTTCTGTACAGTGACCGGTGACTC-3， (SEQ ID NO:33)下划线序列对应于gpdA启动子序列。剩余的序列为携带以下限制性位点的柄(handle) Eco RI, XbaI, BglII, Xho I,和 Hind III。为了截短构巢曲霉trpC终止子(同样用于减少载体大小)，将如下所示的引物#172499设计为携带Eco RI柄。引物172499 :5，-GACGAATTCCGATGAATGTGTGTCCTG-3，(SEQ ID NO:34)下划线序列对应于trpC终止子序列。使用引物172499和172450的扩增将启动子截短364bp并将trpC终止子序列截短239bp。用上述两个引物使用pJaL504_[BlII]作为模板进行PCR以生成包含截短型式的构巢曲霉gpdA启动子，HSVl-TK基因的编码序列，和截短型式的构巢曲霉trpC终止子的2，522bp 片段。扩增反应物由5μ I 的 IOX 缓冲液(Promega Corporation, Madison, WI, USA),各O. 4μ I 的 25mM dNTP, I. 25 μ I 的引物 172450 (lOOng/μ I)，I. 25 μ I 的引物 172499 (lOOng/μ I) ,0. 5μ I 的 pJaL504-[Bgl II] (lOOng/μ I) ,2 μ I 的 PfuDNA 聚合酶(PromegaCorporation, Madison, WI, USA) (2. 5U/ μ I),和 39. 6μ I 的灭菌蒸懼水组成。将扩增反应物在ROBOCYCLER 中温育，程序如下I个循环在95°C进行45秒；和28个循环，每个在95°C进行45秒，57 °C进行45秒，和72°C进行5分钟。在72 °C进行最终延伸10分钟。对扩增反应物进行使用50mM Tris_50mM硼酸-ImMEDTA 二钠盐(TBE)缓冲液中的低熔点琼脂糖的1%的琼脂糖凝胶电泳。将2，522bp片段从凝胶切出并使用Q1AQUICK Gel Extraction Kit 提取。然后将凝胶纯化的 DNA 使用TOPO Blunt Cloning Kit 依照生产商的指示插入pCR 4Bhmt-TOPO 。将克隆反应物依照生产商的指示转化入ONE SHOT 化学感受态TOPlO细胞。从八个所得转化体使用BIOROBOT 9600提取质粒DNA并通过使用Eco RI和BglII的限制性消化筛选。来自两个具有正确的限制性消化样式的转化体的质粒DNA的DNA测序确认两者均携带所需序列。将一个命名为pJaL574 (图8)。实施例7 :质粒pWTY1449-02-01的构建将质粒PJaL574遵循生产商推荐的实验方案转化 入感受态大肠杆菌SCS110细胞(StrataGene, La Jolla, CA，USA)。从二十四个所得转化体使用BIOROBOT 9600 提取质粒DNA，然后对其进行使用Eco RI和BglII的分析性消化。后续DNA序列分析导致鉴定出具有正确的序列的克隆，其命名为PWTY1449-02-01 (图9)。实施例8 tri5缺失载体pJfyS1579-21_16的生成将大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因盒使用ADVANTAGE GCGenomicPCR Kit(Clontech，Palo Alto, CA，USA)和如下所示的基因特异性正向和反向引物从质粒pEmY23PCR扩增。反向引物中的下划线部分引物为用于克隆的BlII位点。正向引物5’-TTGAACTCTCAGATCCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3’ (SEQ ID NO :35)反向引物5，-CAGATAACGAAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3，(SEQ ID NO :36)扩增反应物含有362ng的pEmY23作为DNA模板，各200 μ m的dNTP，I. ImM乙酸镁，0·4μΜ 引物，IX GC 反应缓冲液(Clontech，Palo Alto, CA, USA), 0. 5M GC Melt (Clontech,Palo Alto,CA，USA)，和 IX GC Genomic Polymerase Mix(Clontech,Palo Alto,CA，USA),最终体积为 50μ I。将扩增反应物在EPPENDOR.F MASTERCYCLE.R (Eppendorf,Munich, Germany)中温育,程序如下1个循环在95°C进行2分钟；25个循环，每个在94°C进行30秒和66°C进行3分钟；和I个循环在66°C进行3分钟；和维持在4°C。通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。将大约I. 9kb的片段从凝胶切出并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit提取。将片段使用TOPO TACloning Kit依照生产商的指示克隆入pCR 2. I。ONE SHOT T0P10感受态细胞用2 μ I的TOPO TA反应物转化。来自8个转化体的质粒DNA的序列分析确认与预期序列无偏差，并将质粒命名为pJfyS1540-75-5(图10)。将hpt插入物通过用Bam HI和Bgl II消化从pJfyS1540-75_5释放并通过TAE缓冲液中的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化。将I. 9kb的片段切出并使用MINiELUTE GelExtraction Kit提取。使用Rapid DNA Ligation Kit将该片段连接至使用小牛肠磷酸酶脱磷酸的Bgl II-直链化的空tri5缺失载体pWTY1515-2-01 (实施例5)。大肠杆菌SURE 化学感受态细胞用连接反应物转化，并将来自24个所得转化体的质粒DNA通过用Eco RI的限制消化分析以确证插入物的取向。选择一个携带具有所需取向的插入物的转化体，并命名为 pJfyS1579-l-13(图 11)。使用pWTY1449-02-01作为模板和如下所示的基因特异性正向和反向引物PCR扩增单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因(SEQ ID NO: 31为DNA序列，而SEQ ID NO: 32为推导的氨基酸序列)。粗体序列代表导入的BglII位点。正向引物
5’-GCCGACTACTAGATCGACCGGTGACTCTTTCTGGCATGCG-3’ (SEQ ID NO :37)反向引物5，-CAGATAACGA AGATCT (;AGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGC-3，(SEQ ID NO :38)扩增反应物含有IX HERCULASE_ 反应缓冲液(StrataGene，La Jolla, CA，USA)，各 200 μ M 的 dNTP, 55ng 的 pffTY1449-02-01,0. 2 μ M 引物，2%DMS0,和 2· 5 单位的HERCULASE 丨)NA 聚合酶(StrataGene, La Jolla, CA，USA)，最终体积为 50 μ I。将扩增反M物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行I分钟；25个循环，每个在94°C进行30秒，60°C进行30秒，和68°C进行2分45秒；和I个循环在68°C进行2分45秒；和维持在4°C。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离。将大约2. 8kb的片段从凝胶切出并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit纯化。将片段使用TOPO TA Cloning Kit 克隆入 pCR 2. I。ONE SHOT T0P10 感受态细胞用 2μ I 的 TOPO TA反应物转化。来自一个转化体质粒DNA的序列分析鉴定出tk编码序列(C1621G)中导致甘氨酸至丙氨酸的氨基酸变化的突变。使用QUIKCHANGE II XL Site-DirectedMutagenesis Kit (StrataGene, La Jolla, CA,USA)和如下所示的正向和反向引物依照生产商的指示校正该突变。小写字母指示所需变化。16个克隆的序列分析导致选择一个克隆，将其命名为pJfyS1579-8-6(图12)。正向引物5’-CCCTGTTTCGGGGCCCCGAGTTGCTGG-3’ (SEQ ID NO :39)反向引物5，-CCAGCAACTCGGGGCCCCGAAACAGGG-3’ (SEQ ID NO :40)将质粒pJfyS1579-8_6用Bam HI和BglII消化以释放2. 8kbtk片段，并将该片段如上所述进行纯化。将该片段使用QUICK LIGATION Kit连接至pJfyS1579-l_13，其经用BglII直链化和用小牛肠磷酸酶处理，并用于依照生产商的实验方案转化大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。所得质粒命名为pJfyS1579-21-16(图13)并用作tri5缺失盒。实施例9 :携带胸腺嘧啶激酶(tk)阴性选择标记和潮霉素磷酸转移酶(hpt)阳性选择标记的通用缺失载体的构建构建携带胸腺嘧啶激酶(tk)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)标志物两者的通用缺失载体以促进后续缺失质粒的装配。对于靶向缺失的基因的5’和3’区的侧翼序列可在用Pme I或Asc I (对于5’侧翼序列)和SbfI或Swa I (对于3’侧翼序列)消化载体之后，方便地连接至该载体。为了 PCR扩增来源于镶片镰孢pyrG基因的5’侧翼区的直接重复，将50皮摩尔的如下所示的引物用于两个PCR反应，反应物含有50ng的pDM156. 2，1X Pfx AmplificationBuffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 6 μ I 的 dNTP IOmM 混合物，2. 5 单位的PLATINUM Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)，和 I μ I 的 50mM MgSO4,总体积为50 μ I0引物重复#1有义引物
5’ -GTTTAAACGGCGCGCC CGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCAGG-3’ (SEQ ID NO:41)反义引物5’ -TTGTCGCCCGGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3，(SEQ ID NO :42)重复#2有义引物5’ -AGTATTCCCGGG CGACAAAACAAGGCTACTGCA-3’ (SEQ ID NO :43)反义引物5’ -ATTTAAATCCTGCAGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3J (SEQ ID NO :44) 将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，其程序如下。对
于重复#1 :1个循环在98°C进行2分钟；和5个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行30秒，和68°C进行I分钟。接着进行35个循环，每个在94°C进行30秒，59°C进行30秒，和68°C进行I分钟。对于重复#2，循环参数为I个循环在98°C进行2分钟；和5个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行30秒，和68°C进行I分钟。接着进行35个循环，每个在94°C进行30秒，56°C进行30秒，和68°C进行I分钟。在35个循环之后，将两个反应(即重复#1和#2)在68°C温育10分钟然后在10°C冷却直至进行进一步处理。将来自两个反应的PCR产物通过使用TAE缓冲液的O. 8%GTG_琼脂糖(CambrexBioproducts, East Rutherford, NJ, USA)凝胶电泳分离。对于重复#1和重复#2,将大约O. 26kb 的片段从凝胶切出和使用 Ultrafree -DA 旋转杯(Mi 11 ipore，Billerica，MA，USA)依照生产商的指示纯化。然后将十微升的各纯化的重复用于单个重叠PCR反应，其含有IXPfx Amplification 缓冲液，6 μ I 的 dATP, dTTP, dGTP,和 dCTP 的 IOmM 混合物，2. 5 单位的PLATINUM Pfx DNA聚合酶，和I μ I的50mM MgSO4,总体积为50 μ I。将扩增反应物在EPPENDORF⑧MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在98°C进行2分钟；和5个循环，每个在94°C进行30秒，50°C进行30秒，和68°C进行I分钟。然后将反应物与预温热的溶液混合，所述溶液含有50皮摩尔的对于重复#1的有义引物和50皮摩尔的对于重复#2的反义引物，IX Pfx Amplification缓冲液，6μ I的IOmM dNTP，2.5单位的PLATINUM Pfx DNA 聚合酶，和 I μ I 的 50mM MgSO4,最终体积为 50 μ I。将新的100μ I扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER' 中温育，程序如下35个循环，每个在94°C进行30秒，58 °C进行30秒，和68°C进行I分钟。在35个循环之后，将反应在68°C进行温育10分钟然后在10°C冷却直至进一步加工。0. 5kb PCR产物(携带重复装配物)如上所述通过0.8%GTG-琼脂糖凝胶电泳分离。将质粒pCR4(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)用作载体骨架的来源以供通用缺失载体的构建。为了去除PCR4DNA的非必需部分，将2. 5yg的质粒pTter61C(W02005/074647)用Bsp LUllI和Bst XI顺序消化。然后将消化的载体用南极磷酸酶(Antarctic phosphatase) (New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA)处理。将 3. Ikb消化的骨架如上所述通过0. 8%GTG-琼脂糖凝胶电泳分离。然后将纯化的重复装配物连接至用 Rapid Ligation Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)纯化的载体骨架。连接反应物组成为75ng的纯化的载体骨架和3μ I的纯化重复装配物。将一微升的该连接反应物用于使用生产商的实验方案转化化学感受态SOLOPACK Super感受态细胞(StrataGene, Carlsbad, CA, USA)。将二十四个转化体通过Nco I/Pme I限制消化分析。二十四个转化体中的二十三个具有预期的限制消化样式。随机选择克隆pFvRs#10用于测序以确证无PCR诱导的错误。测序分析显示克隆pFvRs#10中的重复装配物具有预期的序列，并将其命名为pAlLo 1492-24(图14)。携带潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因的盒使用如下所示的基因-特异性正向和反向引物从pEmY23PCR扩增。下划线序列代表Xma I位点，而粗体字母代表BglII位点。在各5 ‘端的四个“a”允许PCR产物末端的后续消化。正向引物5’ -aaaacccgggCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3’ (SEQ ID NO:45)反向引物5’ -aaaacccggg AC ATCT ACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3 (SEQ ID NO:46)扩增反应物含有60ng的pEmY23，各200 μ m的dNTP，ImM乙酸镁，O. 4 μ M引物，IXPfx Amplification 缓冲液，O. 5Μ GC Melt，和 2. 5 单位的 PLATINUM Pfx DNA 聚·合酶，最终体积为50μ I。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°c进行2分钟；10个循环，每个在94°C进行30秒，60°C进行30秒，和68°C进行I分50秒；和I个循环在68°C进行7分钟接着维持在4°C。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离。将大约I. 8kb的片段从凝胶切出并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit提取。将凝胶纯化的PCR产物接着用Xma I消化，并在1%琼脂糖凝胶上运行，并如上所述再次进行凝胶纯化。将QUICKLIGATION Kit用于将hpt PCR产物连接至Xma I-直链化的、经小牛肠磷酸酶处理的PAlLol492-24。所得质粒命名为pJfyS1579-35_2 (图15)，并用作供胸腺嘧啶激酶基因插入的受体。单纯疱疹病毒tk盒的来源是质粒pJfyS1579-8_6 (实施例8)，将插入通过用BarnHI和Bgl II消化从其释放。通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离消化产物，将对应于2.8kb tk基因插入物的片段切出并使用MINELUTE Gel ExtractionKit提取。将QUICK LIGATION Kit用于将tk基因盒连接至Bgl II-直链化、经小牛肠磷酸酶处理的 pJfyS1579-35-2。所得质粒命名为为 pJfyS1579-41_ll (图 16)。实施例10 :里氏木霉菌株981-0-8基因组DNA提取将里氏木霉菌株981-0-8在带挡板的摇瓶中的50ml的YEG培养基中在28°C以200rpm 振荡生长 2 日。将菌丝体通过使用MIRACLOTH (Calbiochem, La Jolla, CA，USA)的过滤来收获，去离子水中洗涤两次，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体通过杵和研钵磨碎至细微粉末，且使用DNEASY(S)Plant Maxi Kit (QIAGEN Inc. , Valencia, CA, USA)分离总DNA。实施例11 :里氏木霉枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因缺失质粒pDAtwl8的构
建为了构建里氏木霉枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因缺失盒，将里氏木霉枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因(SEQ ID NO: I为DNA序列，而SEQ ID NO: 2为推导的氨基酸序列)的下游非编码区的I. 4kb片段使用如下所示的寡核苷酸067375和067376进行PCR扩增。引物067375:5， -AAAAAACCTGCAGGGATGTAAGAGGGTTTCTTGAGGGGT-3， (SEQ ID NO:47)
引物067376:5J -AAAAAACCTGCAGG GCGGCCG CTGATAGTAGACATGATACTG-3J (SEQ ID NO :48)下划线字母代表添加至有义和反义引物以促进克隆扩增片段的Sbf I位点，而粗体区代表导入用于后续限制性消化以去除β_内酰胺酶基因以供真菌转化的Not I位点。扩增反应物包含300ng的里氏木霉菌株981_0_8基因组DNA (实施例10)，各300μΜ 的 dNTP，50pmol 的引物 067375，50pmo I 的引物 067376，IX 反应缓冲液，ImM MgSO4和 2. 5 单位的 PLATINUM Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA, USA)。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333 (Eppendorf Scientific, Inc.，Westbury, NY, USA)中温育,其程序如下1个循环在98°C进行5分钟；30个循环，每个在98°C进行30秒，58°C进行30秒，和72°C进行I. 6分钟；和I个循环在72°C进行15分钟。将1442bp PCR片段通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit 提取。将 1442bp PCR 产物克隆入pCR 2· I TOPO (InvitrogenCorp. ,Carlsbad,CA,USA)并依照生产商的指示转化入化学感受态大肠杆菌细胞。在补充100 μ g每ml的氨苄青霉素的2X YT琼脂平板上选择转化体，并在37°C进行温育16小时。克隆片段的DNA序列通过用M13正向和反向引物的DNA测序验证。所得质粒命名为pClonelO。类似地，将里氏木霉枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因(SEQ ID N0:1为DNA序列，而SEQ ID NO:2为推导的氨基酸序列)的上游非编码区的I. 5kb片段使用如下所示的引物067377和067374进行PCR扩增。引物067377:5J -AAAAAAGGCGCGCC GCGGCCGC AATGGATAGCTAATAATCAA-3J (SEQ ID NO: 40)引物067374:5， -AAAAAAGGCGCGCCACTGTGGGAGGGCTGTATGGACA-3， (SEQ ID NO:50)下划线字母代表添加至有义和反义引物以协助克隆扩增片段的Asc I位点，而粗体区代表Not I位点PCR扩增在如上所述的相同条件下进行，但是使用引物067377和067374。将1530 bp PCR片段通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶切出，并使用MlNELUTE Gel Extraction Kit 提取。将 I53Obp 扩增片段克隆入 pCR 2· I TOPO 载体并依照生产商的指示转化入化学感受态大肠杆菌细胞。转化体在补充100 μ g每ml的氨苄青霉素的2X YT琼脂平板上选择，并在37°C温育16小时。克隆片段的DNA序列通过用M13正向和反向引物的DNA测序验证。所得质粒命名为pClonel。将质粒pClonel用Asc I消化并将消化物通过TAE缓冲液中的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化。将含有里氏木霉枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因片段的上游非编码区的1415bp片段从凝胶切出并使用MINELUTE GelExtraction Kit提取。将该插入物使用QUICK LIGATION Kit (New England Biolabs, Beverly, MA, USA)依照生产商提出的实验方案连接至经Asc I消化并经小牛小肠磷酸酶(CIP)脱磷酸的pJfyS1579-41-ll (实施例
