专利名称：新肺炎病毒组合物及其使用方法
技术领域：
本发明一般涉及病毒学领域，并且更特定是在包括犬和猫在内的哺乳动物中发现的副粘病毒(Paramyxoviridae)科,肺炎病毒(Pneumovirinae)亚科的新发现病毒。
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背景技术：
关在一起的家犬，如在收容所、犬舍或繁育基地中，经常受到急性呼吸道感染(犬窝咳)影响。该疾病快速传播并难于消除，因为新动物会不断引入。一系列试剂会产生多 个和顺序重叠感染的复杂综合征，使诊断和治疗困难。受影响犬的临床征兆从轻度干咳和流鼻涕液到严重病例的肺炎和死亡。猫也被多种试剂感染，产生不同严重程度的呼吸窘迫。相同或相似病毒也能感染人。因此，当前且仍需要确定感染多种哺乳动物的试剂和发展用于诊断、预防和/或治疗这种感染的组合物和方法。本发明满足了这些需要。
发明内容
本发明基于新肺炎病毒的发现。所述病毒能感染不同类型的哺乳动物，包括但不必需限于犬、猫和可能的人。病毒的出现可与犬的急性呼吸疾病(ARDC)或猫呼吸疾病，或人或其他哺乳动物的呼吸或其他疾病正关联。发明提供病毒的分离多核苷酸和蛋白以及分离病毒本身。发明包括检测病毒的组合物和方法，以及预防和/或治疗与病毒出现正相关的疾病征兆的方法和组合物。也提供包括病毒的分离细胞。发明的病毒是负链RNA病毒。发明包括分尚负链,与负链反向互补的正链,RNA多核苷酸的DNA等价物，正链编码的蛋白，以及多核苷酸和蛋白的片段。某些实施方式中，经分离病毒包含的负链多核苷酸含有序列SEQ IDNO: I或与SEQID NO: I序列至少96%相同的序列。也提供包含SEQ IDN0:2或SEQ ID NO: 3序列的分离多核苷酸，或具有与SEQ ID N0:2或3序列至少96%相同的序列的多核苷酸。发明提供刺激哺乳动物免疫反应的方法。刺激免疫反应可以是细胞介导，体液或其结合，并能对动物提供预防和/或治疗益处。刺激免疫反应的方法包括给予哺乳动物包括本文所述多核苷酸和/或病毒，本文所公开病毒多核苷酸编码的病毒蛋白，所述蛋白的片段或其组合的组合物。多核苷酸，病毒和/或蛋白和/或其片段能从任何合适来源分离，或能用熟知技术重组生成。发明提供检测哺乳动物所得生物样品中病毒出现的方法。所述方法包括从哺乳动物获得生物样品并从生物样品中检测病毒包括的多核苷酸序列，或病毒蛋白或其片段。多核苷酸、蛋白、蛋白片段或其组合的出现指示哺乳动物被病毒感染。附图
简要说明
图I.使用人类呼吸道合胞病毒特异性单克隆抗体(Mab)的A72细胞免疫荧光分析。A)感染细胞上的Mab 2G122。B)未感染细胞上的Mab2G122。C)感染细胞上的Mab5H5N。D)未感染细胞上的Mab 5H5N。从生产商获得的初级Mab储液以1:100稀释使用。红色背景通过用伊文思蓝复染产生。图2.免疫荧光分析显示定向用于感染和未感染犬A72细胞的非呼吸相关测试的随机选定犬血清的反应性。A)1:320稀释的感染细胞血清。B) 1:320稀释的未感染细胞血清。红色背景由用伊文思蓝复染生成。图3.包括SEQ ID NO: I序列的病毒基因组构成的图示。发明描述本发明提供新型分离病毒，分离的病毒多核苷酸和蛋白，检测病毒的组合物和方法，和预防和/或治疗哺乳动物中与病毒出现正相关的疾病征兆的组合物和方法。 发明的病毒是负链RNA病毒。因此，病毒颗粒中包装的遗传材料是与正链反向互补的单链RNA。由RNA依赖的RNA聚合酶从负链转录生成正链。正链至少有部分mRNA功能，因为由正链编码的病毒蛋白在感染细胞的细胞质中翻译，并且之后参与新病毒颗粒的组装和负链基因组的包装。在某些实施方式中，发明提供分离的病毒包括含有序列SEQ ID NO: I或与SEQ IDNO: I序列至少96%相同序列的负链多核苷酸。发明也提供与负链互补的多核苷酸。在某些实施方式中，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:4所示序列，或与SEQ ID NO:4至少96%相同的序列。