专利名称：用于测定包含tc1507事件的玉米的接合性的端点taqman法的制作方法
用于测定包含TC1507事件的玉米的接合性的端点TAQMAN法
背景技术：
Herculex^ I是ー种对昆虫损害(特别是欧洲玉米螟的)有抗性的商业玉米产品，其包含CrylF事件TC1507。该事件本身披露于例如美国专利No. 7，605，310和7，449，564。可以使用多种方法来检测玉米样品中的此事件的存在。一个例子是焦磷酸测序(pyrosequencing)技术，如由 Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24，2000)所描述的。在此方法中，设计与相邻的基因组DNA和插入DNA连接重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(在插入序列中的一条引物和在侧翼基因组序列中的一条)杂交，并在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸酯和萤光素的情况中温育。个别添加DNTP，并且掺入导致测量的光信号。由于成功扩增、杂 交、和单或多碱基延伸，光信号指示转基因插入/側翼序列的存在。(此技木通常用于初始的测序，在特定基因已知时不用于其检测)。荧光偏振是另ー种可以用于检测扩增子的方法。遵循此方法，将寡核苷酸设计为与基因组侧翼和插入DNA连接重叠。将寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(在插入DNA中的一条引物和在侧翼基因组DNA序列中的一条)杂交，并在存在DNA聚合酶和经荧光标记的ddNTP的情况中温育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。可以使用荧光计以偏振变化测量掺入。由于成功扩增、杂交、和单碱基延伸，偏振变化指示转基因插入/侧翼序列的存在。TAQMAN(Life Technologies, Foster City, Calif.)是一种检测并量化 DNA 序列的存在的方法。简言之，将FRET寡核苷酸探针设计为转基因内的一种寡聚物和侧翼基因组序列中的一种以进行事件特异性检测。在存在热稳定性聚合酶和dNTP的情况中循环FRET探针和PCR引物(在插入DNA序列中的一条引物和在侧翼基因组序列中的一条)。FRET探针的杂交导致对荧光模块的切割和释放，远离FRET探针上的淬灭模块。由于成功扩增和杂交，荧光信号指示侧翼/转基因插入序列的存在。已经描述了分子信标(Molecular Beacon)在序列检测中使用。简言之，设计与侧翼基因组和插入DNA连接重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致其含有使荧光和淬灭模块保持极其接近的ニ级结构。在存在热稳定性聚合酶和dNTP的情况中循环FRET探针和PCR引物(在插入DNA序列中的一条引物和在侧翼基因组序列中的一条)。在成功的PCR扩增后，FRET探针与靶序列的杂交导致除去探针ニ级结构和空间分离荧光和淬灭模块。由于成功扩增和杂交，荧光信号指示侧翼基因组/转基因插入序列的存在。许多中的另ー个考验是寻找适合于给定测试的參照基因。例如，如Czechowski等的摘要中所述的，“来自Affymetrix ATHl全基因组GeneChip研究的格外大的数据集提供了鉴定在模式植物物种拟南芥属(Arabidopsis)(拟南芥(Arabidopsis thaliana))中具有非常稳定的表达水平的新一代參照基因的手段。找到贯穿发育及在一系列环境条件下就表达稳定性而言胜过传统的參照基因的数百种拟南芥基因。” (Czechowski等(2005)Genome-wide identification and testing of superior reference genes fortranscript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol.139，5 - 17)。Brodmann等(2002)涉及欧盟批准的4种不同玉米品种的食物中的转基因玉米含量的实时定量 PCR 检测。Brodmann，P. D.，P. D.，Ilg E. C. , Berthoud H.和 Herrmann，A.Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four GeneticallyModified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international2002 85(3) oHernandez等(2004)提及与实时PCR —起使用的4种可能的基因。Hernandez, M.，Duplan, M. -N.，Berthier, G.，Vaitilingom, M.，Hauser, W.，Freyer, R.，Plaj M.冲:ロ Bertheau, Y. Development and comparison oi four real-time polymerase chainreaction systems for specific detection and quantification of Zea maysL J. Agric. Food Chem. 2004，52，4632-4637。 Costa等(2007)考虑这4种基因(也在实时PCR背景中)，并且推断醇脱氢酶和玉米醇溶蛋白基因是用于检测转基因饲料混合组织的样品“事件”(凝集素基因)的最好的参照基因。Costa，L D.和 Martinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Basedon Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically ModifiedSoybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007，55，1264—1273。Huang等(2004)使用质粒pMulM2作为参照分子来检测玉米中的M0N810和NK603转基因。Huang 和 Pan，“Detection of Genetically Modified Maize M0N810 and NK603by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods，，，J. Agric. FoodChem.，2004，52 (11)，pp 3264 - 3268。Gasparic等(2008)通过与循环探针技术、TaqMan、和各种实时PCR化学比较提示了 LNA技术，以定量分析玉米事件(诸如M0N810)。Gasparic, Cankar, Zel和Gruden，“Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitabilityfor detection and quantification of genetically modified organisms, ” BMCBiotechnol.2008;8:26。US 20070148646涉及ー种用于量化的引物延伸方法，其需要可以通过掺入的核苷酸量检测并量化的个别核苷酸的受控分配。这与使用内部参照基因的TaqMan PCR方法不同。为了区別TC1507的纯合子和半合子基因型，已经为此事件成功使用Invader测定法。Gupta，M.，Nirunsuksiri, W.，Schulenberg, G.，Hartl, T.，NovaKj S.，Bryan, J.，Vanopdorp, N. , Bing, J.和 Thompson，S. A non-PCR-based Invaaer Assay Quantitatively DetectsSingle-Copy Genes in Complex Plant Genomes. Mol. Breeding 2008，21，173-181。Huabang(2009)涉及转基因玉米的基于PCR的接合性测试。然而，似乎没有使用参照基因。Huabang，“An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method forGenetically Modified Maize，’’Molecular Plant Breeding，2009，Vol. 7，No. 3，619-623.发明概述本发明部分涉及用于测定玉米中的事件TC1507的接合性的分子測定法。更具体地，本发明部分涉及利用玉米内源参照基因的用于玉米中的Hercidex l事件TC1507的端点TaqMan PCR測定法。一些实施方案涉及能够高通量接合性分析的測定法。本发明进一步部分涉及用于测定接合性的优选參照基因的发现。附图