9)。使用限制分析鉴定含有具所需取向的插入物的转化体，并进行序列分析确证无PCR错误。所得质粒命名为pClonel4。构建最终里氏木霉枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因缺失盒，pDAtwl8 (图17)，即用Sbf I消化pClonelO以释放里氏木霉枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因片段的I. 5kb下游非编码区，然后将其使用QUICKLIGATION Kit依照生产商提出的实验方案连接至经SbfI消化并经小牛小肠磷酸酶(CIP)脱磷酸的pClonel4。然后可通过用Not I消化生成含有TrSp Δ :hpt/tk等位基因的直链7. 7kb片段。实施例12 :里氏木霉原生质体生成和转化原生质体制备和转化使用Penttila等，1987, Gene 61 :155_164的修饰的实验方案进行。简言之，将里氏木霉菌株981-0-8在25ml的补充2%(w/v)葡萄糖和IOmM尿苷的YP培养基在27°C以90rpm轻柔揽拌17小时。菌丝体通过使用Millipore Vacuum DrivenDisposable Filtration System (Mi 11 ipore, Bedford, MA, USA)过滤来收集，并用去离子水洗涤两次和用I. 2M山梨醇洗涤两次。生成原生质体，即，将经洗涤菌丝体在34°C以90rpm轻柔振荡悬于含有 15mg每ml 的GLUCANEX 200G (Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)和 O. 36 单位每 ml 的壳多糖酶(Sigma Chemical Co. ,St。Louis, MO, USA)的 20ml 的 I. 2M 山梨醇中15-25分钟。通过在400x g离心7分钟并用冷I. 2M山梨醇洗涤两次来收集原生质体。将原生质体使用血细胞计数器计数，并重悬于STC中至最终浓度为Ix IO8个原生质体/ml。将过量的原生质体在-80°C储藏于Cryo I°C Freezing Container (Nalgene,Rochester, NY, USA)。将大约各10 μ g的下文实施例中所述的缺失盒用Not I (实施例13和20)或HindIII/Bgll (实施例17)消化。将每个消化反应物通过TAE缓冲液中的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，将DNA条带从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit提取。将所得纯化DNA添加至100 μ I的原生质体溶液，并轻柔地混合。添加PEG缓冲液(250 μ I)，混合，并在34°C温育30分钟。然后添加STC (3ml)，混合，并铺板于补充IM蔗糖的PDA培养基。在28°C温育16小时之后，将15ml的补充100 μ g每ml的潮霉素B的覆层PDA培养基添加至各平板，将平板在28°C温育4-6日。实施例13 :枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因缺失里氏木霉菌株DAtwl8_97的生成将里氏木霉菌株981-0-8原生质体使用实施例12中所述的方法用Not I-直链化的pDAtwl8转化以缺失枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因。在含有25yg每ml的潮霉素B的PDA平板上选择一百六十六个转化体。将转化体传代培养至PDA平板以生成孢子。将每个转化体在含有25ml的纤维素酶诱导培养基pH 6. O的125ml带挡板的摇瓶中培养，并在28°C以200rpm振荡温育7日。运行里氏木霉菌株981-0-8作为对照。在接种后7日移出培养液样品，在微离心机中以15，700xg离心5分钟，并将上清转移至新管。对上述上清进行使用合成底物N-琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(AAPF) (Bachem AG, Bubendorf, Switzerland)蛋白酶测定法以确定是否有任何转化体缺失枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因。底物最初溶解于浓度为100mg/ml的二甲亚砜。然后将溶解底物50倍稀释于IOOmM NaCl-IOOmM MOPS pH 7.0。通过在平底96孔板(Corning Inc. , Acton, MA, USA)中将各10 μ I的转化上清添加至100 μ I的稀释底物来起始反应。将反应平板在50°C温育3小时，然后使用SPECTRAMAX Microplate Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)测量在 405nm 的吸光度。将里氏木霉 DAtwl8 转化体的蛋白酶活性与亲本株里氏木霉菌株981-0-8的相比较。
然后通过Southern分析来分析与里氏木霉菌株981_0_8相比较显示较低胞外蛋白酶活性的十五个转化体。如实施例11中所述提取来自15个转化体的基因组DNA，并取各 2 μ g 用 20 单位的 Nco I-HF (New England Biolabs, Inc. , Ipswich, MA, USA)在 37°C 消化16小时。将消化的DNA通过使用TAE缓冲液的O. 7%的琼脂糖凝胶电泳分级4小时，并使用 TURBOBLOTTER (Schleicher&Schuell BioScience, Keene, NH, USA)遵循生产商的推荐印迹于 NYTRAN SuperCharge 膜(Schleicher&Schuell BioScience, Keene, NH, USA)进行16小时。将膜与502bp异羟洋地黄毒苷配基标记的枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因探针杂交，所述探针通过藉由使用如下所示 的引物067911(有义)和067912(反义)的PCR并入异羟洋地黄毒苷配基-ΙΙ-dUTP来合成。引物067911(有义)GCGGTCATTTACAGTGCCTCGAATA(SEQ ID NO:51)引物996117(反义)CTGCTCTGTTAGCAATCCTCAAGCA(SEQ ID NO:52)扩增反应物(50μ I)包含 IX ThermoPol Reaction 缓冲液，5 μ I 的 PCRDIGLabeling Mix，IOng 的 pDAtwl8，O. 3 μ M 引物 067911，O. 3 μ M 引物 067912，和 2. 5 单位的Taq DNA聚合酶。反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中温育，程序如下30个循环，每个在95°C进行30秒，56°C进行30秒，和72°C进行40秒(15分钟延伸)。将五微升的PCR产物通过使用TAE缓冲液的I. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行大小选择，用溴乙锭染色，并在UV透照器下显色。异羟洋地黄毒苷配基的并入通过分子量增加指示。杂交在DIG Easy Hyb 缓冲液(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis,IN，USA)中在42°C进行17小时。然后将膜在高严格条件下在2X SSC加O. 1%SDS中在室温洗涤5分钟，接着在65°C在O. 5X SSC加O. 1%SDS中洗涤两次各15分钟。通过化学发光测定法(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)遵循生产商的指不检测探针-革巴杂合物。Southern分析表明所有15个转化体在枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因基因座中含有缺失盒的单个整合，而在其他基因座不含缺失片段的任何其他整合。选择一个命名为里氏木霉DAtwl8-97的菌株用于后续转化。实施例14 :质粒pSaMe-AaXYL的构建构建质粒pSaMe-AaXYL以包含里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和终止子和棘孢曲霉GHlO木聚糖酶编码序列。棘孢曲霉木聚糖酶的克隆大致遵循H. Dalb0ge等，1994，Mol. Gen. Genet. 243 :253-260概述的总体表达克隆实验方案。从棘孢曲霉CBS 101. 43菌丝体分离RNA。将Poly (A) +RNA从总RNA通过寡聚(dT)纤维素上的层析分离。如 Maniatis 等(Molecular cloning :laboratory manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1982)所述合成双链 cDNA。在合成之后，将 cDNA 用绿豆核酸酶处理，用T4DNA聚合酶平端化，并连接于非回文的Bst XI衔接头(Invitrogen,Carlsbad, CA，USA)。将cDNA通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳进行大小分级，其中将600bp至4000bp范围的片段用于文库构建。将DNA在GALl启动子和异_1_细胞色素c终止子之间连接入BstXI-消化的pYES 2. 0，并转化入大肠杆菌MC1061细胞(StrataGene，La Jolla, CA，USA)。将文库铺板于LB平板并在37°C温育过夜。将菌落从平板刮取，并重悬于补充IOOyg每ml的氨节青霉素的LB培养基。使用Plasmid Midi Kit (QIAGEN Inc.,Valenicia, CA, USA)分离质粒DNA。将纯化的质粒DNA汇集。将纯化的质粒DNA混合物转化入酿酒酵母W3124细胞(MATa;ura 3-52 ;leu
2-3,112 ;his 3-D200 ;pep 4-1137 ；prcl::HIS3；prbl: LEU2 ；cir+ ；van denHazel 等，1992，Eur. J. Biochem. 207 :277-283)。培养、转化和培养基如 Guthrie 等，1991，Meth.Enzymol. Vol 194, Academic Press所述。将转化细胞在30°C铺板于含有2%葡萄糖的合成完全琼脂3日，在3日之后,将菌落复制铺板至含2%半乳糖的SC培养基(Sherman,2002, Methods Enzymol. 350 :3-41),并在30 °C温育4日。表达木聚糖酶的菌落通过含 O. 1%AZCL-Birch-Xylan 的 1% 琼脂糖覆层在 pH 4. 5 鉴定(D Dalb0ge, 2006，FEMSMicrobiology Reviews 21 :29_42)。表达木聚糖酶活性的菌落有蓝色区围绕。从阳性克隆拯救的质粒DNA含有大约I. 3kb的DNA插入物。分离的基因片段的测序揭示了 1218bp开读框，其编码具有43. OkDa的理论分子量的多肽。将cDNA片段亚克隆入用Bam HI和Xho
I消化的曲霉属表达载体 pHD464(D Dalb0ge和 Heldt-Hansen, 1994, Mol. Gen. Genet. 243, 253 - 260)，即用 Bam HI 和Xho I 切割克隆，并分离 I. 2kb cDNA插入物(Christgau等，1996，Biochem. J 319:705-712)以生成质粒 pA2X2。对棘孢曲霉GHlO木聚糖酶编码序列使用质粒pA2x2作为模板和如下所示的引物153505和153506使用标准方法进行PCR扩增以得到大约I. 2kb片段。将I. 2kb片段用BamHI和Xho 1(已导入PCR引物)消化，并克隆入载体pCaHj527(W0 2004/099228)。所得质粒命名为pMT2155，其中cDNA处于来自黑曲霉的中性淀粉酶11 (NA2)启动子和来自黑曲霉的AMG终止子的转录调控之下。引物153505:5， -TCTTGGATCCACCATGGTCGGACTGCTTTCAATCACC-3’ (SEQ ID NO:53)引物153506:5， -TTAACTCGAGTCACAGACACTGCGAGTAATAGTC-3’ (SEQ ID NO:54)设计两个如下所示的合成寡核苷酸引物以从质粒pMT2155PCR扩增棘孢曲霉GHlO基因，并将用于插入的侧翼区导入表达载体PMJ09 (W0 2005/056772)。粗体字母代表编码序列，而剩余的序列与PMJ09的插入位点同源。正向引物5，-cggactgcgcaccatggt.CggactgCttt.caat -3，(SEQ ID NO :55)反向引物5，-tcgccacggagcttattcacagacactgcgagtaat-3，(SEQ ID NO:56)扩增反应物包含50皮摩尔的上述各引物，50ng的pMT2155，I μ I的IOmM的dATP，dTTP, dGTP 和 dCTP 的混合物，5 μ I 的 10Χ ACCUTAQ DNA 聚合酶缓冲液(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)，和 5 单位的 ACCUTAQ DNA 聚合酶(Sigma-Aldrich，St. Louis,MO, USA)，最终体积为 50 μ I。将EPPENDORF , MASTERCYCLER 5333 用于扩增 DNA 片段，其程序如下1个循环在95°C进行3分钟；和30个循环，每个在94°C进行45秒，55°C进行60秒，和72°C进行I分30秒。在30个循环之后将反应物在72°C进行温育10分钟然后冷却至4°C直至进一步加工。反应产物通过使用TAE缓冲液的I. 0%的琼脂糖凝胶电泳分离，其中将I. 2kb产物条带从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示纯化。然后将片段使用IN-FUSION Cloning Kit (Clontech, Inc.，Palo Alto, CA, USA)克隆入PMJ09。将载体用Nco I和Pac I消化并通过如上所述的琼脂糖凝胶电泳纯化。将I. 2kb基因片段和消化的载体在反应中连接在一起得到表达质粒pSaMe-AaXYL，其中家族GHlO基因的转录处于里氏木霉cbhl启动子的调控之下。连接反应物(50 μ I)包含IXIN-FUSI0N 缓冲液(Clontech, Inc.，Palo Alto, CA, USA)，IX BSA, I μ I 的 IN-FUSION 酶(I : 10 稀释)(Clontech, Inc. , Palo Alto, CA, USA), IOOng 的用 Nco I 和 Pac I 消化的pAlLo2，和IOOng的棘孢曲霉GHlO木聚糖酶纯化的PCR产物。将反应物在室温温育30分钟。将一 μ I的反应物用于依照生产商转化大肠杆菌XLlO SOLOPACK. Gold细胞(StrataGene, La Jolla, CA, USA)。含有pSaMe-AaXYL(图18)的大肠杆菌转化体通过限制酶消化检测，并使用BIOROBOT 9600制备质粒DNA。来自pSaMe-AaXYL的棘孢曲霉GHlO基因的DNA测序使用染料终止子化学(Giesecke等，1992, Journal of Virology Methods38 :47-60)和引物步移策略进行。实施例15 :枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶缺陷菌株DAtwl8_97中的棘孢曲霉GHlO木聚糖酶表达原生质体依照实施例12中描述的步骤从枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶缺陷菌株里氏木霉DAtwl8-97生成，并用含有棘孢曲霉GHlO木聚糖酶编码序列的里氏木霉表达构建体PSaMe-AaXYL(实施例14)转化以确定由里氏木霉DAtwl8_97表达的棘孢曲霉木聚糖酶GHlO的稳定性。通过将大约3 μ g的经Pme I消化并经凝胶纯化的pSaMe-AaXYL添加至100 μ I的原生质体溶液并轻柔地混合来进行转化。添加PEG缓冲液(250 μ I)、混合，并在37°C温育30分钟。然后添加STC (3ml)，混合，并铺板于COVE平板。将平板在28°C温育7-10日。在C0VE2平板上的单轮孢子纯化之后，将20个转化体在含有25ml的纤维素酶诱导培养基的小规模摇瓶中在28°C生长5日，之后通过在微离心机中在15，700xg离心10分钟来收集上清。棘孢曲霉GHlO木聚糖酶的表达使用8_16%CRITERI0N Tris-HCl凝胶(Bio-RadLaboratories,Hercules, CA,USA)与CRITERION Cell (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA，USA)进行分析。将5 μ I的第5日样品悬于2Χ浓度的Laemmli Sample缓冲液(Bio-RadLaboratories, Hercules, CA, USA),并在5%β -巯基乙醇的存在下在95°C加热5分钟。将所有样品加载于CRITERION Tris-HCl凝胶，并在IX Tris/Glycine/SDS运行缓冲 液(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)中进行电泳。将所得凝胶用 BI0-SAFE Coomassie Stain (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)染色。培养物的 SDS-PAGE概貌显示主要是全长棘孢曲霉GHlO木聚糖酶蛋白的存在，但亦有以较低量存在的较小片段。结果表明用于产生棘孢曲霉GHlO木聚糖酶的枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的缺失并未完全阻止蛋白质的蛋白水解。实施例16 :里氏木霉天冬氨酸蛋白酶基因缺失质粒PAgJglll的构建构建缺失载体pAgJglll以破坏里氏木霉42kDa天冬氨酸蛋白酶(SEQ ID NO: 3为DNA序列，而SEQ ID NO: 4为推导的氨基酸序列)在里氏木霉菌株981-0-8中的表达。首先通过使用如下所示的引物066694(有义)和066695(反义)扩增天冬氨酸蛋白酶编码区加减编码区的上游和下游600bp来生成质粒pAgJgllO。
引物066694(有义)ACGAATGGTCAAAGGACTATGTATCAT(SEQ ID NO :57)引物066695(反义)CACATACCCAGAGTCAGGCCCTGCG(SEQ ID NO :58)天冬氨酸蛋白酶区通过PCR在反应中扩增，反应物包含316ng的里氏木霉菌株981-0-8 基因组 DNA (实施例 10), I μ I 的 Herculase II Fusion DNA 聚合酶(StrataGene,LaJolla, CA, USA) ,50pmo I 的引物 066694，50pmo I 的引物 066695，5μ I 的 10 mM dNTP, 5 μ I的 5Χ Herculase II 反应缓冲液(StrataGene, LaJolla, CA, USA)，和 35 μ I 的水。将反应物在EPPENDORF MAST_ERCYCLE.R 5333中温育，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行20秒，60°C进行20秒，和72°C进行I分30秒；I个循环在72°C进行3分钟；和4°C维持。将2. 5kb PCR片段通过使用TAE缓冲液1%的琼脂糖 凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK GelExtraction Kit依照生产商的指示提取。将凝胶纯化的PCR片段用Taq DNA聚合酶处理以在反应中对片段添加3’ A-悬突，反应物包含5 μ I的纯化PCR片段，I μ I的IOX Thermopol缓冲液(New EnglandBiolabs, Inc, Ipswich, MA, USA)，0. 5 μ I 的 IOmM dNTP, 0· 5 μ I 的 Taq DNA 聚合酶，和3μ1的水。将反应物在72°C温育15分钟。将天冬氨酸蛋白酶基因片段依照生产商的指示克隆入pCR 2.1-TOPO 以生成pAgJgllO。克隆反应物包含2μ I的天冬氨酸蛋白酶 PCR 片段，I μ I 的盐溶液(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 μ I 的水，和 I μ I 的pCR 2.1-TOPO 。为了构建质粒pAgJglll，将pAgJgllO在反应中用Bmg I和BstEII消化，反应物包含 5μ g 的 pAgJgllODNA，3y I 的 Bmg I，3 μ I 的 BstEII，10 μ I IOXNEB Buffer 3 (NewEngland Biolabs, Inc, Ipswich,MA,USA), I μ I IOOX BSA,和 53 μ I 的水。将pAgJgllO 的消化物在37°C温育I小时，然后在60°C温育I小时。然后通过添加各10 μ I的IOmM dNTP，和12. 5 单位的 DNA聚合酶 I,大(Klenow)片段(New England Biolabs, Inc, Ipswich,MA,USA)将消化的PAgJgllO平端化。将反应物在37°C温育15分钟。将消化的、平端化的pAgJgllO通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳来纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。将质粒pHT (Cummings 等，1999, Current genetics 36 :371-382)在反应中用 HindIII 和 Ava I 消化，反应物包含 I. 86 μ g 的pHT DNA，3yl 的 Hind ΙΙΙ，3μ1 的 Ava Ι,ΙΟμ I的 IOX NEB BUFFER 2 (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA)，和 51 μ I 的水，在37°C进行2. 5小时，然后通过添加10 μ I的IOmMdNTP和12. 5 μ I单位的DNA聚合酶I，大(Klenow)片段和在37°C温育15分钟来平端化。将消化的、平端化的pHT通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，并将I. 9kb片段从凝胶切出并使用QIAQUICK GelExtraction Kit依照生产商的指示提取。在反应中使用T4DNA Ligase将来自pAgJgllO和pHT的所得片段连接在一起以形成PAgJglll (图19)，反应物包含88ng的pHT片段，106ng的pAgJgllO片段，I. 5 μ I的IOX T4DNA Ligase Buffer(New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), I μ I 的 T4DNALigase (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA),和 0·5μ1 的水。