也提供分离多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO: I序列或与SEQ ID NO: I序列至少96%相同的序列，或包括SEQ ID N0:4序列或与SEQ ID N0:4序列至少96%相同的序列。也提供包括SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO:3序列的多核苷酸，或具有与SEQ ID NO:2或3序列至少96%相同序列的多核苷酸。也提供与所述序列和与反向互补物至少96%相同序列的反向互补序列。本文公开的所有这些多核苷酸和蛋白和其片段的结合也包括在发明中。能鉴定发明提供的病毒多核苷酸，其功能在于支持活病毒复制(包括减毒病毒)。也提供包括病毒的细胞。在多个实施方式中，包括病毒的细胞是分离细胞，或体外增殖以使病毒减毒的细胞，和/或用于疫苗或其他目的的病毒来源。因此，包括病毒的分离细胞，包括病毒的细胞培养物和/或细胞系，细胞培养基中出现的病毒和/或病毒产物，和包括病毒的分离组织都是发明的各个方面。在特定实施方式中，提供本发明所述各RNA序列的DNA等价物。因此，发明包括本文所述各RNA序列，其中RNA中的每个U (尿嘧啶)被T (胸腺嘧啶)取代。本发明所述的每个病毒多核苷酸包括与各多核苷酸指定SEQ ID NO中所存在序列相同的多核苷酸，并且还包括与病毒SEQ IDNO中所存在序列至少96%相同的所有多核苷酸。在特定实施方式中，与序列表所示多核苷酸序列至少96%相同的多核苷酸与那些跨其全长的序列至少96%相同。不希望受任何特定理论的束缚，认为本文出现和包括那些与序列表所列病毒多核苷酸序列有至少96%相同的多核苷酸序列与相关病毒例如已知感染鼠哺乳动物的病毒所含多核苷酸不同。不希望受任何特异理论的束缚，还认为病毒的减毒，例如连续传代，能产生包括和/或转录与序列表所示序列至少96%相同的多核苷酸的病毒。与序列表中特定引用序列不同的序列可与所示序列有96. 0%-99. 9%相同，包括其间到第一小数点的所有整数。96. 0%-100%序列相同性的所有范围(含端值)也是发明的实施方式。
多核苷酸的片段也包括在本发明中。因此，在多个实施方式中，每个病毒多核苷酸(包括反向互补物和其DNA等价物)包括多核苷酸片段，长度从10个核苷酸到多核苷酸的全长，并包括其间所有整数。例如，本发明包含多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID N0:1序列且包含其序列所有片段，包含10个核苷酸长度到多至8，598个核苷酸长度，并且包含其间所有整数。本发明提供的多核苷酸，无论是否在病毒颗粒中出现，可以比本文所述那些更长，因为所示序列可能不包含完整病毒基因组序列和/或反向互补物和/或其DNA等价物。发明也提供刺激哺乳动物免疫反应的方法。经刺激免疫反应是能提供动物预防和/或治疗益处的免疫反应。经刺激免疫反应可以是体液和/或细胞介导的免疫反应。经刺激免疫反应能针对病毒编码的任何抗原和/或免疫原。因此，完整病毒颗粒，每个病毒蛋白，和病毒蛋白片段是能用于在哺乳动物中刺激免疫反应的本发明实施方式。在多种实施方式中，刺激免疫反应的动物是家犬(Canis familiaris)或家猫(Felis catus),即分别是驯养的犬或猫。在特定实施方式中，用于刺激犬免疫反应的多核苷酸包含SEQ IDN0:1序列或与·SEQ ID NO: I序列至少96%相同的序列，或其编码蛋白或蛋白片段，或SEQ ID N0:1反向互补序列编码的病毒颗粒。包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO:3的序列的多核苷酸，或具有与SEQ ID N0:2或3序列至少96%相同序列的多核苷酸，或由SEQ ID N0:2或3反向互补序列编码的蛋白或蛋白片段或病毒蛋白，或具有与SEQ ID N0:2或3反向互补序列至少96%相同序列的多核苷酸，优选用于刺激猫的免疫反应。所述序列、蛋白、蛋白片段、和病毒颗粒与犬和猫的相同关系用于使用诊断目的的组合物，但是这并不以任何方式消除将本发明实施到其他哺乳动物上的适用性，包括人。