简述图I显示了样品数目与S0B1/S0B2的绝对比率间的分布图的例子。图2是TC1507与调查的不同參照基因的二重(biplex)组合的实时PCR扩增图。用CrylF纯合子基因组DNA的2倍连续稀释液分别对TC1507与ivr (2a)、hmg(2b)、ivrl04(2c)、和zein(2d)的二重显示实时PCR扩增图。用每个稀释液得到的Ct值在其相应的图内部显示。图3是使用不同參照基因用端点TaqMan的CrylF接合性测定的分布图。对于使用ivrl04(a)、ivr (b)、hmg(c)和zein(d)作为參照基因的测定法,小图如下。在完成PCR和荧光读数后，产生分布图=SOBl=FAM的高于背景的信号(于535nm的高于背景信号平均 值的样品信号)、S0B2=Cy5的高于背景的信号(于670nm的高于背景信号平均值的样品信号)。对于ivrl04(a)，可以进行基因型调用(call)，其中对于野生型，S0B1/S0B2〈0. 5，对于半合子，0. 5〈S0B1/S0B2〈2，而对于纯合子，S0B1/S0B2>2。图4显示了对三个群体(对于每个群体为2块96孔板的基因组DNA)使用ivrl04作为參照基因用端点TaqMan測定法的CrylF接合性測定的验证。在完成PCR和荧光读数后，产生分布图=SOBl=FAM的高于背景的信号(于535nm的高于背景信号平均值的样品信号的比率)、S0B2=Cy5的高于背景的信号(于670nm的高于背景信号平均值的样品信号的比率)。因而，用纯合子、半合子和野生型的独特簇进行基因型调用。图4a是对Cry34/35PoCrylF叠加群体用端点TaqMan测定法的CrylF接合性测定的分布图。图4b是对PoCrylF单ー叠加群体用端点TaqMan测定法的CrylF接合性测定的分布图。图4c (PoCry 1F_NK603)仅具有两个簇(纯合子和半合子)，因为如预期的，WT植物未幸免于除草剂喷雾。序列简述SEQ ID NO: I是玉米事件TC1507的5’侧翼序列的序列。SEQ ID N0:2是玉米事件TC1507的3’侧翼序列的序列。SEQ ID NO: 3是玉米事件TC1507的连续序列，其包含5’侧翼序列、crylF插入物、和3’侧翼序列。SEQ ID N0s:4_21是依照本发明使用的例示的引物和探针。发明详述本发明部分涉及基于荧光的端点TaqMan PCR測定法，其利用内源基因作为參照(拷贝数)对照以对TC1507(即ー种玉米CrylF事件)进行高通量接合性分析。本发明进一歩部分涉及优选的參照基因转化酶的发现。将几种參照基因鉴定为可能的选项。本发明还部分涉及用于TC1507事件特异性接合性分析的二重端点TaqMan PCR的开发。此外，本发明部分涉及TC1507育种测试试剂盒的开发。端点TaqMan測定法基于+/_策略，根据该策略，“ + ”表示样品在測定的基因方面呈阳性，而表示样品在測定的基因方面呈阴性。这些测定法通常利用分别用于鉴定TC1507转基因序列和野生型基因序列的两组寡核苷酸以及测量转基因和野生型序列含量的经双重标记的探针。虽然Invader测定法已经是一种用于表征这些事件的稳健技术,但是它对DNA质量非常灵敏。另外，该测定法需要较高的DNA数量。Invader还需要额外的变性步骤，若不正确操作，它可使Invader测定法不成功。另外，Invader测定法的较长测定时间在其有效加工商业背景中分析的大量TC1507样品的灵活性上受到限制。本发明的ー个主要优点是节省时间的且消除变性步骤。用于检测TC1507事件的主题端点TaqMan分析提供与Invader相比的令人惊讶的优点，特别是在分析大量样品中。然而，其对TC1507的应用是复杂的。举例而言，TC1507的边界区不是实际的基因组序列。例如，它含有重复侧翼序列。它是ー种含有转基因片段和反转录转座子的独特序列，其会被理解为ー种执行此上下文中的端点Taqman測定法+/-策略的非常显著的障碍。另外，例如，尝试多种引物和探针组合。然而，那些组合无一导致能够区别野生型等位基因和转基因的強力信号。在一个实施方案中，TC1507事件特异性PCR反应扩增出对于事件独特的58_bp片段，其源自TC1507构建体盒对玉米基因组DNA的插入。TC1507靶物特异性寡核苷酸探针 结合两种事件特异性PCR引物间的靶物，并且用荧光染料和淬灭剂标记。可能的荧光标记物包括在TC1507探针5’端作为报告物染料的FAM和在TC1507探针3’端作为淬灭剂的Black Hole Quencher I (BHQl)。