实施例17 :天冬氨酸蛋白酶基因缺失里氏木霉菌株AgJgl 11-50的生成使用实施例12中所述的方法用Hind II I/Bgl I-直链化的pAgJglll转化里氏木霉菌株981-0-8原生质体以缺失天冬氨酸蛋白酶基因。在含有25yg每ml的潮霉素B的PDA平板上选择了九十个转化体。将转化体传代培养至PDA平板以生成孢子。在天冬氨酸蛋白酶基因座中含有pAgJglll缺失载体，由此破坏天冬氨酸蛋白酶的表达的里氏木霉菌株981-0-8的可能候选物，是通过使用Suzuki等,2006,J. Bioscience and Bioengineering 102 :572-574 的修饰的实验方案的 Fungal ColonyPCR进行筛选的。将来自各候选物的少量孢子悬于25μ I的TE缓冲液，并在微波炉中以高档位和加热I分钟。将经微波处理的孢子悬液在PCR反应中用作模板以筛选天冬氨酸蛋白酶缺失。反应物包含1μ I的孢子悬液，各1μ I的IOmM dNTP，12. 5μ1的2Χ ADVANTAGE⑧ GC-Melt LA 缓冲液(Clontech，Mountain View, CA, USA) ,25pmol 的引物 066694(16)，25pmol 的引物 066695(实施例 16),1. 25 单位的 ADVANTAGE GCGenomic LAPolymerase Mix (Clontech, Mountain View, CA, USA),和 9. 25 μ I 水。将反应 物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行10分钟；35个循环，每个在95°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行4分30秒；I个循环在72°C进行5分钟；和4°C维持。用于该筛选的引物起初用于扩增天冬氨酸蛋白酶区。若将缺失载体插入天冬氨酸蛋白酶基因座，扩增的PCR片段应大于野生型片段，因为其含有用于破坏天冬氨酸蛋白酶基因的hph盒。对在第一 Fungal Colony PCR筛选中显示一个较大条带的候选物使用如下所示的引物进行第二 PCR筛选。引物068331(有义)ATATCTCTCTCGAGGCCTGCTTATT(SEQ ID NO:59)引物067947(反义)CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA(SEQ ID NO:60)引物068331在缺失菌株中含有的天冬氨酸蛋白酶基因的5’区上游，且引物067947在hph盒中。仅那些含有天冬氨酸蛋白酶破坏的候选物会产生PCR片段。扩增反应包含1μ I的来自候选物的基因组DNA(依照实施例10提取)，各Iy I的IOmM dNTP,12. 5μ I的 2XADVANTAGE_ (;C-Melt LA Buffer, 25pmoI 的引物 068331，25pmol 的引物 067947，0. 25μ I I. 25 单位的ADVANTAGE GC Genomic LA POLYMERASE Mix，和 9. 25 μ I 的水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER. 中温育，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行2分钟；1个循环在72°C进行5分钟；和4°C维持。进行了 Southern印迹分析以确证通过质粒pAgJglll的天冬氨酸蛋白酶基因破坏。基因组DNA从缺失菌株和里氏木霉菌株981-0-8如实施例10中所述提取。将两μ g的来自缺失菌株和里氏木霉菌株981-0-8的基因组DNA，以及Ing的来自pAgJglll的质粒DNA用Nco I和PvuII消化。将里氏木霉菌株981-0-8和pAgJglll包括在Southern印迹中作为对照。基因组DNA消化反应物包含2 μ g的基因组DNA，I μ I的Nco I，I μ I的PvuII，5μ I的10ΧΝΕΒ BUFFER 2，和水至50 μ I。将两种基因组DNA消化物在37°C温育大约14-16小时。将质粒PAgJglll在反应中消化，反应物包含Ing的pAgJglllDNA，0. 5μ I的Nco I，O. 5μ I的ΡνιιΙΙ，2μ I的10Χ NEB BUFFER 2，和水至20μ I。将消化物在37°C温育大约I小时。对消化物进行使用TAE缓冲液的O. 7%的琼脂糖凝胶电泳，并遵循生产商的推荐使用TURBOBLOTTER 印迹于NYTRAN Supercharge印迹膜进行14-16小时。将膜与500bp异羟洋地黄毒苷配基标记的里氏木霉42kDa天冬氨酸蛋白酶探针杂交，所述探针通过藉由使用如下所示的引物068128(有义)和068129(反义)的PCR并入异羟洋地黄毒苷配基-ΙΙ-dUTP来合成。引物068128(有义)AGTCAGGTTCAGCAGATCGCCAGGGATGG(SEQ ID NO:61)引物O68I29 (反义)GTGGTTCTCCAACGCCGCCAGCAGC(SEQ ID NO:62)
扩增反应物包含5μ I的IOX ThermoPol Reaction缓冲液，2. 5 μ I的PCRDIG Labeling Mix，2ng 的 pAgJglll，50pmol 的引物 068128，50pmol 的引物068129，2. 5 μ I的IOmM dNTP, 5单位的Taq DNA聚合酶，和35. 5 μ I的水。将反应在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中温育，其程序如下1个循环在95°C进行
2分钟；30个循环，每个在95°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行40秒；1个循环在72°C进行15分钟；和4°C维持。将PCR反应产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。异羟洋地黄毒苷配基的并入通过分子量的增加指示。杂交在DIG Easy Hyb缓冲液中在42°C进行15_17小时。然后将膜在室温在高严格条件下在2X SSC加O. 1%SDS中洗涤5分钟，接着在65 °C在O. 5XSSC加O. 1%SDS中洗漆两次各15分钟。探针-IE杂合物的检测是通过化学发光测定法(Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN,USA)遵循生产商的指示进行。含有天冬氨酸蛋白酶缺失的菌株命名为里氏木霉AgJgl11-50。实施例18 :天冬氨酸蛋白酶缺陷菌株AgJgl 11-50中的棘孢曲霉GHlO木聚糖酶表达为了确定42kDa天冬氨酸蛋白酶的缺失是否有效地消除了棘孢曲霉GHlO木聚糖酶的降解，将含有棘孢曲霉GHlO木聚糖酶编码序列的质粒pSaMe-AaXYL (实施例14)转化入里氏木霉AgJgl 11-50。里氏木霉AgJgl 11-50的原生质体如实施例12中所述生成，并用质粒pSaMe-AaXYL转化。从COVE平板随机选择含有棘孢曲霉GHlO木聚糖酶的二十个转化体，并在含有25ml的纤维素酶诱导培养基pH 6. O的125ml摇瓶中培养，所述摇瓶用转化体孢子接种，并在28°C在200rpm振荡温育5日。运行里氏木霉菌株981-0-8和里氏木霉AgJglll-50两者作为对照。在接种后5日移出培养液样品，在微离心机中在15，700xg离心10分钟，并将上清转移至新管。通过使用8-16%CRITERI0N Tris-HCl 凝胶与 CRITERION Cell 的 SDS-PAGE 分析上清。将五μ I的第5日样品悬于2Χ浓度的Laemmli Sample Buffer,并在5%β -巯基乙醇存在下在95°C进行加热5分钟。将所有样品加载于SDS-PAGE凝胶上，并在IX Tris/Glycine/SDS运行缓冲液中进行电泳。将所得凝胶用BI0-SAFE Coomassie Stain染色。SDS-PAGE分析表明用于产生棘孢曲霉GHlO木聚糖酶的天冬氨酸蛋白酶基因缺失并未完全阻止蛋白质的蛋白水解。天冬氨酸蛋白酶缺失菌株里氏木霉AgJglll-50并未展示任何蛋白的任何不寻常的表达样式，并与亲本株里氏木霉菌株981-0-8表现类似。实施例19 :里氏木霉胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因缺失质粒pAgJgll6的构建构建缺失载体pAgJgll6以破坏里氏木霉25kDa胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因(SEQ ID NO: 5为DNA序列，而SEQ ID NO:6为推导的氨基酸序列)的表达。首先通过扩增5’和3’侧翼区并将其克隆入载体pCR 2.1-TOPO 来生成质粒pAgjgiie。5’侧翼区包含25kDa丝氨酸蛋白酶编码区上游的区，和25kDa胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶编码区的一部分。5’侧翼区使用如下所示的引物067518(有义)和067519(反义)扩增。将引物067518工程改造为在引物5’端含有Asc I和Not I位点。将引物067519工程改造为在引物5’端含有Asc I位点。引物067518(有义)AAAGGCGCGCCGCGGCCGCGAAGAAGAAGAAGAACGTGAAAGAG(SEQ IDN 0:63)引物O675I9 (反义)
·
AAAGGCGCGCCCGGTCGAGCCGGCCACGGGGTCGGA(SEQ ID NO:64)胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的5’区通过PCR在反应中扩增，反应物包含175 μ g的里氏木霉基因组DNA (实施例10) , I μ I的Herculase II Fusion DNA聚合酶，50pmol 的引物 067518，50pmol 的引物 067519，各 5μ I 的 IOmM dNTP, 5 μ I 的 5ΧHerculase II 反应缓冲液(StrataGene, LaJolla, CA, USA),和 31 μ I 的水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行20秒，60°C进行20秒，和72°C进行45秒；1个循环在72°C进行3分钟；和4°C维持。将I. 5kb PCR片段通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QlAQUICIC Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。将凝胶纯化的PCR片段用Taq DNA聚合酶处理以在反应中将3’ A-悬突添加至片段，反应物包含 5 μ I 的纯化 PCR 片段，I μ I 的 IOX Thermopol 缓冲液，各 O. 5 μ I 的 IOmM dNTP, O. 5 μ I的Taq DNA聚合酶，和3μ I的水。将反应物在72°C温育15分钟。将胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶片段的5’区在反应中克隆入pCR 2.1-TOPO ,反应物包含2. 5μ I的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶5’区PCR片段，I μ I的盐溶液，I. 5 μ I的水，和I μ I的pCR 2.1-TOPO 。所得质粒命名为5’ SP-TOPO0将胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶片段的3’区使用如下所示的引物067520(有义)和067521 (反义)克隆入pCR 2.- ΡΟ ,,将引物067520工程改造为在引物5’端含有SbfI位点。将引物067521工程改造为在引物5’端含有SbfI和Not I位点。引物067520(有义)AAACCTGCAGGTCACCACCGCTGGCTGGTAAGCATCATC(SEQ ID NO:65)引物O6752U 反义)AAACCTGCAGGCGGCCGCACAAAGCTAGGAGTCTTGACGTGAT(SEQ ID NO:66)将胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的3’区通过PCR在反应中扩增，反应物包含175yg的里氏木霉基因组DNA(实施例10)，1μ1的Herculase II Fusion DNA聚合酶，50pmol 的引物 067520，50pmoI 的引物 067521，5 μ I 的 IOmM dNTPs, 5 μ I 的 5Χ Herculase
II反应缓冲液，和31 μ I的水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行20秒，60°C进行20秒，和72°C进行45秒；1个循环在72°C进行3分钟；和4°C维持。将I. 5kb PCR片段通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAC5UICK GelExtraction Kit依照生产商的指示提取。将凝胶纯化的PCR片段用Taq DNA聚合酶处理以在反应中将3’ A-悬突添加至片段，反应物包含5 μ I的纯化PCR片段，I μ I的IOXThermopol缓冲液，O. 5 μ I的IOmM dNTP, O. 5 μ I的Taq DNA聚合酶，和3 μ I的水。将反应物在72°C温育15分钟。将胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶片段的5’区依照生产商的指示在反应中克隆入pCR 2.1-TOPO ,反应物包含2. 5 μ I的5’胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶区PCR片段，I μ I的盐溶液，I. 5μ I的水，和I μ I的pCR 2.1-TOPO 。所得质粒命名为3’ SP-TOPO0将质粒5’ SP-TOPO用AscI消化并在反应中克隆入AscI消化的质粒pJfyS1579-41-ll(实施例9)，反应物包含12. 4 μ g的消化的5，SP-TOPO质粒DNA, 5 μ I的AscI,10 μ I 的 IOX NEB BUFFER 4 (New England Biolabs，Inc，Ipswich，MA，USA)，和 55 μ I的水。将限制性酶消化物在37°C温育2小时。将消化物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，其中将I. 5kb片段从凝胶切出并使用QIAQU丨CK Gel ExtractionKit依照生产商的指示提取。将AscI消化的5’ SP-TOPO片段在反应中连接至AscI消化 的 pJfyS1579-49-ll，反应物包含 282ng 的 AscI 消化的 5’SP-TOPO，120ng 的 Asc I 消化的pJfyS1579-49-ll,2 μ I 的 Quick Ligase(New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA),15 μ I 的 2X Quick Ligase Buffer(New England Biolabs,Inc,Ipswich,MA,USA),和 2 μ I的水。将连接反应物在室温温育15分钟。所得质粒命名为pJfyS1579+5’ SP。为了构建质粒pAgJgll6，将质粒 3’SP-T0P0 和 pJfyS1579+5’SP 用 SbfI 消化。消化物包含 7. 5μ g 的 P JfyS 1579+5’SP 或 12. 5μ g 的 3，SP_T0P0，5y I 的 SbfI, 10 μ I 的 10ΧNEB BUFFER 4，和55 μ I的水。将两种消化反应物在37°C温育过夜。将两μ I的小牛小肠碱性磷酸酶(CIP)添加至pJfyS1579+5’ SP消化反应物并在37°C再温育一小时。将来自pJfyS1579+5SP/Sbf I 的 9. 5kb 片段和来自 3SP_T0P0/SbfI 的 I. 5kb 片段通过使用 TAE 缓冲液的0. 8%的琼脂糖凝胶电泳纯化,从凝胶切出，并使用Q丨AQUICK. Gel ExtractionKit依照生产商的指示提取。将SbfI消化的3’SP-T0P0片段在反应中连接至SbfI消化的PJfyS1579+5’SP 片段，反应物包含 767ng 的 Sbf I 消化的 3’SP-T0P0, 380ng 的 Sbf I 消化的 pJfyS1579+5’SP，2y I 的 Quick Ligase, 15 μ I 的 2Χ Quick Ligase Buffer，和 1μ I 的水。将连接反应物在室温温育20分钟。所得质粒命名为pAgJgll6(图20)。实施例20 :胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因缺失里氏木霉菌株AgJgl 16-19的生成用Not I-直链化的PAgJgll6使用实施例12中所述的方法转化里氏木霉菌株981-0-8原生质体以缺失胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因。在含有25yg每ml的潮霉素B的PDA平板上选择九十个转化体。将转化体传代培养至PDA平板以生成孢子。将含有缺失载体pAgJgll6的里氏木霉菌株981-0-8的转化体在含有25ml的纤维素酶诱导培养基pH 6. O的125ml摇瓶中培养，所述摇瓶用转化体的孢子接种并在28°C在200rpm振荡温育5日。运行里氏木霉菌株981-0-8作为对照。在接种后5日移出培养液样品，在微离心机中在15，700xg离心10分钟，并将上清转移至新管。对各转化体的上清使用合成底物Val-Leu-Lys 4_硝基苯胺(Bachem AG，Bubendorf, Switzerland)测定蛋白酶活性。首先将底物以100mg/ml的浓度溶解于二甲亚砜。然后将溶解的底物用IOOmM NaCl-IOOmM MOPS pH 7. O稀释200倍。通过将10 μ I的各转化体上清添加至平底96孔板中的100 μ I的稀释底物来起始反应。将反应平板在50°C温育30分钟，然后使用SPECTRAMAX Microplate Reader测量405nm的吸光度。使用如下所示的引物对展示很少至没有蛋白酶活性的转化体进行PCR筛选。引物068155(有义)GCTGTTTGGCCCTCGAAACTGCCGG(SEQ ID NO:67)引物067947(反义)CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA(SEQ ID NO:68)引物068155在缺失菌株中含有的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的5’区上游，而引物067947在hph盒中。仅那些含有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶破坏的候选物会产生PCR片段。PCR筛选通过Fungal Colony PCR依照实施例17中所述的修饰的实验方案进行。将 来自各候选物的少量孢子悬于25 μ I的TE缓冲液中，并在微波炉中以高档位加热I分钟。将经微波处理的孢子悬液在PCR反应中用作模板以筛选天冬氨酸蛋白酶缺失。反应物包含I μ I 的孢子悬液，各 I μ I 的 IOmM dNTP, 12. 5μ I 的 2Χ ADVANTAGE GC-Melt LA 缓冲液，25pmol 的引物 068155，25pmoI 的引物 067947,1. 25 单位的ADVANTAGE GC GENOMELA POLYMERASE Mix，和9· 25 μ I 水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下I个循环在95°C进行10分钟；35个循环，每个在95°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行2分30秒；1个循环在72°C进行5分钟；和4°C维持。进行了 Southern印迹分析以确证通过载体pAgJgll6的25kDa胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的破坏。从缺失菌株和里氏木霉菌株981-0-8依照实施例10提取基因组DNA。将来自缺失菌株和里氏木霉菌株981-0-8的两μ g的基因组DNA，以及Ing的来自pAgJgll6的质粒DNA用Nco I和Sac I消化。里氏木霉菌株981-0-8和pAgJgll6包括在Southern印迹中作为对照。将基因组DNA在反应中消化，反应物包含2 μ g的基因组DNA，I μ I的NcoΙ, μ 的Sac Ι，5μ1 的 10Χ NEB BUFFER I (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA),0. 5 μ I的IOOX BSA，和水，反应体积为50 μ I。将两种消化物在37°C温育大约14-16小时。将质粒pAgJgll6在反应中消化，反应物包含Ing的PAgJgll6DNA，0. 5 μ I的Nco Ι，0· 5 μ I的 Sac Ι，2μ I 的 10Χ NEB BUFFER 1，(λ 2μ I 的 100Χ BSA，和水，反应体积为 20 μ I。将消化物在37 °C温育大约I小时30分钟。对消化物进行使用TAE缓冲液的0. 7%的琼脂糖凝胶电泳，并遵循生产商的推荐使用TURBOBLOTTER 印迹于NYTRAN Supercharge印迹膜14-16小时。将膜与500bp异羟洋地黄毒苷配基标记的里氏木霉25kDa胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶探针杂交，所述探针通过在使用如下所示的引物068128(有义)和068129(反义)的PCR过程中并入异羟洋地黄毒苷配基-ΙΙ-dUTP来合成。引物068233(有义)CAACCCAAAGATATCGCCAGATCCA(SEQ ID NO:69)引物068234(反义)ACGATAAACTCCCCCACGGCTGAAG(SEQ ID NO:70)扩增反应物包含5 μ I 的 10X ThermoPol Reaction 缓冲液，2. 5 μ I 的 PCRDIGLabeling Mix，2ng 的 pAgJgll6，50pmol 的引物 068233，50pmol 的引物 068234，2. 5μ I的IOmM dNTPs, 5单位的Taq DNA聚合酶，和35. 5 μ I水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育,程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个循环在95°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行40秒；I个循环在72°C进行15分钟；和4°C维持。将PCR产物通过使用TAE缓冲液I. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行大小选择，从凝胶切出，并使用QIAQUlCK(S)Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。异羟洋地黄毒苷配基的并入通过分子量的增加指示。在DIG Easy Hyb缓冲液中在42°C进行杂交15-17小时。然后将膜在室温在高严格条件下在2X SSC加O. 1%SDS中洗涤5分钟接着在65°C在O. 5X SSC加O. 1%SDS中洗涤两次各15分钟。探针-靶杂合物的检测是遵循生产商的指示通过化学发光测定法进行的。确证数个转化体含有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶缺失。选择一个转化体并命名为里氏木霉Agjgll6-19。实施例21 :胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶缺陷菌株Agjgll6_19中的棘孢曲霉GHlO木聚糖酶表达为了确定25kDa胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的缺失是否有效地阻止重组表达 的棘孢曲霉GHlO木聚糖酶的降解，将包含棘孢曲霉GHlO木聚糖酶编码序列的质粒pSaMe-AaXYL(实施例14)转化入里氏木霉Agjgll6_19菌株。如实施例12中所述生成里氏木霉AgJgl 16-19的原生质体，并用质粒pSaMe-AaXYL转化。从COVE平板随机选择三十六个含有棘孢曲霉GHlO木聚糖酶的转化体，并在含有25ml的纤维素酶诱导培养基pH 6. O的125ml摇瓶中培养，所述摇瓶用转化体的孢子接种并在28°C在200rpm振荡温育5日。运行里氏木霉菌株981-0-8和里氏木霉Agjgll6-19两者作为对照。在接种后5日移出培养液样品，在微离心机中在15，700x g离心10分钟，并将上清转移至新管。上清通过使用8-16%CRITERI0N Tris-HCl 凝胶与 CRITERION Cell 的 SDS-PAGE分析。将五μ I的第5日样品悬于2Χ浓度的Laemmli Sample Buffer,在5% β -巯基乙醇存在下在95°C进行加热5分钟。将所有样品加载于SDS-PAGE凝胶上并在IX Tris/Glycine/SDS运行缓冲液中进行电泳。将所得凝胶用BIO-SAFE Coomassie Stain染色。SDS-PAGE分析表明所有表达棘孢曲霉GHlO木聚糖酶的转化体均未产生任何木聚糖酶降解的痕迹。同样，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶缺失菌株里氏木霉AgJgl 16-19并未展示任何蛋白的任何不寻常的表达样式，并与亲本株里氏木霉菌株981-0-8表现类似。显示里氏木霉菌株981-0-8中25kDa胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的缺失有效地消除了棘孢曲霉GHlO木聚糖酶的降解。实施例22 :里氏木霉ku70基因缺失质粒pAgJgll5的构建构建缺失载体PAgJgll5以破坏里氏木霉ku70基因。需要破坏ku70以增加里氏