刺激免疫反应的方法包括将含有本文所述病毒、本文所公开病毒多核苷酸编码的病毒蛋白、所述蛋白片段或其组合的组合物给予哺乳动物。病毒和/或蛋白和/或其片段能从任何合适来源分离，或能用熟知技术重组生成。在多种实施方式中，发明提供的用于疫苗的病毒蛋白包括但不必要限于吧-1、吧-2、队？、厘、5!1、6^2-1、厘2-2、1^蛋白和其组合。编码这些蛋白的所有核苷序列包括在发明中，并且能由本领域技术人员用常规技术测定。给予发明合成物的哺乳动物能是任何有风险、怀疑有、或已经诊断出病症的哺乳动物，所述病症与一个或多个肺炎病毒的出现正相关，包括但不必需限于本文公开的病毒。在一个实施方式中，动物是有风险、怀疑患有、或者已诊断有ARDC的犬。在另一个实施方式中，哺乳动物是有风险、怀疑患有或诊断有呼吸疾病或任何其他与本文所述病毒正相关的疾病的人。这方面，本领域已知涉及本文所述新发现病毒的病毒，例如鼠肺炎病毒，能造成人的广泛感染(例如，参见Pringle CR, Eglin RP. , Murine pneumoniavirus: seroepidemiological evidence of widespread human infection (〈〈鼠月市炎病毒广泛人际感染的血清流行病学证据》).J Gen Virol. 1986年6月；67(Pt 6) :975-82)。因此，有理由认为当前提供的组合物和方法有刺激人免疫反应的实用性和诊断人中病毒感染的应用。将发明组合物即疫苗给予动物能产生预防效果，意味着接受疫苗的动物中感染的可能性低于没有疫苗的动物更低，或动物中与病毒出现正相关的疾病征兆比没有接受疫苗动物更轻。给予本发明疫苗也能有治疗效果，意味着感染程度(如病毒负荷或效价和/或其他本领域技术人员已知的感染程度标记)在感染并接受疫苗后的动物中相对于感染但没有接受疫苗的动物更低。类似地，感染并接受疫苗的动物中与动物病毒出现正相关的疾病征兆比没有接受疫苗的动物更轻。本文所述病毒和/或蛋白和多核苷酸能分离，意味着其从自然环境中去除，例如从动物和/或获自动物的生物样品中分离病毒。在一个实施方式中，包括本文所述病毒的分离细胞视作包括分离病毒。此外，本发明的分离病毒和/或蛋白和/或其片段和/或分离和/或重组多核苷酸能纯化成任何所需纯化程度。发明提供的组合物可以包含病毒、病毒蛋白、其片段和/或多核苷酸、多核苷酸片段和/或其组合，由其组成或主要由其组成。在一个实施方式中，方法包括将包括含SEQ ID NO: I序列的多核苷酸或具有与SEQID NO: I序列至少96%相同序列的多核苷酸的组合物给予犬，从而在犬中刺激针对病毒的免疫反应。在一个实施方式中，多核苷酸作为DNA疫苗给予。制作、配制含DNA疫苗的药物组合物和给予含DNA疫苗的组合物的方法为本领域已知。在一个实施方式中，给予犬的多核苷酸在病毒颗粒中出现。病毒颗粒能分离和/或重组。在多个实施方式中，给予犬的病毒包括含某一氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列是病毒颗粒所包括的部分蛋白。由病毒基因组编码的病毒颗粒所含病毒蛋白的预测氨基酸序列包括犬病毒蛋白NS I，非结构蛋白 I (SEQ ID N0:7)，NS2，非结构蛋白 2 (SEQ ID N0:8)，N，核蛋白(SEQ ID N0:9)，P，磷蛋白(SEQ ID NO: 10)，M，基质蛋白(SEQ ID NO: 11)，SH，小疏水蛋白(SEQ ID NO: 12)，G，附着蛋白(SEQ ID N0:13)，F，融合蛋白(SEQ ID NO: 14)，M2，基质蛋白 M2-1 (SEQ ID 勵15)和] 2-2(SEQ ID NO: 16)，L，RNA依赖性RNA聚合酶，其中部分序列已提供(SEQ ID NO: 17)。发明也提供这些蛋白的猫病毒形式。在另一个实施方式中，所述方法包括给予猫组合物，所述组合物包括含SEQ IDN0:2和/或SEQ ID NO:3序列的多核苷酸、或具有与SEQ IDN0:2或3序列至少96%相同序列的多核苷酸，从而在猫中刺激针对病毒的免疫反应。在一个实施方式中，给予猫的多核苷酸在病毒颗粒中出现。所述颗粒能分离和/或重组。