使用一批经验因素以及我们的判断，我们凭经验鉴定出如下的玉米内源基因，其能够单或低拷贝数PCR扩增，并且证明了其在许多栽培种中是保守的。大量參照基因是可能性。我们为了初始评估选择的參照基因作为TC1507接合性分析的可能的參照基因评估。选出5组寡聚物(表I) :ivr、ivrl04 (来自转化酶的79和104bp片段)、adh (来自adhl的136bp片段)、hmg(来自hmga的79bp片段)、和zein (来自玉米醇溶蛋白的72bp片段)。评估基因特异性引物和基因特异性探针(在一个实施方案中用探针5’端的Cy5和探针3’端的Black Hole Quencher 2 (BHQ2)标记)以在作为TC1507接合性分析的可能的參照基因评估的玉米内源基因的快速量化中使用。对CrylF基因和玉米内源基因的基因特异性引物和探针测试PCR效率。对多重化(multiplexing)性能和端点TaqMan接合性测定法进ー步利用测定为与CrylF事件特异性引物和探针具有相对相似的PCR效率的玉米内源基因的引物和探针组合。对所有寡聚物测试PCR效率。对多重化和端点TaqMan接合性测定法进ー步利用与事件特异性寡聚物具有相对接近的PCR效率的寡聚物。在一些实施方案中，此接合性測定法在相同扩增测定法中利用对TC1507事件和对玉米内源參照基因(在一些优选的实施方案中为转化酶)特异性的寡核苷酸的二重。通过与參照DNA相比，对事件TC1507特异性的荧光的相对强度来測定接合性。在一些实施方案中，TC1507事件特异性测定法扩增出对于事件独特的58-bp片段，其源自TC1507构建体盒对玉米基因组DNA的插入。靶物特异性寡核苷酸探针结合两种事件特异性TC1507 PCR引物间的靶物，并且用两种荧光染料标记在其5’端作为报告染料的FAM和在其3’端作为淬灭剂染料的BHQ。在最佳循环数后测量PCR产物，此时反应处于早期指数期。在一些实施方案中，玉米特异性參照系统扩增出转化酶基因的104bp片段。使用一对转化酶特异性寡聚物和在3’端用Cy5和在5’端用BHQ标记的转化基因特异性探针进行快速定量。在一些实施方案中，用于TC1507接合性分析的基于荧光的端点TaqMan测定法容许在读板仪中直接读取结果以鉴定玉米中的HcrcuIcx屮[事件TC1507和參照基因。本发明包括育种应用诸如测试Herculex I对其它玉米系的基因渗入Untrogression,澌渗入)。可以使用本发明的检测方法和试剂盒来鉴定依照本发明的事件。可以使用本发明的方法和试剂盒进行加速的育种策略及建立连锁数据。本发明的检测技术与植物育种一起特别是有用的，以在将包含感兴趣事件的亲本植物与另ー种亲本系杂交以在后代中赋予ー种或多种感兴趣的其它性状后，測定哪些后代植物是否包含给定的事件。这些Taqman PCR分析法使玉米育种程序及质量控制受益，尤其对于商业化的转基因玉米种子。现在还可以生成并使用用于这些转基因玉米系的Taqman PCR检测试剂盒。这还可以使产品登记和产品管理受益。
此外，可以使用本发明来研究并表征转基因整合过程、基因组整合位点特征、事件分选、转基因及其侧翼序列的稳定性、和基因表达(尤其是涉及基因沉默、转基因甲基化模式、位置效应和潜在的表达相关元件诸如MARS [基质附着区]等)。本发明进ー步包括使用TC1507植物作为至少一个亲本进行杂交的方法。例如，本发明包括具有本文中例示的任何植物作为ー个或两个亲本的Fl杂种植物。本发明包括一种用于生产Fl杂种种子的方法，其通过将例示的植物与不同(例如，近交亲本)植物杂交，收获所得的杂种种子，并测试依照本发明的种子/植物样品来进行。可以通过仔细考虑亲本植物来改善所得植物的特征。可以如下育种昆虫抗性玉米植物，即首先将由自本文中提及的任一种系的种子种植的玉米植物组成的第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，由此生成多个第一后代植物；然后选出对昆虫有抗性(或拥有本发明的至少ー个事件)的第一后代植物；并自交第一后代植物，由此生成多个第二后代植物；然后自第二后代植物选出对昆虫有抗性(或拥有本发明的至少ー个事件)的第二后代植物。这些步骤可以进ー步包括第一后代植物或第二后代植物与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物的回交。然后，可以种植包含本发明的玉米种子的玉米作物或其后代。还应当理解，也可以将两种不同转基因植物杂交以生成含有两个独立分离的添加的外源基因的后代。