木霉中基因靶向的效率。首先通过扩增5’和3’侧翼区并将其克隆入载体pCR 2.1-TOPO 来生成质粒pAgJgll5。1.5kb 5’侧翼包含ku70基因上游的区以及ku70编码序列的一部分。使用如下所示的引物067491(有义)和067492(反义)扩增5’侧翼区。将引物067491工程改造为在引物5’端含有Asc I和Not I位点在。将引物067492工程改造为在引物5’端含有Asc I位点。引物067491(有义)5’ -AAAGGCGCGCCGCGGCCGCCCATGGTGAGAAGCCGGGTTCGGGAG-3’ (SEQ ID NO:71)
引物067492(反义)5，-AAAGGCGCGCC AGCCCTTGACAGTGATCTTGAGTCC-3，(SEQ ID NO :72)ku70基因的5’区通过PCR在反应中扩增，反应物包含175 μ g的里氏木霉基因组 DNA, I μ I 的 Herculase II Fusion DNA 聚合酶，50pmol 的引物 067491, 50pmol 的引物067492，5 μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 5Χ Herculase II Reaction 缓冲液(StrataGene)JP31 μ I的水。将反应物在EPPENDORF⑧MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行20秒，61°C进行20秒，和72°C进行45秒；1个循环在72°C进行3分钟；和4°C维持。将I. 5kb PCR片段通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用Q丨AQLMCK. Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。将凝胶纯化的PCR片段用Taq DNA聚合酶处理以在反应中将3’ A-悬突添加至片段，反应物包含5 μ I的纯化 PCR 片段，I μ I 的 IOX Thermopol 缓冲液，各 O. 5 μ I 的 IOmM dNTP, I μ I 的 Taq DNA 聚合酶，和3μ1的水。将反应物在72°C温育15分钟。将ku70片段的5’区在反应中克隆入pCR 2.1-TOPO ，反应物包含2. 5μ I的5’侧翼ku70PCR片段，1μ I的盐溶液， μ 的水，和1μ I的pCR 2.1-TOPO ，并将2μ I的反应物依照生产商的指示转化入ONE SHOT T0P10 化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen，Inc.，Carlsbad, CA，USA)。转化体在补充100 μ g每ml的氨苄青霉素2X YT琼脂平板上选择，并在37°C温育16小时。所得质粒命名为5’ ku70-T0P0o将ku70片段的3’区使用如下所示的引物067493(有义)和067494(反义)克隆入pCR 2.1-TOPO 。将引物067493工程改造为在引物5’端含有Sbf I位点。将引物067494工程改造为在引物5，端含有SbfI和Not I位点。引物067493(有义)5， -AAACCTGCAGGACAACATTGTGCATCGGCAAACGCC-3’ (SEQ ID NO:73)引物067494(反义)5’ -AAACCTGCAGGCGGCCGCAAAGTGCCGGGGGTGCCCCAAGTCG-3’ (SEQ ID NO:74)将ku70基因的3’区通过PCR在反应中扩增，反应物包含175 μ g的里氏木霉基因组 DNA, I μ I 的 Herculase II Fusion DNA 聚合酶，50pmol 的引物 067493, 50pmol 的引物067494，5 μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 5Χ HerculaseII Reaction 缓冲液，和 31 μ I 的水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行20秒，61°C进行20秒，和72°C进行45秒；1个循环在72°C进行3分钟；和4°C维持。将I. 5kb PCR片段通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用Ql AQU丨CK· Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。将凝胶纯化的PCR片段用Taq DNA聚合酶处理以在反应中将3’ A-悬突添加至片段，反应物包含5 μ I的纯化 PCR 片段，I μ I 的 10Χ Thermopol 缓冲液，各 O. 5 μ I 的 IOmM dNTP, I μ I 的 Taq DNA聚合酶，和3μ1的水。将反应物在72°C温育15分钟。将ku70片段的3’区在反应中克隆入pCR⑧2.1-TOPO⑧，反K、/:物包含2. 5μ I的3’侧翼ku70PCR片段，I μ I的盐溶液， μ 的水，和1μ I的pCR 2.1-TOPO ，并将2μ I的反应物依照生产商的指示转化入ONE SHOT T0P10化学感受态大肠杆菌细胞。转化体在补充100 μ g每ml的氨苄青霉素的2XYT琼脂平板上选择，并在37°C温育16小时。所得质粒命名为3’ ku70_T0P0。将质粒5 ’ ku70-T0P0用Asc I消化以供在反应中克隆入Asc I消化的质粒pJfyS1579-41-ll(实施例 9)，反应物包含 14. 6 μ g 的 5，ku70_T0P0 质粒 DNA，5 μ I 的 AscI，10 μ I的IOX NEB BUFFER 4，和55 μ I的水。将限制性酶消化物在37°C温育大约14-16小时。将消化物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，其中将I. 5kb片段从凝胶切出并使用Q丨AQU1CK Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。将Asc I消化的5’ ku70-T0P0片段在反应中连接至AscI消化的pJfyS1579_49_ll，反应物包含329. 6ng的AscI 消化的 5’ku70-T0P0，120ng 的 Asc I 消化的 pJfyS1579_49_ll，2 μ I 的 Quick Ligase,15μ I的2Χ Quick Ligase Buffer，和2μ I的水。将连接反应物在室温温育15分钟，并将4 μ I的连接反应物依照生产商的指示转化入ONE SHOT T0P10化学感受态大肠杆菌细胞。转化体在补充100 μ g每ml的氨苄青霉素的2X YT琼脂平板上选择，并在37°C温育16小时。所得质粒命名为pJfyS1579+5ku70。为了构建质粒pAgJgll5，将质粒 3’ku70-T0P0 和 pJfyS1579+5ku70 用 SbfI 消化。 pJfyS1579+5ku70 的消化物包含 3. 98 μ g 的 pJfyS1579+5ku70, 5 μ I 的 SbfI, 30 μ I 的 IOXNEB BUFFER 4，和 165 μ I 的水。3’ku70_T0P0 的消化物包含 13. 8 μ g 的 3’ku70_T0P0, 5 μ I的Sbfl，10 μ I的IOX NEB BUFFER 4，和55 μ I的水。将两种消化反应物在37°C温育4小时。将来自 pJfyS1579+5ku70/SbfI 的 9. 5kb 片段和来自 3，ku70-T0P0/SbfI 的 I. 5kb 片段通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用Q1AQUICK GelExtraction Kit依照生产商的指示提取。将SbfI消化的3’ku70_T0P0片段在反应中连接至SbfI消化的pJfyS1579+5ku70片段，反应物包含335. 8ng的Sbf I消化的3’ku70_T0P0，69. 76ng 的 Sbf I 消化的 pJfyS1579+5ku70，2 μ I 的 Quick Ligase, 20 μ I 的 2Χ QuickLigase Buffer,和2 μ I的水。将连接反应物在室温温育20分钟，并将5 μ I的连接反应物依照生产商的指示转化入ONE SHOT T0P10化学感受态大肠杆菌细胞。转化体在补充100 μ g每ml的氨苄青霉素的2XYT琼脂平板上选择，并在37°C温育16小时，所得质粒命名为 pAgJgll5(图 21)。实施例23 :在里氏木霉中生成ku70基因破坏用Not I-直链化的PAgJgll5使用之前在实施例12中描述的方法转化里氏木霉菌株981-0-8原生质体。将转化体铺板于PDA+1M蔗糖上，然后用含有PDA+10mM尿苷+潮霉素(100yg/ml)的薄层覆盖。将一百二十九个转化体传代培养至PDA平板上以生成孢子。在ku70基因座含有PAgJgl 15缺失载体，由此破坏ku70基因的里氏木霉菌株981-0-8的可能候选物，通过真菌孢子PCR使用Suzuki等,2006,见上文的经修饰的实验方案进行筛选。将来自各候选物的少量孢子悬于25μ I的TE缓冲液，并在微波炉中以高档位加热I分钟。将经微波处理的孢子悬液在PCR反应中用作模板以筛选丝氨酸蛋白酶缺失。反应物包含1μ I的孢子悬液，各1μ I的IOmM dNTP，12. 5μ1的2Χ ADVANTAGE GC-Melt LA 缓冲液，25pmol 的引物 067946，25pmol 的引物 067947，I. 25 单位的ADVANTAGE GC GEN0MELA POLYMERASE Mix，和 9. 25 μ I 水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行10分钟；35个循环，每个在95°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行2分30秒；I个循环在72°C进行5分钟；和4°C维持。引物067946位于5’侧翼区的上游，而引物067947位于hpt标志物中；仅在正确的基因座中具有缺失盒的菌株会生成PCR产物。鉴定出了里氏木霉菌株Agjgll8_02,其中ku70基因已破坏。引物067946(有义)5， -GCCAGG TGTCTGGCATGGCTGGCAAGCTGCGAC-3， (SEQ ID NO:75)引物067947(反义)5，-CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA-3’ (SEQ ID NO:76)对八个候选通过Southern印迹分析进行进一步衡量以确证里氏木霉ku70基因的破坏。从缺失菌株和里氏木霉菌株981-0-8如实施例10中所述提取基因组DNA。将两yg的来自缺失菌株和里氏木霉菌株981-0-8的基因组DNA，以及Ing的来自PAgJgll5的质粒DNA用Hind III和Bam HI消化。将里氏木霉菌株981-0-8和pAgJgll5包括在Southern印迹中作为对照。基因组DNA消化反应物包含2 μ g的基因组DNA，I μ I的Hind III，I μ I的 Bam ΗΙ，5μ I 的 IOX NEBBUFFER 2,0. 5μ I 的 100Χ BSA，和水至 50 μ I。将两种基因组DNA消化物在37°C温育大约14-16小时。将质粒pAgJgll5在反应中消化，反应物包含Ing的 pAgJglllDNA，0· 5μ I 的 HindIII，O. 5 μ I 的 BamHI, 2 μ I 的 10ΧΝΕΒ BUFFER2，0. 2μ I 的IOOX BSA，和水至20 μ I。将消化物在37°C温育大约I小时。对消化物进行使用TAE缓冲液的O. 7%的琼脂糖凝胶电泳，并遵循生产商的推荐使用TURBOBLOTTER 印迹于NYTRAM Supercharge印迹膜14-16小时。将膜与500bp异羟洋地黄毒苷配基标记的里氏木霉ku70基因探针杂交，所述探针通过藉由使用如下所示的引物068067(有义)和068068(反义)的PCR并入异羟洋地黄毒苷配基-ll_dUTP来合成。引物068067(有义)5，-CATCCACTCGGAGATGCTGA-3’ (SEQ ID NO:77)引物O68O68 (反义)5，-CGGAACTTGGTCTTTTCTGT-3’ (SEQ ID NO:78)扩增反应物包含5μ I的IOX ThermoPol Reaction缓冲液，2. 5 μ I的PCRDIG Labeling Mix，2ng 的 pAgJgll5，50pmol 的引物 068067，50pmol 的引物068068,2. 5μ I的IOmM dNTPs，5单位的Taq DNA聚合酶，和35. 5 μ I的水。将反应在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中温育，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行30秒，55 °C进行30秒，和72°C进行40秒；1个循环在72°C进行15分钟；和4°C维持。将PCR反应产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用Q丨AQLi丨CK Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。异羟洋地黄毒苷配基的并入通过分子量的增加指示。在DIG Easy Hyb缓冲液中在42°C进行杂交15-17小时。然后将膜在室温在高严格条件下在2X SSC加0. 1%SDS中洗涤5分钟，接着在65 °C在0. 5XSSC加0. 1%SDS中洗漆两次各15分钟。探针-IE杂合物的检测是通过化学发光测定法(Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN, USA)遵循生产商的指示进行的。含有ku70基因破坏的菌株命名为里氏木霉Agjgll5-104。破坏构建体PAgJgll5包含侧翼为直接重复的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因和大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因。插入直接重复以促进hpt和tk选择性标志物的切出。将来自里氏木霉AgJgl 15-104的孢子以Ix IO5和Ix IO6浓度铺板于含有I μ M5-氟_2’ -脱氧尿苷(FdU)的木霉属基本培养基平板，并在28°C温育。将十五个分离物传代培养于含有IuM FdU的木霉属基本培养基平板并在28°C温育。然后对该十五个分离物测试对潮霉素的敏感性，即将其传代培养于含25 μ g/ml潮霉素的PDA平板，并在28°C温育。这些分离物均无法在潮霉素平板上生长，表明hpt和tk标志物已从菌株切出。为了确证里氏木霉菌株Agjgll5_104缺乏tpt和tk标志物,通过Southern印迹衡量了两个分离物。从不含标志物的破坏菌株和里氏木霉菌株981-0-8如实施例10中所述提取基因组DNA。将两μ g的来自缺失菌株和里氏木霉菌株981-0-8的基因组DNA用HindIII和Bam HI消化。将里氏木霉菌株981-0-8包括在Southern印迹中作为对照。基因组DNA消化反应物包含2 μ g的基因组DNA，ly I的Hind ΙΙΙ，1μ1的Bam ΗΙ，5μ1的IOX NEBBUFFER 2，O. 5 μ I的100Χ BSA，和水至50 μ I。将两种基因组DNA消化物在37°C温育大约14-16小时 对消化物进行使用TAE缓冲液的O. 7%的琼脂糖凝胶电泳，并遵循生产商的推荐使用TURBOBLOTTER 印迹于NYTRAN Supercharge印迹膜14-16小时。如上所述将膜与500bp异羟洋地黄毒苷配基标记的里氏木霉ku70基因探针杂交。在DIG Easy Hyb缓冲液中在42°C进行杂交15_17小时。然后将膜在室温在高严格条件下在2X SSC加O. 1%SDS中洗涤5分钟，接着在65 °C在O. 5XSSC加O. 1%SDS中洗漆两次各15分钟。探针-IE杂合物的检测是通过化学发光测定法(Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN,USA)遵循生产商的指示进行的。将含有ku70基因破坏、不含标志物的菌株命名为里氏木霉AgJgl 15-104-7B1。实施例24 :单蛋白酶缺失里氏木霉菌株SMai-TrSP-30-22的生成用Not I-直链化的pDAtwl8 (实施例11)使用实施例12中所述的方法转化里氏木霉KU70-缺陷菌株AgJgl 15-104-7B1原生质体以缺失里氏木霉枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因。在含有10 μ g每ml的潮霉素B的PDA平板上选择三十六个转化体。将转化体传代培养至PDA平板以生成孢子。将使用Suzuki等,2006,见上文的经修饰的实验方案的Fungal孢子PCR用于筛选携带推定缺失的转化体，其中使用设计在枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因5’ -UTR中的有义引物(067871)和在3’ -UTR内的反义引物(067872)。引物067871(有义引物)5，-ACTTCGGGGGATGGAAGTACATAAACTG-3，(SEQ ID NO:79)引物067872(反义引物)5’-CTCGATTCGCCATTAGATGTTTTATACCTG-3’ (SEQ ID NO:80)仅当在枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因基因座中发生精确的基因取代时会生成5kb PCR产物。若盒整合在基因组其他位置，则会导致野生型3Kb枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的扩增。将来自各候选物的少量孢子悬于25 μ I的TE缓冲液，并在微波炉中以高档位加热I分钟。将经微波处理的孢子悬液在PCR反应中用作模板以筛选枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因缺失。反应物包含1μ I的孢子悬液，各1μ I的IOmM dNTP，12. 5μ1的2X ADVANTAGE GC-Melt LA 缓冲液，25pmol 的引物 067871，25pmol 的引物 067872，I. 25 单位的ADVANTAGE GCGENOME LA POLYMERASE Mix，和 9· 25μ I 水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行10分钟；35个循环，每个在94°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行5分30秒；I个循环在72°C进行15分钟；和4°C维持。将里氏木霉菌株SMai-TrSP-30鉴定为缺失枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因。缺失构建体pDAtwl8包含侧翼为直接重复的阳性选择性潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因和其他编码阴性选择性胸腺嘧啶激酶(tk)基因。插入直接重复以促进hpt和tk选择性标志物的切出和生成不含标志物的菌株，从而可将其用作宿主以缺失第二蛋白酶基因。将来自里氏木霉SMai-TrSP-30的孢子以Ix IO5和Ix IO6的浓度铺板于含有I μ M5-氟_2’ -脱氧尿苷(FdU)的木霉属基本培养基平板，并在28°C温育。将二十三个分离物 传代培养于含有I μ M FdU的木霉属基本培养基平板，并在28°C温育。然后对所有23个分离物通过真菌孢子PCR以实施例26中所述相同的方式筛选hpt和tk标志物的缺乏。进行了 Southern印迹分析以确证枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的缺失和hpt和tk标志物的缺乏。如之前实施例10中所述从缺失菌株和里氏木霉ku70缺失菌株AgJgl 15-104-7B1提取基因组DNA，并将各2 μ g用20单位的Nco I-HF 在37°C消化16小时。将消化的DNA通过使用TAE缓冲液的O. 7%的琼脂糖凝胶电泳分级4小时，并遵循生产商的推荐使用TURBOBLOTTER 印迹于NYTRAN SuperCharge膜16小时。将膜与502bp异羟洋地黄毒苷配基标记的枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因探针杂交，所述探针通过如上所述藉由使用引物067911(有义)和067912(反义)的PCR并入异羟洋地黄毒苷配基-ΙΙ-dUTP来合成。扩增反应物(50μ I)包含 IX ThermoPol Reaction Buffer, 5 μ I 的 PCR DIGLabeling Mix, IOng 的 pDAtwl8，0. 3 μ M 引物 067911，0· 3 μ M 引物 067912，和 2. 5 单位的Taq DNA聚合酶。将反应在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中温育，程序如下30个循环，每个在95°C进行30秒，56°C进行30秒，和72°C进行40秒(15分钟最终延伸)。将五微升的PCR产物通过使用TAE缓冲液I. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行大小选择，用溴乙锭染色，并在UV透照器下显示。异羟洋地黄毒苷配基的并入通过分子量的增加指示。在DIG Easy Hyb 缓冲液(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN,USA)中在42°C进行杂交17小时。然后将膜在室温在高严格条件下在2X SSC加0. 1%SDS中洗涤5分钟，接着在65°C在0. 5X SSC加0. 1%SDS中洗涤两次各15分钟。探针-靶杂合物的检测是通过化学发光测定法(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)遵循生产商的指示进行的。将含有枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因缺失、不含标志物的菌株命名为里氏木霉SMai-TrSP-30-22。实施例25 :里氏木霉胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因缺失质粒PAgJgll7的构建构建缺失载体pAgJgll7以缺失里氏木霉25kDa胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因。首先通过扩增5’和3’侧翼区并将其克隆入载体pCR_ 2.1-TOPO_ 生成质粒pAgJgll7。5’侧翼区包含25kDa丝氨酸蛋白酶编码区上游的1.5kb区。5’侧翼区使用如下所示的引物068616(有义)和068617(反义)扩增。将引物068616工程改造为在引物5’端含有AscI和Not I位点。将引物068617工程改造为在引物5’端含有Asc I位点。引物068616(有义)5， -AAAGGCGCGCCGCGGCCGCAAAACACACACAATAACCAACCCCCA-3’ (SEQ ID NO:81)引物O686I7 (反义)5’ -AAAGGCGCGCC TGCGATGGAGGAAAAGCTGCGAGGGATGA-3’ (SEQ ID NO:82)将胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的5’区通过PCR在反应中扩增，反应物包含175 μ g的里氏木霉基因组DNA，ly I的PLAT丨NUM Pfx DNA聚合酶，50pmol的引物068616，50pmol 的引物 068617，各 L 5μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 IOXPfx Amplification 缓冲液，和33. 5μ I的水。将反应物在EPPE.NDORF iV1ASTERCYCLE.R 中温育，程序如下1个循环在98°C进行3分钟；30个循环，每个在98°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行I分30秒；1个循环在72°C进行15分钟；和4°C维持。将I. 5kb PCR片段通过使用TAE缓 冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUiCK Gel ExtractionKit依照生产商的指示提取。将凝胶纯化的PCR片段用Taq DNA聚合酶处理以在反应中将3’ A-悬突添加至片段，反应物包含5 μ I的纯化PCR片段，I μ I的IOX Thermopol缓冲液，各O. 5 μ I的IOmM dNTP, O. 5 μ I的Taq DNA聚合酶，和3 μ I的水。将反应物在72°C温育15分钟。将胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶片段的5’区在反应中克隆入pCR 2.1-TOPO ，反应物包含3μ I的5’胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶区PCR片段，1μ I的盐溶液，Iy I的水，和Iy I的pCR_ 2.1-ΤΟΡΟ_ 。所得质粒命名为 5’ Serine。将胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶片段的3’区使用如下所示的引物068618(有义)和068619(反义)克隆入pCR 2.1-TOPO 。将引物068618工程改造为在引物5’端含有SbfI位点。将引物0668619工程改造为在引物5’端含有Sbf I和Not I位点。引物068618(有义)5’ -AAACCTGCAGGGCGATTCCCTGTGTTGGCAACCAAA-3’ (SEQ ID NO:83)引物068619(反义)5， -AAACCTGCAGGCGGCCGCAAGAAATACTCAGGAAAGGTGCCCA-3， (SEQ ID NO:84)通过PCR在反应中扩增胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的3’区，反应物包含175 μ g的里氏木霉基因组DNA，ly I的PLATINUM Pfx DNA聚合酶，50pmol的引物068618，50pmol 的引物 068619，各 I. 5μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 IOXPfx Amplification 缓冲液，和33. 5μ I的水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下I个循环在98°C进行3分钟；30个循环，每个在98°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行I分30秒；1个循环在72°C进行15分钟；和4°C维持。将I. 5kb PCR片段通过使用TAE缓冲液的1°/。的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel ExtractionKit依照生产商的指示提取。将凝胶纯化的PCR片段用Taq DNA聚合酶处理以在反应中将3’ A-悬突添加至片段，反应物包含5 μ I的纯化PCR片段，I μ I的IOX Thermopol缓冲液，
O.5 μ I的IOmM dNTP, O. 5 μ I的Taq DNA聚合酶，和3 μ I的水。将反应物在72°C温育15分钟。将胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶片段的3’区在反应中克隆入pCR 2.1-TOPO 及应物包含3μ I的5’胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶区PCR片段，1μ I盐溶液，Iy I的水，和Iy I的pCR_ 2.1-TOPO 。所得质粒命名为 3’ Serine0将质粒5’ Serine用Asc I消化以供在反应中克隆入Asc I消化的质粒pJfyS1579-41-ll(实施例 9)，反应物包含 12.4yg 的 5’ Serine 质粒 DNA，5 μ I 的 Asc I,10μ I的IOX NEB BUFFER 4，和55 μ I的水。将限制性酶消化物在37°C温育2小时。将消化物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，其中将I. 5kb片段从凝胶切出并使用QIAQU丨CK Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。将Asc I消化的5’Serine片段在反应中连接至Asc I消化的pJfyS1579-49-ll，反应物包含233. 7ng的Asc I消化的5’ SP-TOPO, 160ng 的 Asc I 消化的 pJfyS1579-49-ll, 3 μ I 的 Quick Ligase, 25 μ I 的 2ΧQuick Ligase Buffer，和3μ I的水。将连接反应物在室温温育15分钟。所得质粒命名为5， Serine+pJfyS15790为了构建质粒 pAgJgll7,将质粒 3’Serine 和 5’Serine+pJfyS1579 用 Sbf I 消化。消化物包含 3. 96μ g 的 5’Serine+pJfyS1579 或 8. 85 μ g 的 3’Serine，4 μ I 的 SbfI, 10 μ I的IOX NEB BUFFER 4，和56 μ I的水。将两种消化反应物在37°C温育两小时。将一 μ I的小牛小肠碱性磷酸酶(CIP)添加至5’Serine+pJfyS 1579消化反应，并在37°C再温育一小时。将来自 5’Serine+pJfyS1579/SbfI 的 9. 5kb 片段和来自 3SP_T0P0/Sbf I 的 I. 5kb 片段通过使用TAE缓冲液的O. 8%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK GelExtraction Kit依照生产商的指示提取。将SbfI消化的3’ Serine片段在反应中连接至 SbfI 消化的 5’Serine+pJfyS1579 片段，反应物包含 486ng 的 SbfI 消化的 3’Serine，252ng的 SbfI 消化的 5’ Serine+pJfyS1579,1 μ I 的 Quick Ligase, 10 μ I 的 2Χ Quick LigaseBuffer,和I. 5 μ I的水。将连接反应物在室温温育20分钟。所得质粒命名为pAgJgll7 (图22)。实施例26 :双重蛋白酶基因缺失里氏木霉菌株AgJgl 17-3-10A的生成生成里氏木霉枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因缺失菌株SMai-TrSP-30-22原生质体并用Not I-直链化的PAgJgll7使用之前在实施例12中描述的方法转化，并铺板于PDA+1M蔗糖+10 μ g/ml的潮霉素。将六个转化体传代培养于PDA平板以生成孢子。在25kDa丝氨酸蛋白酶基因座含有pAgJgll7缺失载体，由此缺失丝氨酸蛋白酶的里氏木霉菌株SMai-TrSP-30-22的可能候选物，通过真菌孢子PCR使用Suzuki等，2006，见上文的经修饰的实验方案筛选。将来自各候选物的少量孢子悬于25μ I的TE缓冲液，并在微波炉中以高档位加热I分钟。将经微波处理的孢子悬液在PCR反应中用作模板以筛选丝氨酸蛋白酶缺失。反应物包含I μ I的孢子悬液，各I μ I的IOmM dNTP, 12. 5 μ I的2Χ ADVANTAGE GC-MeltLA 缓冲液，25pmol 的引物 068980，25pmol 的引物 067556，I. 25 单位的ADVANTAGE GC GENOME LA POLYMERASE Mix，和 9. 25 μ I 水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行10分钟；35个循环，每个在95°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行5分45秒；I个循环在72°C进行15分钟jP4°C维持。用于该筛选的引物起初用作测序引物；引物067556位于5’侧翼区的末端而引物068980位于在3’侧翼区的起始。若缺失载体插入丝氨酸蛋白酶基因座，则扩增的PCR片段应大于野生型片段，因为其包含用于缺失丝氨酸蛋白酶基因的hpt和tk盒。鉴定出了里氏木霉菌株AgJgll7-3,其中丝氨酸蛋白酶已缺失。引物067556(有义)5’ -CTTCTCTTTCTGGCATTGAC-3’ (SEQ ID NO:85)引物O6898O (反义)
5’-CTCGGAATCCTGCGGTTGCC-3’ (SEQ ID NO :86)缺失构建体PAgJgll7包含侧翼为直接重复的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因和大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因。插入直接重复以促进hpt和tk选择性标志物的切出和生成不含标志物的菌株，从而可将其用作宿主以缺失第三蛋白酶基因。将来自AgJgl 17-3的孢子以Ix IO5和Ix IO6的浓度铺板于含有I μ M5-氟_2’ -脱氧尿苷(FdU)的木霉属基本培养基平板，并在28°C温育。将十七个分离物传代培养于含有I μ M FdU的木霉属基本培养基平板，并在28°C温育。在十七个分离物中，仅七个形成了孢子；然后将这七个传代培养于PDA平板并在28°C温育。然后对七个分离物通过真菌孢子PCR以上述相同的方式筛选hpt和tk标志物的缺乏。进行了 Southern印迹分析以确证25kDa丝氨酸蛋白酶基因的缺失和hpt和tk标志物的缺乏。从缺失菌株和里氏木霉菌株SMai-TrSP-30-22如之前实施例10中所述提 取基因组DNA。将两μ g来自缺失菌株，里氏木霉菌株SMai-TrSP-30-22，和里氏木霉菌株981-0-8的基因组DNA分别用Hind III和Nco I消化。将里氏木霉菌株981-0-8和里氏木霉菌株SMai-TrSP-30-22包括在Southern印迹中作为对照。基因组DNA消化反应物包含2μ g 的基因组 DNA，I μ I 的 Nco I, I μ I 的 Hind 111,3. 5μ I 的 IOX NEB BUFFER 2，和水至35 μ I。将两种基因组DNA消化物在37°C温育大约3. 5小时。对消化物进行使用TAE缓冲液的O. 8%的琼脂糖凝胶电泳和遵循生产商的推荐使用TURBOBLOTTER 印迹于NYTRAN Supercharge印迹膜大约5小时。将膜与500bp异羟洋地黄毒苷配基标记的里氏木霉25kDa丝氨酸蛋白酶探针杂交，所述探针通过藉由如下所示的使用引物069279(有义)和069280(反义)的PCR并入异羟洋地黄毒苷配基-ΙΙ-dUTP来合成。引物069279(有义)5， -GGCGCCTCAATCCAGAAGGTCGCAC-3， (SEQ ID NO:87)引物O6928O (反义)5， -GTGTATGTAGTGAAACGAAGCATTCG-3’ (SEQ ID NO:88)扩增反应物包含5μ I 的 IOX ThermoPol Reaction 缓冲液，2. 5 μ I 的 PCRDIGLabeling Mix,Ing 的 pAgJgll7,50pmol 的引物 069279,50pmol 的引物 069280,各2. 5 μ I的IOmM dNTP, 5单位的Taq DNA聚合酶，和35. 5 μ I的水。将反应在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中温育，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行30秒，55 °C进行30秒，和72°C进行40秒；1个循环在72°C进行15分钟；和4°C维持。PCR反应产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QlAQLK Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。异羟洋地黄毒苷配基的并入通过分子量的增加指示。在DIG Easy Hyb缓冲液中在42°C进行杂交15_17小时。然后将膜在室温在高严格条件下在洗涤2X SSC加0. 1%SDS中5分钟，接着在65°C在0. 5X SSC加0. 1%SDS中洗漆两次各15分钟。探针-IE杂合物的检测是通过化学发光测定法(Roche MolecularBiochemicals, Indiana μ olis, IN, USA)遵循生产商的指示进行的。将含有25kDa丝氨酸蛋白酶缺失的菌株命名为里氏木霉AgJgl 17-3-10A。实施例27 :里氏木霉天冬氨酸蛋白酶基因缺失质粒PAgJgll8的构建
构建缺失载体pAgJgll8以缺失里氏木霉42kDa天冬氨酸蛋白酶基因。通过首先扩增5’和3’侧翼区并将其克隆入载体pCR 2.1-TOPO 来生成质粒PAgJgll8。5’侧翼区包含42kDa天冬氨酸蛋白酶编码区的上游I. 5kb区。使用如下所示的引物068620 (有义)和068621(反义)扩增5’侧翼区。引物068620工程改造为在引物5’端含有Asc I和Not I位点。引物068621工程改造为在引物5’端含有Asc I位点。引物068620(有义)5’ -AAAGGCGCGCCGCGGCCGCTCGCTGTAACGAACTTCTGTCCGCA-3’ (SEQ ID NO:89)引物068621(反义)5， -AAAGGCGCGCCCTTGAATATCGGAGAAGGTTGCTCACGG-3’ (SEQ ID NO:90)天冬氨酸蛋白酶基因的5’区通过PCR在反应中扩增，反应物包含175 μ g的里氏 木霉基因组 DNA，I μ I 的PLATINUM Pfx DNA 聚合酶，50pmol 的引物 068620，50pmol的引物 068621，I. 5μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 IOX PfxAmplification 缓冲液，并 33. 5 μ I的水。将反应物在EPPENDORF MASTE.RCYCLER 中温育，程序如下1个循环在98°C进行3分钟；30个循环，每个在98°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行I分30秒；1个循环在72°C进行15分钟；和4°C维持。I. 5kb PCR片段通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用Q1AQUICK GelExtraction Kit依照生产商的指示提取。凝胶纯化的PCR片段用Taq DNA聚合酶处理以在反应中将3’A-悬突添加至片段，反应物包含5 μ I的纯化PCR片段，I μ I的IOX Thermopol缓冲液，O. 5 μ I的IOmM(1ΝΤΡ，1μ1的Taq DNA聚合酶，和3 μ I的水。将反应物在72°C温育15分钟。将天冬氨酸蛋白酶片段的5’区在反应中克隆入pCR_ 2.1-TOPO ，反应物包含3μ I的5’天冬氨酸蛋白酶区PCR片段，I μ I的盐溶液，I μ I的水，和I μ I的pCR 2.1-TOPO 。所得质粒命名为 5’ Aspartic。使用如下所示的引物068622(有义)和068623(反义)将天冬氨酸蛋白酶片段的3’区克隆入pCR_ 2.1-TOPO 。引物068622工程改造为在引物5’端含有SbfI位点。弓I物068623工程改造为在引物5’端含有SbfI和Not I位点。引物068622(有义)AAACCTGCAGGGCGGCGATGGTGGACTTGTTTATGA-3’ (SEQ ID NO:91)引物068623(反义)AAACCTGCAGGCGGCCGCAGCAAGTGAGTATCGAGTTTGTAGG-3’ (SEQ ID NO:92)天冬氨酸蛋白酶基因的3’区通过PCR在反应中扩增，反应物包含175 μ g的里氏木霉基因组 DNA，I μ I 的PLATINUMS Pfx DNA 聚合酶，50pmol 的引物 068622，50pmol 的引物 068623，I. 5 μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 IOX PfxAmplification 缓冲液，和 33. 5 μ I的水。将反应物在:EPPENDORF MASTERCYCLER. 中温育，程序如下1个循环在98°C进行3分钟；30个循环，每个在98°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行I分30秒；1个循环在72°C进行15分钟；和4°C维持。I. 5kb PCR片段通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。凝胶纯化的PCR片段用Taq DNA聚合酶处理以在反应中将3’A-悬突添加至片段，反应物包含5 μ I的纯化PCR片段，I μ I的IOXThermopol缓冲液，O. 5 μ I的IOmM(1ΝΤΡ，1μ1的Taq DNA聚合酶，和3 μ I的水。将反应物在72°C温育15分钟。将天冬氨酸蛋白酶片段的3’区在反应中克隆入pCR 2.1-TOPO ，反应物包含3μ I的3’天冬氨酸蛋白酶区PCR片段，I μ I的盐溶液，I μ I的水,和I μ I的pCR 2.1-TOPO 。所得质粒命名为 3’ Aspartic。用Asc I消化质粒5’ Aspartic以在反应中克隆入Asc I消化的质粒pJfyS1579-41-ll(实施例 9)，反应物包含 6. 45 μ g 的 5，Aspartic 质粒 DNA，5y I 的 AscI，10 μ I的IOX NEB BUFFER 4，和61 μ I的水。限制性酶消化物在37°C温育4小时。消化物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，其中将I. 5kb片段从凝胶切出并使用QIAQUIC K 1 Ge I Extraction Kit依照生产商的指不提取。将Asc I消化的5’Aspartic片段在反应中连接至Asc I消化的pJfyS1579-49-ll，反应物包含307. 2ng的Asc I消化的 5，Aspartic, 160ng 的 Asc I 消化的 pJfyS1579-49_ll, 3 μ I 的 Quick Ligase, 25 μ I 的2Χ Quick Ligase Buffer，和3 μ I的水。连接反应物在室温温育15分钟。所得质粒命名为 5， Aspartic+pJfyS15790为了构建质粒pAgJgll8,将质粒 3’ Aspartic 和 5’ Aspartic+pJfyS1579 用 SbfI 消化。消化物包含 3· 5μ g 的 5’ Aspart ic+pJfyS1579 或 5· 3μ g 的 3’ Aspartic, 4 μ I 的 SbfI, 10μ I的IOX NEB BUFFER 4，和56 μ I的水。将两种消化反应物在37°C温育I. 5小时。将一 μ I的小牛小肠碱性磷酸酶(CIP)添加至5’Aspartic+pJfyS1579消化反应物并在37°C再温育一小时。来自 5’Aspartic+pJfyS1579/SbfI 的 9. 5kb 片段和来自 3’Aspartic/SbfI的I. 5kb片段通过使用TAE缓冲液的O. 8%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。将SbfI消化的3’Aspartic片段在反应中连接至SbfI消化的5’ Aspartic+pJfyS1579片段，反应物包含349. 5ng的SbfI 消化的 3，Aspartic, 122. 35ng 的 SbfI 消化的 5，Aspartic+pJfyS1579, 2 μ I 的 QuickLigase, 20 μ I的2Χ Quick Ligase Buffer，和3μ I的水。连接反应物在室温温育20分钟并将3μ I的连接反应物依照生产商的指示转化入SOLOPACK Gold Ultra感受态大肠杆菌细胞。转化体在补充100 μ g每ml的氨苄青霉素的2X YT琼脂平板上选择并在37°C温育16小时。所得质粒命名为pAgJgll8(图23)。实施例28 :三重蛋白酶基因缺失里氏木霉菌株AgJgl 18-02-2E的生成用Not I-直链化的PAgJgll8使用之前在实施例12中描述的方法转化里氏木霉双重蛋白酶缺失菌株AgJgll7-3-10A原生质体，并铺板于含10μ g每ml的潮霉素的PDA平板加IM蔗糖。将六个转化体传代培养入PDA平板以生成孢子。在42kDa天冬氨酸蛋白酶基因座含有pAgJgll8缺失载体，由此缺失天冬氨酸蛋白酶的里氏木霉菌株AgJgll7-3-10A的可能候选物,通过真菌孢子PCR使用Suzuki等,2006,见上文的经修饰的实验方案筛选。将来自各候选物的少量孢子悬于25μ I的TE缓冲液，并在微波炉中以高档位加热I分钟。将经微波处理的孢子悬液在PCR反应中用作模板以筛选丝氨酸蛋白酶缺失。反应物包含I μ I的孢子悬液，各I μ I的IOmM dNTP, 12. 5 μ I的2Χ ADVANTAGE GC-Melt LA 缓冲液，25pmol 的引物 069858，25pmol 的引物 069859，