合适后代的自交可以生成在这两种添加的外源基因方面纯合的植物。因为是无性繁殖，所以也涵盖与亲本植物回交和与非转基因植物的异型杂交。通常用于不同性状和作物的其它育种方法是本领域中已知的。已经使用回交育种来将简单遗传的、高度可遗传性状的基因转移入期望的纯合栽培种或近交系(其作为回归亲本)中。要转移的性状的来源称作供体亲本。预期所得的植物具有回归亲本(例如栽培种)的属性和自供体亲本转移的期望的性状。在初始杂交后，将拥有供体亲本表型的个体选出并与回归亲本重复杂交(回交)。预期所得的亲本具有回归亲本(例如栽培种)的属性和自供体亲本转移的期望的性状。本发明的DNA分子在标志物辅助育种(MAB)方法中可以作为分子标志物使用。本发明的DNA分子可以在鉴定遗传连锁的农艺学有用的性状的方法(诸如AFLP标志物、RFLP标志物、RAPD标志物、SNPjP SSR)中使用，如本领域中已知的。可以使用MAB方法在与本发明的玉米植物(或其后代及任何其它玉米栽培种或品种)的杂交后代中追踪昆虫抗性性状。DNA分子是此性状的标志物，并且可以使用本领域中公知的MAB方法来在玉米植物中追踪昆虫抗性性状，其中本发明的至少ー种玉米系或其后代是亲本或祖先。可以使用本发明的方法来鉴定具有来自玉米系TC1507的昆虫抗性事件的任何玉米品种。本发明的方法包括ー种生成昆虫抗性玉米植物的方法，其中所述方法包括用本发明的植物育种。更具体地，所述方法可以包括杂交本发明的两种植物，或本发明的ー种植物和任何其它植物，并追踪依照本发明的主题事件。优选的方法进ー步包括通过对所述后代分析依照本发明可检出的事件来选择所述杂交的后代。依照本发明繁殖并开发的一种优选的植物，或种子包含在其基因组中至少ー种插入物序列(如表I中鉴定的)，以及在插入物的两侧上的至少20-500或更多个连续侧翼核苷酸(如表I中鉴定的)。除非另有指示，“事件TC1507”或类似的提及指SEQ ID N0:3的DNA,其包含通过与插入DNA紧密相邻的整个或部分SEQ ID NO: I和/或SEQ ID NO: 2侧翼基因组序列两者(预期其会由于包含该事件的亲本系的有性杂交而转移至接受插入DNA的后代)鉴定的基因组位置中插入的异源DNA。 本文中提供了定义和例子以帮助描述本发明，并且指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有记录，应当依照相关领域普通技术人员的常规用法理解术语。使用DNA碱基的命名，如于37CFR§ I. 822列出的。转基因“事件”如下产生，即用异源DNA，即包含感兴趣转基因的核酸构建体转化植物细胞、源自转基因插入植物基因组的植物群体的再生、并选择以插入特定的基因组位置中为特征的特定植物。术语“事件”指包含异源DNA的初始转化体和转化体的后代。术语“事件”也指通过转化体和包含基因组/转基因DNA的另一品种间的有性异型杂交产生的后代。即使在对回归亲本进行重复回交后，插入的转基因DNA和来自所转化亲本的侧翼基因组DNA (基因组/转基因DNA)在杂交后代中也存在于相同的染色体位置。术语“事件”也指来自初始转化体及其后代的DNA，该DNA包含插入的DNA和紧邻插入DNA的侧翼基因组序列，由于包含所插入DNA的亲本系(例如初始转化体和自交后代)和不含所插入DNA的亲本系间的有性杂交，可以预期该DNA会转移到接受包含感兴趣转基因在内的插入DNA的后代中。“连接序列”跨越插入基因组中的DNA与在插入点侧翼的玉米天然基因组的DNA连接的点，在植物遗传物质中鉴定或检测出ー个或另一个连接序列便足以诊断该事件。包括跨越本文中所描述的玉米事件中的插入物和类似长度的侧翼DNA的DNA序列。本文中提供了此类诊断序列的具体例子；然而，与各插入物的连接，或插入物与基因组序列的连接重叠的其它序列也是诊断性的，并且可以依照本发明使用。部分基于侧翼、连接、和/或插入序列设计依照本发明使用的引物、扩增子和探针。相关引物和扩增子可以作为本发明的组分包括在内。可以使用PCR分析方法来检测或鉴定源自主题专利转基因玉米系的商业化转基因玉米品种或系，所述PCR分析方法使用跨越整个插入DNA及其边界的扩增子。HERCULEX I (TC1507事件)的5，侧翼序列的序列以SEQ ID NO: I提供。3，侧翼序列的序列以SEQ ID N0:2提供。侧翼有(SEQ ID N0s:l和2的)侧翼序列的crylF插入物(与调节序列一起)的序列以SEQ ID NO: 3提供。表I提供了就SEQ ID NO: 3而言的插入物和侧翼序列的坐标。