I.25 单位的ADVANTAGE Ge GENOME LA POLYMERASEMix，和 9· 25 μ I 水。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行10分钟；35个循环，每个在95°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行5分30秒；I个循环在72°C进行15分钟；和4°C维持。引物069858位于5’侧翼区的末端而引物069859位于3’侧翼区的起始。若缺失载体插入天冬氨酸蛋白酶基因座，则扩增的PCR片段应大于野生型片段，因其包含用于缺失丝氨酸蛋白酶基因的hpt和tk盒。鉴定出了里氏木霉AgJgll8-02，其中天冬氨酸蛋白酶已缺失。引物069858(有义)5， -TCGGGGAGGATGGCGCAAACCGACCTTCCTAAA-3’ (SEQ ID NO:93)引物069859(反义)5， -GCACCTTACCCCTACGGACCACGAT-3， (SEQ ID NO:94)
缺失构建体PAgJgll8包含侧翼为直接重复的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因和大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因。插入直接重复以促进切出hpt和tk选择性标志物和生成42kDa天冬氨酸蛋白酶的完整(clean)缺失。将来自里氏木霉AgJgl 18-02的孢子以Ix IO5和Ix IO6的浓度铺板于含有I μ M5-氟_2’ -脱氧尿苷(FdU)的木霉属基本培养基平板，并在28°C温育。将十个分离物传代培养入PDA平板并在28°C温育。然后对十个分离物通过真菌孢子PCR以上述相同的方式筛选hpt和tk标志物的缺乏。进行了 Southern印迹分析以确证42kDa天冬氨酸蛋白酶基因的缺失和hpt和tk标志物的缺乏。从缺失菌株和里氏木霉菌株981-0-8如之前在实施例10中所述提取基因组DNA。将两μ g的来自缺失菌株和里氏木霉菌株981-0-8的基因组DNA用Nco I消化。将里氏木霉菌株981-0-8包括在Southern印迹中作为对照。基因组DNA消化反应物包含2yg的基因组DNA，ly I的Nco Ι，5μ1的IOX NEB BUFFER 3，和水至50 μ I。将两种基因组DNA消化物在37°C温育大约14-16小时。对消化物进行使用TAE缓冲液的O. 8%的琼脂糖凝胶电泳和遵循生产商的推荐使用TURBOBLOTTER 印迹于NYTRAN Supercharge印迹膜大约12-16小时。将膜与500bp异羟洋地黄毒苷配基标记的里氏木霉42kDa天冬氨酸蛋白酶探针杂交，所述探针通过藉由使用如下所示的引物069860(有义)和069861(反义)的PCR并入异羟洋地黄毒苷配基-ΙΙ-dUTP来合成。引物069860(有义)5’-CTTCTATCTTGGGATGCTTCACGATACGTGA-3’ (SEQ ID NO:95)引物069861(反义)5， -CGCGCCCTTGAATATCGGAGAAGGT-3， (SEQ ID NO:96)扩增反应物包含5 μ I 的 IOX Taq 缓冲液，2. 5 μ I 的 PCR DIG Labeling Mix, 5ngWpAgJgl 18, IOpmol 的引物 069860，IOpmol 的引物 069861，各 2. 5 μ I 的 IOmM dNTP，5 单位的 Taq DNA 聚合酶，和 36. 5μ I 的水。将反应在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中温育，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行30秒，56 V进行30秒，和72 °C进行40秒；I个循环在72 °C进行15分钟；和4°C维持。将PCR反应产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQU1CK Gel Extraction Kit依照生产商的指示提取。异羟洋地黄毒苷配基的并入通过分子量的增加指示。在DIG Easy Hyb缓冲液中在42°C进行杂交15_17小时。然后将膜在室温在高严格条件下在洗涤2X SSC加0. 1%SDS中5分钟，接着在65 °C在0. 5XSSC加0. 1%SDS中洗漆两次各15分钟。探针-IE杂合物的检测是通过化学发光测定法(Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN,USA)遵循生产商的指示进行的。含有天冬氨酸蛋白酶缺失的菌株命名为里氏木霉AgJgl 18-02-2E。实施例29 :里氏木霉AgJgl 17-3-10A和里氏木霉AgJgl 18-02-2E的发酵将来自PDA平板的里氏木霉AgJgl 17-3-10A和里氏木霉AgJgl 18-02-2E的孢子接种入含有IOOml的摇瓶培养基的500ml摇瓶。在相同条件下运行里氏木霉菌株981-0-8作为对照。将烧瓶置入定轨振荡器在28°C进行大约48小时，此时将50ml的培养物添加至包含1.8升的发酵分批培养基的八[*^3^{<0凡 三升玻璃夹套发酵器(three liter glassjacketed fermentor) (Applikon Biotechnology, Inc.，Foster City CA USA)。发酵补料培养基以O至4g/l/小时的速率添加185小时的时间。将发酵容器维持在28°C的温度，并使用 APPL丨KX)N_ 1030 控制系统(Applikon Biotechnology, Inc. ,Foster City CAUSA)将pH控制在4. 5+/-0. I的设定点。将空气以Ivvm的速率添加至容器，并通过以1100至1300rpm旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。在发酵结束时，将全培养液从容器收获，并在3000x g离心以去除生物质。将上清过滤灭菌，并储藏在5至10°C。实施例30 :棘孢曲霉菌株CBS 186. 67GH3 β -木糖苷酶的制备依照以下步骤重组制备棘孢曲霉菌株CBS 186. 67GH3 β -木糖苷酶。为了生成用于PCR扩增的基因组DNA，将棘孢曲霉CBS 186. 67通过在26°C生长 7日在PDA琼脂平板上繁殖。将从PDA平板收获的孢子接种入带挡板的摇瓶中的25ml的YP+2%葡萄糖培养基，并在26°C在200rpm振荡温育48小时。基因组DNA分离依照修饰的FastDNA SPIN实验方案(Qbiogene，Inc.，Carlsbad, CA, USA)进行。简言之，将FastDNA SPIN Kit for Soil (Qbiogene, Inc.,Carlsbad, CA, USA)用于 JFastPrep 24Homogenization System (MPBiosciences, SantaAna,CA,USA)中。两ml的真菌材料通过在14，OOOx g离心2分钟来收获。去除上清并将沉淀重悬于500 μ I的去离子水。将悬液转移至Lysing Matrix E FastPl’epC!<」管(Qbiogene,Inc.，Carlsbad, CA，USA)并将 790 μ I 的磷酸钠缓冲液和 100 μ I 的来自FastDNA SPINKit的MT缓冲液添加至管。然后将样品放置在FastPrep' Instrument (Qbiogene, Inc.,Carlsbad, CA, USA)中，并在5. 5m/秒的速度处理60秒。然后将样品在14，OOOx g离心2分钟，并将上清转移至干净的EPPENDORF 管。添加来自FastDNA SPIN Kit的250 μ I体积的PPS试剂，然后将样品通过倒置轻柔地混合。然后将样品再次在14，OOOxg离心5分钟。将上清转移至15ml管，接着加入Iml的来自FastDNA SPIN Kit的Binding Matrix悬液，然后通过倒置混合两分钟。将样品放置在固定的管架中，并允许二氧化硅基质沉降3分钟。移除并弃去500 μ I体积的上清，然后将剩余样品重悬于基质。然后将样品转移至来自FastDNA SPIN Kit的SPIN过滤管，并在14，OOOx g离心I分钟。清空接收管(catchtube)，并将剩余的基质悬液添加至SPIN过滤管。再次离心样品(14，000xg，l*#)。将来自FastDNA SPIN Kit的500 μ I体积的SEWS-M溶液添加至SPIN过滤管，并将样品在相同速度离心I分钟。清空接收管，并将SPIN过滤器重新置于(replace)接收管中。将该单元在14000xg离心2分钟以“干燥”残余SEWS-M洗涤溶液的基质。将SPIN过滤器置于新鲜的接收管，并允许在室温风干5分钟。用移液尖将基质轻柔地重悬于100μ I的DES(不含DNase/致热原的水)中。将该单元离心(14，OOOx g，I分钟)以洗脱基因组DNA，接着通过在14000xg重新离心I分钟用100 μ I的IOmM Tris, O. ImM EDTA，pH 8. O洗脱，并合并洗脱物。从接收管收获的DNA的浓度通过UV分光光度计在260nm测量。棘孢曲霉木糖苷酶基因通过PCR使用如下所示的两个克隆引物GH3_101f和GH3-101r分离，所述引物基于公众可获得的棘孢曲霉xyl2全长序列(GenBankAB462375. I)设计以供使用IN-FUSI0N 策略进行直接克隆。引物GH3-101f:5，-acacaactggggatccaccatggctgtggcggctcttgctctgctgg-3，(SEQ ID NO :97)引物GH3_101r:5，-agatctcgagaagcttaCTCATCCCCCGCCACCCCCTGCACCTCC-3，(SEQ ID NO :98)
用从棘孢曲霉CBS 186.67制备的基因组DNA进行PCR反应以扩增全长基因。PCR反应物包含1μ I的基因组DNA，0. 75 μ I的引物GH3-101· lf(10yM),0. 75 μ I的引物 GH3-101. Ir (10 μ Μ)，3 μ I 的 5Χ HF 缓冲液(Finnzymes 0y, Finland)，O. 25 μ I 的 50mMMgCl2,0. 3 μ I 的 IOmM dNTP, O. 15 μ I 的PHUS丨ON DNA 聚合酶(New England Biolabs,Ipswich, MA, USA)，和 PCR-级水加至 15 μ I。PCR 反应使用 DYAD PCR 仪(Bio-RadLaboratories, Inc. , Hercules, CA, USA)进行,程序如下在98°C进行2分钟,接着是在98°C进行15秒，700C (-I0C /循环)进行30秒，和72°C进行2分30秒的10个降落循环；和25个循环，每个在98°C进行15秒，60°C进行30秒，72°C进行2分30秒，和在72°C进行5分钟。反应产物通过使用TAE缓冲液的I. 0%琼脂糖凝胶电泳分离，其中将大约2. 4kbPCR产物条带从凝胶切出并使用GFX PCR DNA和Gel Band Purification Kit (GEHealthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)依照生产商的指不纯化。将对应于棘孢曲霉β -木糖苷酶基因的DNA使用IN-FUSION Dry-Down PCRCloning Kit (BDBiosciences,Palo Alto,CA,USA)依照生产商的指示克隆入用Bam HI和Hind III直链化的表达载体 pDAul09 (W0 2005042735)。将2. 5 μ I体积的稀释的连接混合物用于转化ONE SHOT 化学感受态T0P10细胞。在含有100 μ g每ml的氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择三个菌落，并在补充100 μ g每ml的氨节青霉素的3ml的LB培养基中培养过夜。使用E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit (OmegaBio-Tek, Inc. , Norcross, GA, USA)依照生产商的指示纯化质粒DNA。在异源表达之前,通过Sanger测序验证棘孢曲霉β -木糖苷酶基因序列。编码序列为2454bp，包含终止密码子。基因不含内含子。编码的预期蛋白为817个氨基酸。使用 SignalP program (Nielsen 等，1997, Protein EngineeringlO 1-6)预测出17个残基的信号肽。预期的成熟蛋白包含800个氨基酸。米曲霉MT3568的原生质体如WO 95/02043中所述制备。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355(W0 2002/40694)的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物，其中pyrG营养缺陷型通过用PyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因而得到恢复。将一百微升的原生质体悬液与2. 5-15 μ g的曲霉属表达载体混合，并添加250 μ I的60%PEG 4000, IOmM CaCl2,和IOmM Tris-HCl pH 7. 5并轻柔地混合。将混合物在37°C温育30分钟，并将原生质体铺于补充 IOmM 乙酰胺和 15mM CsCl 的 COVE 蔗糖(IM)平板(Cove, 1996,Biochim0 Biophys0Acta 133 :51-56)上以供转化体选择。在37°C温育4_7日之后，将几个转化体的孢子接种于YP-2%麦芽糊精培养基上。在30°C培养4日之后，分析培养液以基于其产生大量活性棘孢曲霉β -木糖苷酶的能力鉴定最佳转化体。筛选是基于通过SDS-PAGE确定的对应于异源表达蛋白的条带强度，和如下所示的酶对4-硝基苯基-β -D-木糖批喃糖苷(4-nitrophenyl-beta-D-xylopyranoside,pNPX)的活性。将十 μ I 的培养液与含有 10 μ I 的 O. 1%TWEEN 20，10 μ I 的 IM 柠檬酸钠 pH 5，4 μ I 的溶解于 DMSO 的 IOOmM 的 ρΝΡΧ 底物(Sigma Aldich,St. Louis,MO, USA)(储液中0. 4%的最终体积)和过滤水的90 μ I的测定试剂混合。测定在37°C进行30分钟，并在添加100 μ I的IM碳酸钠pH 10之前和之后在405nm确定吸光度。将在405nm最高的吸光度值关联于SDS-PAGE数据以供选择最佳转化体。将命名为米曲霉EXP3611的最佳转化体的孢子铺于含有O. 01%TRr[ON X-100的COVE平板上以供分离单菌落。铺板在补充IOmM乙酰胺和15mM CsCl的含有IM蔗糖和IOmM硝酸钠的COVE蔗糖培养基(Cove, 1996,Biochim0 Biophys0 Acta 133 :51-56)上总共重复两次。然后在 30°C在250ml烧瓶中使用DAP-4C-1培养基在IOOrpm振荡进行发酵4日。发酵液使用标准方法过滤。蛋白浓度使用 Microplate BCA Protein Assay Kit (Thermo Fischer Scientific,Waltham, MA, USA)确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
实施例31 :来自里氏木霉AgJgl 17-3-10A和里氏木霉AgJgl 18-02-2E的培养液在高温的储藏稳定性对里氏木霉AgJgl 17-3-10A、里氏木霉AgJgl 18-02-2E和里氏木霉菌株981-0-8(对照)的培养液衡量在升高温度的储藏稳定性，并将其与亲本株的稳定性相比较。将从实施例29获得的发酵液过滤灭菌(O. 2μ M注射器式滤器，聚醚砜膜，GEHealthcare, Piscataway, NJ, USA),等分入 I. 8mL Nunc CRY0TUBE 小瓶(Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA)并在液氮中骤冻(flash freeze)。然后将小瓶储藏在40°C或-80°C (作为对照)两周。在温育之后，对样品测定PCS水解活性。PCS 的水解使用 2. 2ml 深孔板(Axygen, Union City, CA, USA)以 I. 0ml 的总反应体积进行。水解用50mg的PCS每ml的含有ImM硫酸镁的50mM乙酸钠pH 5. O缓冲液进行，并获得蛋白酶缺失菌株和亲本株(2，4，8和12mg每克纤维素)的剂量应答。每个反应以5%添加补充棘孢曲霉葡糖苷酶的蛋白(实施例30)。水解测定在50°C以三次重复进行72小时。在水解之后，将样品用0. 45 μ m Multiscreen 96孔过滤板(MiIlipore, Bedford,MA,USA)过滤，并如下所示就糖含量分析滤过物。在通过含0. 05%w/w苯甲酸的0. 005M H2SO4以0. 6mL/分钟的流速从4. 6x250mm AMINEX HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories, Inc. , Hercules, CA, USA)洗脱之后，稀释于0.005M H2SO4的样品的糖浓度以通过由通过纯糖样品校正的折光率检测器(C'HEMSTATION ，AGILENT⑧ 1100HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara,CA,USA)的葡萄糖和纤维二糖信号的积分的定量来测量。将所得的当量用于计算各反应的纤维素转化百分率。纤维素转化程度使用以下方程计算%转化=[葡萄糖浓度+1. 053x(纤维二糖浓度)]/[(葡萄糖浓度+1. 053x限制消化中的(纤维二糖浓度)]。对于纤维二糖的I. 053因子考虑了当纤维二糖转化为葡萄糖时质量的增加。使用六十mg的里氏木霉纤维素分解蛋白制备物每g纤维素以供限制消化。显示于图24的结果说明来自里氏木霉AgJgl 17-3-10A和里氏木霉AgJgl 18-02-2E的培养液在40°C两周之后残余纤维素酶活性相对于在相同条件下的里氏木霉菌株981-0-8的培养液较优。为了达到80%的底物转化，对于亲本株，在40°C温育的样品相对于在_80°C温育的对照样品需要蛋白加载量增加至I. 76倍。在相同条件下，对于三重和双重蛋白酶缺失的菌株培养液，蛋白加载量分别增加至I. 43和I. 61倍。因此，三重蛋白酶缺失菌株培养液在40°C两周的储藏稳定性方面显示19%的改善。双重蛋白酶缺失培养液当在40°C储藏两周时显示8. 5%的改善。实施例32 :枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶缺失载体pJfyS152的生成将里氏木霉981-0-8枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(p印C)基因(SEQ ID NO:99为DNA序列，而SEQ ID NO: 100为推导的氨基酸序列)5’侧翼序列使用PHUSION HotStat High-Fidelity DNA 聚合酶(New England Biolabs, Ipswich,MA,USA)和如下所不的基因-特异性正向和反向引物扩增。下划线部分为导入供克隆的Asc I位点，而斜体区代表对应于IN-FUSION_ Cloning (Clontech，Palo Alto, CA，USA)所需的载体插入的位点的同源区的导入的延伸。
正向引物5’ - icacai^iitaaac ggcgcgccGGTACTATATTAGAAAGGGGTTCC-3 (SEQ ID NO: 101)反向引物5’ - cmccll0/!l0cz ggcgcgccGAAGAAGAGAAGAGGAGGAGGATG-3’ (SEQ ID NO: 102)扩增反应物含有150ng的里氏木霉981_0_8基因组DNA，各200 μ m的dNTP,0. 4μΜ 引物，I X PHUS 丨 ON (;C 缓冲液(New England Biolabs, Ipswich,MA, USA)，和2单位的PHUSION DNA聚合酶，最终体积为50μ I。将扩增反应在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在98°C进行2分钟；30个循环，每个在98°C进行30秒，57°C进行30秒，和72°C进行I分30秒；和一个循环在72°C进行7分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离，并将2. 2kb片段切出，使用NUCLEOSPIN ExtractII Kit (Machery-Nagel, Dueren, Germany)依照生产商的实验方案提取琼脂糖。将2. 2kb PCR产物使用IN-FUSION ADVANTAGE PCR Cloning Kit (Clontech, Palo Alto, CA, USA)依照生产商的实验方案插入 Asc I-消化的pJfyS1579-41-ll(实施例9)。IN-FUSION 反应物在10 μ I反应体积中含有1XIN-FUSION 反应缓冲液(Clontech，Palo Alto, CA, USA)，150ng 的 pJfyS1579-41_ll，IOOng 的 PCR 产物，和 I μ I 的IN-FUS丨ON Enzyme (Clontech，Palo Alto, CA, USA)。将反应物在37°C温育15分钟和并在50°C温育15分钟。向反应物添加40 μ I的TE。将两个2 μ I用于依照生产商的实验方案转化ONE SHOT T0P10感受态细胞。转化体通过测序筛选，并鉴定出一个含有不具PCR错误的插入物的克隆，并命名为pJfyS152A，将质粒pJfyS152A用于插入PepC基因的3’侧翼。将3’ P印C侧翼序列从里氏木霉981-0-8基因组DNA(实施例13)使用PHUS丨ON Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶和如下所示的基因-特异性正向和反向引物扩增。下划线部分为导入供克隆的SbfI位点，而斜体区代表对应于IN-FUSION Cloning所需的载体插入的位点的同源区的导入的延伸，且粗体部分为导入供之后去除质粒的细菌繁殖部分的Pme I位点。正向引物
5’ - Cd收"奴收KUt cctgcaggTCTATCTCTTTTGAGTAGTCCCCA-3’ (SEQ ID NO: 103)反向引物5’ - (ggccaiaiuaaat cctgcagg gttoaac AGCTAGTGACTCGCGATTTATCGT-3’ (SEQ IDNO:104)扩增反应物含有150ng的里氏木霉981_0_8基因组DNA，各200 μ m的dNTP，0.4“] 引物，含51111 MgCl2 的 lXPHUSION HF 缓冲液(New England Biolabs, Ipswich,MA，USA)，和2单位的PHUSION DNA聚合酶，最终体积为50 μ I。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 111温育，程序如下1个循环在98°C进行2分钟；30个循环，每个在98°C进行30秒，56°C进行30秒，和72°C进行I分30秒；和一个循环在72°C进行7分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离，其中将2. 2kb片段切出，并使用NUCLEOSPIN Extract II Kit依照生产商的实验方案提取琼脂糖。 的实验方案插入Sbf I-消化的pJfyS152A。IN-FUSION 反应物在10 μ I反应体积中含有 IX IN-FUSION Reaction 缓冲液，150ng 的 pJfyS1579-41_ll，IOOng 的 PCR 产物，和I μ I的IN-FUSION Enzyme。将反应物在37°C温育15分钟和在50°C温育15分钟。向反应物添加40 μ I的TE，并将2μ I用于依照生产商的实验方案转化ONE SHOT Τ0Ρ10感受态细胞。转化体通过测序筛选，并鉴定出一个含有不具PCR错误的插入物的克隆，并命名为pJfyS152(图25)。将质粒pJfyS152用于缺失p印C基因。实施例33 :枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶缺失的里氏木霉菌株JfyS152_l的生成将用Pme I-消化的并凝胶纯化的pJfyS152依照实施例12中描述的步骤转化的里氏木霉AgJgl 15-104-7B1 (实施例23)的六个转化体，从转化平板用灭菌接种环转移至新的含有PDA培养基的平板，并在28°C生长7日。然后所有6个转化体通过Southern分析进行分析。将来自6个转化体的每一个的基因组DNA如实施例21中所述提取，并将各2. 5 μ g用20单位的Nsi II和20单位的BglII消化16小时。对消化物进行0. 9%的琼脂糖凝胶电泳并遵循生产商的推荐使用TURBOBLOTTER 印迹于NYTRAN Supercharge印迹膜大约12-16小时。杂交于P印C基因的3’侧翼序列的PCR探针，使用PCR DIG ProbeSynthesis Kit依照生产商的实验方案用以下正向和反向引物生成正向引物5， -TGATTTCGTGGACAGCGTTTCTCGC-3， (SEQ ID NO:105)反向引物5’-TTGCCTTACAGCTGGCAACAATGGCGTC-3’ (SEQ ID NO:106)将扩增反应物EPPENDORF MASTERCYCLER 在中温育，程序如下1
个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在94°C进行30秒，59°C进行30秒，和72°C进行40秒，和一个循环在72°C进行7分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离，并将0. 3kb片段切出，并使用NUCLEOSPIN Extract II Kit依照生产商的实验方案提取琼脂糖。异羟基洋地黄毒苷元的并入通过在大约0. 5kb运行的标记探针的分子量变动来确证。在DIG Easy Hyb缓冲液中在42°C进行杂交15_17小时。然后将膜在室温在高严格条件下在2X SSC加O. 1%SDS中洗涤5分钟，接着在65°C在O. 5X SSC加O. 1%SDS中洗涤两次各15分钟。探针-祀杂合物的检测是通过化学发光测定(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis, IN, USA)遵循生产商的指示进行的。Southern分析表明6个转化体中的3个以单拷贝携带缺失盒。含有pepC缺失的菌株命名为里氏木霉JfyS152-l。实施例34 :胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶缺失载体pJfyS153的生成将里氏木霉981-0-8胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶基因(SEQ ID N0:107为DNA序列，而SEQ ID NO: 108为推导的氨基酸序列)的5’侧翼序列使用PHUSION Hot StartHigh-Fidelity DNA 聚合酶 New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)和如下所不的基因-特异性正向和反向引物扩增。下划线部分为导入供克隆的Asc I位点，而斜体区代表同源于丨N-FUSION 的插入位点的载体。正向引物 5 - tcacaimdaaac ggcgcgccTTCCGGCTTCTTTTTATGTATACCT-3 (SEQ ID NO: 109)反向引物5’ - Cl^Cdt tnmcz ggcgcgccAAGCTAGGAACCAGCCTCTTTGTA-3，(SEQ ID NO: 110)扩增反应物含有150ng的里氏木霉981-0-8基因组DNA，各200 μ m的dNTP，0. 4 μ M引物，IX PHUSION Ge 缓冲液(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)和 2 单位的PHUSION 丨)NA 聚合酶(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)，最终体积为 50 μ L·将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行30秒，57°C进行30秒，和72°C进行I分30秒；和一个循环在72°C进行7分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离，并将2. 2kb片段切出，并使用NUCLEOSPIN Extract II Kit依照生产商的实验方案提取琼脂糖。将2. 2kb PCR 产物使用IN-FUSION ADVANTAGE l)CR Cloning Kit 依照生产商的实验方案插入Asc I-消化的pJfyS1579-41-ll。IN-FUSION .反应物在10 μ I反应体积中含有 1XIN-FUSION Reaction缓冲液，150ngpJfyS1579-41_ll，IOOng PCR产物和I μ I IN-FUSION Enzyme0将反应物在37°C温育15分钟和在50°C温育15分钟。向反应物添加40 μ I的TE，并将2 μ I用于依照生产商的实验方案转化ONE SHOT TOP 10感受态细胞。转化体通过测序筛选，鉴定出一个含有不具PCR错误的插入物的克隆并命名为pJfyS153A，并将其用作质粒以插入胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶基因的3’侧翼。将胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶基因的3’侧翼序列从里氏木霉981-0-8基因组DNA(实施例 13)使用PHUSION Hot Start High-Fidelity DNA 聚合酶(New EnglandBiolabs, Ipswich,MA,USA)和如下所示的基因-特异性正向和反向引物扩增。下划线部分为导入供克隆的SbfI位点，而斜体区代表同源于丨N-FUSION 的插入位点的载体，且粗体部分为导入以供之后去除质粒的细菌繁殖部分的Pme I位点。5，- ctagttggagtatt cctRcaRga GCCGAGCTCCTGMCGCTGAGATT- 3，(SEQ IDNO :111)反向引物5，- tggccatatttaaati c c t g c a g QTTTAMCGAGGGMMGGGCCGCTGCACGAT-3’ (SEQIDN0:112)
扩增反应物含有150ng的里氏木霉981-0-8基因组DNA，各200 μ m的dNTP，O. 4 μ M引物，含5mM MgCl2的IXPHUSION HF缓冲液，和2单位的PHUSION DNA聚合酶，最终体积为50 μ I0将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1
个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行30秒，59°C进行30秒，和72°C进行I分30秒；和一个循环在72°C进行7分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1%的琼脂糖凝胶电泳分离，将I. 5kb片段切出，并使用NUCLEOSPIN Extract II Kit依照生产商的实验方案提取琼脂糖。将1.5kb PCR产物使用iN-FUSiON ADVANTAGE PCR Cloning Kit 依照生产商的实验方案插入Sbf I-消化的pJfyS153A。IN-FUSION 反应物在10 μ I反应体积中含有 IX IN-FUS丨ON Reaction 缓冲液，150ng 的 pJfyS1579-41_ll，IOOng 的 PCR 产物，和I μ I的IN-FUSION Enzyme。将反应物在37°C温育15分钟和在50°C温育15分钟。 向反应物添加40 μ I的TE,并将2 μ I用于依照生产商的实验方案(Invitrogen, Carlsbad,CA，USA)转化ONE SHOT TOP 10感受态细胞。转化体通过测序筛选，并鉴定出一个含有不具PCR错误的插入物的克隆，并命名为PJfyS153 (图26)，并将其用于缺失胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶基因。实施例35 :胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶缺失里氏木霉菌株JfyS153_6的生成当用Pme I-消化的并凝胶纯化的pJfyS152依照实施例12中描述的步骤转化原生质体时，获得了里氏木霉Agjgll5-104-7B1(描述于实施例23)的十六个转化体。将所有16个用灭菌接种环从转化平板转移至含有PDA培养基的新平板，并在28°C生长4日。将16转化体通过真菌孢子PCR依照实施例23中所述的方法用下述引物进行分析正向引物5’-CGCGGAGGTGAGGTGTTGATGATG-3’ (SEQ ID NO:113)反向引物1(野生型)5’-CGGCGGTCTTTAAGGTGATGTCGC-3’ (SEQ ID NO:114)反向引物2(缺失的)5’-GTTTCAGGCAGGTCTTGCAACG-3’ (SEQ ID NO:115)将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1个循
环在98°C进行5分钟；35个循环，每个在98°C进行20秒，53°C进行30秒，和72°C进行3分30秒；1个循环在72°C进行7分钟；和4°C维持。对PCR反应物进行TAE缓冲液中的1%的琼脂糖凝胶电泳。设计PCR引物使得若野生型基因是完整的，则正向和反向引物I会退火，得到
2.5kb片段，而若基因缺失，则正向和反向引物2会退火，得到3. 5kb片段。真菌孢子PCR表明16个转化体中仅一个含有仅显示3. 5kb片段的缺失。接着通过Southern分析来分析该菌株。如实施例21中所述提取基因组DNA，并将2 μ g用21. 4单位的Nco I和21. 4单位的BII消化16小时。对消化物进行TAE缓冲液中的0. 9%的琼脂糖凝胶电泳并遵循生产商的推荐印迹于NYTRAN Supercharge印迹膜使用TURBOBLOTTER 大约12-16小时。杂交于胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶基因的3’侧翼序列的PCR探针使用PCR DIG ProbeSynthesis Kit 依照生产商的实验方案(Roche Diagnostics, Indianapolis, ID)用以下正向和反向引物生成正向引物5’-GAAGACAGTCCTACTGCTGCGGAG-3’ (SEQ ID NO:116)反向引物5’-GTAGCTCTCCCCGTATAATGCAGG-3’ (SEQ ID NO:117)将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序如下1
个循环在95°C进行2分钟；30个循环，每个在95°C进行20秒，57°C进行30秒，和72°C进行40秒；和一个循环在72°C进行7分钟。 PCR产物通过使用TAE缓冲液的I. 2%的琼脂糖凝胶电泳分离，并将O. 6kb片段切出，并使用Nucleospin Extract II(R)Kit依照生产商的实验方案提取琼脂糖。异羟基洋地黄毒苷元的并入通过在大约0. 6kb运行的标记探针的分子量变动来确证。在DIG Easy Hyb缓冲液中在42°C进行杂交15-17小时。然后将膜在室温在高严格条件下在2X SSC加0. 1%SDS中洗涤5分钟，接着在65 °C在0. 5XSSC加0. 1%SDS中洗漆两次各15分钟。探针-IE杂合物的检测是通过化学发光测定法(Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN, USA)遵循生产商的指不进行的。Southern分析表明菌株以单拷贝在意图的基因座携带缺失盒。将含有胃蛋白酶样蛋白酶缺失的菌株命名为里氏木霉JfyS153-6。通过以下编号的段落进一步描述本发明[I] 一种亲本木霉属菌株的突变体，其包含编码多肽的多核苷酸，和一个或多个(几个)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中一个或多个(几个)基因经修饰使得突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[2]段I的突变体，其包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。[3]段I或2的突变体，其包含第一天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。[4]段1-3任一项的突变体，其包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。[5]段1-4任一项的突变体，其包含第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。[6]段1-5任一项的突变体，其包含第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。[7]段1-6的突变体，其包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。[8]段1-7任一项的突变体，其中所述多肽对木霉属菌株是天然或外源的。[9]段1-8任一项的突变体,其中所述木霉属菌株选自下组哈茨木霉,康宁木霉，长枝木霉，里氏木霉，和绿色木霉。[10]段1-9任一项的突变体，其中所述木霉属菌株是里氏木霉。
[11]段1-10任一项的突变体，当其在相同条件下培养时,相对于亲本木霉属菌株，产生少至少25%的一种或多种(几种)选自下组的酶第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[12]段1-10任一项的突变体，当其在相同条件下培养时,相对于亲本木霉属菌株，在一种或多种(几种)选自下组的酶方面完全缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[13]段1-12任一项的突变体，其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID NO: I ；(ii)SEQ ID NO: I的成熟多肽编码序列，(iii)⑴ 或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i)，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: I或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[14]段1-13任一项的突变体，其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:2或其成熟多肽或由SEQ ID NO:2或其成熟多肽组成。[15]段1-14任一项的突变体，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDNO: 3 ； (ii) SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i),(ii)，或(iii)的全长互补链；和(C)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 3或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[16]段1-15任一项的突变体，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶包含SEQ ID N0:4或其成熟多肽或由SEQ ID N0:4或其成熟多肽组成。[17]段1-16任一项的突变体，其中所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组
(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDN0:5 ；(ii)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(iii)包含于⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)的(i)，(ii)，或(iii)全长互补链；和(C)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 5或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一1丨生。[18]段1-17任一项的突变体，其中所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含SEQ IDNO:6或其成熟多肽或由SEQ ID NO:6或其成熟多肽组成。[19]段1-18任一项的突变体，其中所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:99 ；(ii)SEQ ID N0:99的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 100或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%,至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[20]段1-19任一项的突变体，其中所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 100或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 100或其成熟多肽组成。[21]段1-20任一项的突变体，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQIDN0:3 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)
(i)，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(C)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 107或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一'I"生。[22]段1-21任一项的突变体，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶包含SEQ IDNO: 108或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 108或其成熟多肽组成。[23] 一种产生多肽的方法,其包括在用于产生多肽的培养基中培养亲本木霉属菌株的突变体，其中突变体菌株包含编码多肽的多核苷酸，和一个或多个(几个)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中一个或多个(几个)基因经修饰使得突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株,分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶；和从培养基回收所述多肽。[24]段23的方法，其中所述突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。
[25]段23或24的方法，其中所述突变体包含第一天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。[26]段23-25任一项的方法，其中所述突变体包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。[27]段23-26任一项的方法，其中所述突变体包含第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。[28]段23-27任一项的方法，其中所述突变体包含第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。[29]段23-28任一项的方法，其中所述突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。[30]段23-29任一项的方法，其中所述多肽对于木霉属菌株是天然或外源的。
[31]段23-30任一项的方法,其中木霉属菌株选自下组哈茨木霉,康宁木霉,长枝木霉，里氏木霉，和绿色木霉。[32]段23-31任一项的方法，其中所述木霉属菌株是里氏木霉。[33]段23-32任一项的方法，其中所述突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，产生少至少25%的一种或多种(几种)选自下组的酶第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[34]段23-32任一项的方法，其中所述突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，在一种或多种(几种)选自下组的酶方面完全缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[35]段23-34任一项的方法，其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID NO: I ；(ii)SEQ ID NO: I的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: I或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[36]段23-35任一项的方法，其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:2或其成熟多肽或由SEQ ID NO:2或其成熟多肽组成。[37]段23-36任一项的方法，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID NO: 3 ；(ii)SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 3或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[38]段23-37任一项的方法，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶包含SEQ ID N0:4或其成熟多肽或由SEQ ID N0:4或其成熟多肽组成。[39]段23-38任一项的方法，其中所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组