权利要求
1.一种用于测定玉米组织中的TC1507事件的接合性的方法，所述TC1507事件包含含有crylF基因的转基因构建体，所述方法包括使用基于荧光的端点Taq PCR测定法来检测所述TC1507事件和内源参照基因， 所述方法包括 自所述玉米组织获得基因组DNA的样品， 使所述样品与下列各项接触 a.事件正向弓I物和事件反向引物，其中至少一种所述事件弓I物特异性结合所述转基因构建体，且其中在存在于所述样品中时，所述引物生成所述事件诊断性的事件扩增子， b.参照正向引物和参照反向引物，其自所述内源参照基因生成参照扩增子， c.荧光事件探针，其与所述事件扩增子杂交， d.荧光参照探针，其与所述参照扩增子杂交， 定量与所述事件扩增子杂交的所述荧光事件探针， 定量与所述参照扩增子杂交的所述荧光参照探针， 比较杂交的荧光事件探针与杂交的荧光参照探针的量；并 通过比较杂交的荧光事件探针和杂交的荧光参照探针的荧光比率来测定TC1507的接合性。
2.权利要求I的方法，其中一种事件引物与TC1507侧翼序列杂交，而一种事件引物与所述转基因构建体杂交。
3.权利要求2的方法，其中所述TC1507侧翼序列选自下组SEQID N0:1和SEQ IDN0:2。
4.权利要求2的方法，其中所述转基因构建体是SEQID NO:3的残基2830-9015。
5.权利要求I的方法，其中所述参照基因是内源玉米转化酶基因。
6.权利要求2的方法，其中所述侧翼序列是SEQID NO:3的残基2629-2829。
7.权利要求2的方法，其中所述侧翼序列是SEQID NO: 3的残基9016-9216。
8.权利要求5的方法，其中所述方法用于所述TC1507事件对另一种玉米系的育种基因渗 入。
9.权利要求8的方法，其中所述另一种玉米系是空TC1507玉米系。
10.权利要求I的方法，其中所述事件扩增子是58个碱基对。
11.权利要求5的方法，其中所述参照基因包含选自下组的序列或与选自下组的序列杂交SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8、和 SEQ ID NO:9。
12.权利要求I的方法，其中所述参照引物包含SEQID NO:7和SEQ ID NO:8，且所述参照探针包含SEQ ID NO:9。
13.权利要求I的方法，其中所述探针是用荧光染料和淬灭剂标记的。
14.权利要求13的方法，其中所述事件探针包含在所述事件探针的5’端作为所述荧光染料的FAM和在所述事件探针的3’端上作为所述淬灭剂的Black Hole QuencherI(BHQl)。
15.权利要求I的方法，其中所述参照基因是能够单或低拷贝数PCR扩增的保守玉米内源基因。
16.权利要求13的方法，其中所述参照探针在所述参照探针的5’端用Cy5并在所述参照探针的 3，端用 Black Hole Quencher 2 (BHQ2)标记。
17.权利要求12的方法，其中所述参照扩增子是通过所述引物扩增的104个碱基对的片段。
18.权利要求I的方法，其中所述参照探针包含SEQID N0:9。
19.权利要求I的方法，其中所述参照正向引物包含SEQID N0:7，且所述参照反向引物包含 SEQ ID NO:8。
20.权利要求I的方法，其中在读板仪中直接读取所述方法的结果。
21.权利要求I的方法，其中自田间的玉米植物获得所述样品。
22.一种用于实施权利要求I的方法的试剂盒，所述试剂盒包含 a.事件正向引物和事件反向引物，其中至少一种所述事件引物特异性结合所述cryIF转基因构建体，且其中在存在于所述样品中时，所述引物生成所述事件诊断性的事件扩增子; b.参照正向引物和参照反向引物，其自所述内源参照基因生成参照扩增子； c.事件探针，其与所述事件扩增子杂交；和 d.参照探针，其与所述参照扩增子杂交。
全文摘要
提供了一种用于对玉米Cry1F事件TC1507的接合性分析的方法。该方法提供了在端点二重TaqMan PCR测定法中使用的TC1507事件特异性和玉米内源参照基因特异性引物和TaqMan探针组合，其能够产生帮助TC1507分子育种的强力基因型调用(call)。
文档编号C12P19/34GK102770553SQ201080064269
公开日2012年11月7日 申请日期2010年12月17日 优先权日2009年12月18日
发明者M.古普塔, S.库姆帕特拉, S.诺瓦克, T.W.格里尼, W.陈, W.马奇奥尼 申请人:陶氏益农公司