(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:5 ；(ii)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(iii)包含于⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)的全长互补链，或(iii);和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[40]段23-39任一项的方法，其中所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含SEQ IDNO:6或其成熟多肽或由SEQ ID NO:6或其成熟多肽组成。[41]段23-40任一项的方法，其中所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:99 ；(ii)SEQ ID N0:99的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列具有与SEQID NO: 100或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%,至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[42]段23-41任一项的方法，其中所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 100或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 100或其成熟多肽组成。[43]段23-42任一项的方法，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDN0:107 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)
(i)，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(C)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 107或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一'I"生。[44]段23-43任一项的方法，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 108或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 108或其成熟多肽组成。[45] 一种用于获得亲本木霉属菌株的突变体的方法，其包括修饰一个或多个(几个)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因；和鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中一个或多个(几个)选自下组的基因经修饰第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，使得突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[46]段45的方法，其中所述突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基 因的修饰。[47]段45或46的方法，其中所述突变体包含第一天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。[48]段45-47任一项的方法，其中所述突变体包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。[49]段45-48任一项的方法，其中所述突变体包含第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的修饰。[50]段45-49任一项的方法，其中所述突变体包含第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。[51]段45-50任一项的方法，其中所述突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。[52]段45-51任一项的方法，其中所述多肽对于木霉属菌株是天然或外源的。[53]段45-52任一项的方法,其中所述木霉属菌株选自下组哈茨木霉,康宁木霉，长枝木霉，里氏木霉，和绿色木霉。[54]段45-53任一项的方法,其中所述木霉属菌株是里氏木霉。[55]段45-54任一项的方法,其中所述突变体菌株当在相同条件下培养时,相对于亲本木霉属菌株，产生少至少25%的一种或多种(几种)选自下组的酶第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[56]段45-54任一项的方法,其中所述突变体菌株当在相同条件下培养时,相对于亲本木霉属菌株，在一种或多种(几种)选自下组的酶方面完全缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[57]段45-56任一项的方法，其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID NO: I ；(ii)SEQ ID NO: I的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i)，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: I或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[58]段45-57任一项的方法，其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:2或其成熟多肽或由SEQ ID NO:2或其成熟多肽组成。[59]段45-58任一项的方法，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少 中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID NO: 3 ；
(ii)SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 3或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[60]段45-59任一项的方法，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶包含SEQ ID N0:4或其成熟多肽或由SEQ ID N0:4或其成熟多肽组成。[61]段45-60任一项的方法，其中所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:5 ；(ii)SEQ ID NO: 5的成熟多肽编码序列，(iii)包含于⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，
(ii)，或(iii)的全长互补链；和(C)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 5或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[62]段45-61任一项的方法，其中所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含SEQ IDNO:6或其成熟多肽或由SEQ ID NO:6或其成熟多肽组成。[63]段45-62任一项的方法，其中所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID N0:99 ；(ii)SEQ ID N0:99的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列具有与SEQID NO: 100或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%,至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[64]段45-63任一项的方法，其中所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 100或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 100或其成熟多肽组成。[65]段45-64任一项的方法，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶基因选自下组(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQIDN0:3 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii)的全长互补链；和(C)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 107或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序 列同一'I"生。[66]段45-65任一项的方法，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 108或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 108或其成熟多肽组成。本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。本文中引用了多种参考文献，其公开通过全文提述并入本文。
权利要求
1.一种亲本木霉属(Trichoderma)菌株的突变体，其包含编码多肽的多核苷酸和一个或多个(几个)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，分别在选自下组的一种或多种(几种)酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。
2.权利要求I的突变体，其包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。
3.权利要求I或2的突变体，其中所述多肽对于木霉属菌株是天然或外源的。
4.权利要求1-3任一项的突变体，其中所述木霉属菌株选自下组哈茨木霉(Trichoderma harzianum),康宁木霉(Trichoderma koningii),长枝木霉(TrichodermaIongibrachiatum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，和绿色木霉(Trichoderma viride)。
5.权利要求1-4任一项的突变体，其中所述木霉属菌株是里氏木霉。
6.权利要求1-5任一项的突变体，当其在相同条件下培养时,相对于亲本木霉属菌株，完全缺陷或产生少至少25%的选自下组的一种或多种(几种)酶第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。
7.权利要求1-6任一项的突变体，其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQID N0:2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDNO: I ； (ii) SEQ ID NO: I的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i),(ii)，或(iii)的全长互补链；和 (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: I或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
8.权利要求1-7任一项的突变体，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶基因选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:4或其成熟多肽具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一 I"生; (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDNO: 3 ； (ii) SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i),(ii)，或(iii)的全长互补链；和(C)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO: 3或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
9.权利要求1-8任一项的突变体，其中所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:6或其成熟多肽具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一 I"生； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDNO:5 ；(ii)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(iii)包含于⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全长互补链；和 (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO: 5或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
10.权利要求1-9任一项的突变体，其中所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQID NO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%,至少95%,或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDNO:99 ；(ii)SEQ ID NO:99的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全长互补链；和 (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 100或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
11.权利要求1-10任一项的突变体，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶基因选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDNO:3 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii)的全长互补链；和 (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO: 107或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
12.—种产生多肽的方法，其包括(a)在用于产生多肽的培养基中培养权利要求1-11任一项的突变体；和 (b)从培养基回收所述多肽。
13.一种用于获得亲本木霉属菌株的突变体的方法，其包括 (a)修饰一个或多个(几个)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因；和 (b)鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中一个或多个(几个)选自下组的基因经修饰第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，使得突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。
14.权利要求13的方法，其中所述突变体包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修饰。
15.权利要求13或14的方法，其中所述突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株,完全缺陷或产生少至少25%的一种或多种(几种)选自下组的酶第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。
16.权利要求13-15任一项的方法，其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQID N0:2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDNO: I ； (ii) SEQ ID NO: I的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i),(ii)，或(iii)的全长互补链；和 (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: I或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
17.权利要求13-16任一项的方法，其中第一天冬氨酸蛋白酶基因选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:4或其成熟多肽具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一 I"生； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDNO: 3 ； (ii) SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i),(ii)，或(iii)的全长互补链；和(C)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO: 3或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
18.权利要求13-17任一项的方法，其中所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:6或其成熟多肽具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一 I"生； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID NO:5 ；(ii)SEQ ID NO: 5的成熟多肽编码序列，(iii)包含于⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全长互补链；和 (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO: 5或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
19.权利要求13-18任一项的方法，其中所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQID NO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%,至少95%,或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDNO:99 ；(ii)SEQ ID NO:99的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii)的全长互补链；和 (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 100或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
20.权利要求13-19任一项的方法，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶基因选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交(i) SEQ IDNO:3 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽编码序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii)的全长互补链；和 (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO: 107或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
全文摘要
本发明涉及亲本木霉属菌株的突变体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码多肽和一个或多个(几个)选自下组的基因第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中一个或多个(几个)基因经修饰使得突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，分别在一种或多种(几种)选自下组的酶的产生方面有缺陷第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。本发明还涉及产生此类突变体中的多肽的方法，和用于产生此类突变体的方法。
文档编号C12N9/58GK102762714SQ201080063993
公开日2012年10月31日 申请日期2010年12月17日 优先权日2009年12月18日
发明者A.詹, E.阿巴特, J.沙斯基, K.布朗, S.梅宇兰, S.梅里诺 申请人:诺维信股份有限公司