在多个实施方式中，给予猫的病毒包括含选自SEQ ID N0:5或SEQ IDN0:6的氨基酸序列的蛋白。在某些实施方式中，本发明包括能针对本文所公开病毒感染提供预防和/或治疗效果的疫苗。所述疫苗能包括活或死(失活)病毒或其片段。死病毒是不能复制的病毒。死疫苗能用任何本领域技术人员熟知的多种技术制备，包括但不限于热灭活和病毒蛋白和/或核酸的修饰，方法包括但不必需限于接触多聚甲醛，福尔马林和紫外光。例如，病毒蛋白能共价修饰，如通过能修饰病毒蛋白的交联剂以防止病毒细胞进入和/或复制所需的一个或多个步骤。认为活病毒包括减毒病毒。减毒病毒是相对于未减毒形式毒力降低的病毒。因此，减毒病毒能复制，但仅相对于同一类型的未减毒病毒变慢，并且因此一般不致病。本领域的技术人员应识别未减毒，减毒和死病毒之间的这些和其他区别，从而能互相区分。减毒病毒能用任何标准技术得到。在一个实施方式中，病毒通过连续传代哺乳动物细胞培养物来减毒。连续传代能通过许多机理引起减毒。支持病毒复制的任何细胞包括但不限于人细胞，能用于以病毒增殖和/或减毒为目的的传代。在多个非限定实施例中，传代的细胞培养物能获自或衍生自犬或猫，例如分别来自家犬或家猫。在一个实施方式中，细胞是初级细胞培养物。在一个实施方式中，细胞包括犬衍生的A-72细胞系，其美国典型培养物保藏中心(ATCC)的产品号是CRL-1542。适合病毒减毒的任何传代数目都能使用。根据本公开的优势，本领域技术人员能决定病毒减毒的传代参数。一般说，可以使用5-150，包括其间所有整数，并优选20-50传代。包括病毒的组合物能作为疫苗用途的药物制品提供。包括病毒的组合物能制备成悬浮液或冻干形式，并能另外包括所述组合物通常使用的药学上可接受载体和/或稀释齐U。适用于发明的载体和稀释剂的一些示例参见Remington:The Science and Practiceof Pharmacy (《雷明登药物的科学和实践》)(2005)第21版，宾西法尼亚州费拉德尔菲亚，Lippincott Williams和Wilkins。载体的特定非限制性示例包括稳定剂，防腐剂和缓冲液。稳定剂的特定非限制性示例包括糖(如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、右旋糖苷、谷氨酸或葡萄糖)，蛋白(如奶粉血清、清蛋白或酪蛋白)或其降解产物。合适缓冲液的特定非限制性示例包括碱金属磷酸盐。合适防腐剂的特定非限制性示例是硫柳汞、硫柳汞和庆大霉素。合适稀释剂的特定非限制性示例包括水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，乙醇和多元醇(如甘油)。本领域技术人员会认识到本文提供疫苗制品能包括有佐剂活性的一种或多种化 合物。合适佐剂包括但不必需限于弗氏不完全佐剂，苏氨酰胞壁酰二肽，氢氧化铝，-磷酸盐或-氧化物，水包油或油包水乳液，基于例如矿物油或植物油如维生素E醋酸酯和皂苷。本发明提供的疫苗能通过任何合适途径给予。在多种实施方式中，疫苗能通过胃肠外、肌肉内或皮下、静脉内或口服给予，包括但不必需限于经鼻给予。本领域技术人员会认识到疫苗的有效剂量能用正常考虑因素确定，例如需要刺激免疫反应的动物类型，大小，年龄，环境，感染风险或阶段。一般说，根据发明的活疫苗能以每只动物IO1-IO6噬斑形成单位(pfu)的剂量给药,例如Iml剂量。灭活疫苗可以包括每个动物IO6-IOuiPfu的抗原等价物。发明的多核苷酸可以修饰成携带一个或多个异源基因，例如不仅针对本文所公开病毒，也对其他相关或不相关病毒和/或其他感染原提供免疫。同样，本文提供的免疫制剂也能包括旨在针对与本文公开病毒不同的感染原刺激免疫反应的免疫原性试剂。因此，发明包括用于不同哺乳动物和针对不同感染原的疫苗组合。疫苗组合能包括含所有或部分本文公开病毒蛋白的融合蛋白，和能含有来自其他蛋白多肽序列的融合蛋白以提供对不同感染原有效的多价疫苗。发明还包括给予其他能提供动物有益效果的组合物，其能在所述感染的传统治疗之前、同时或之后给药。发明也提供检测本文公开病毒的方法。所述方法包括从动物获得生物样品和检测样品中和样品来源的病毒蛋白和/或病毒多核苷酸的存在。任何病毒多核苷酸和蛋白能用于检测有或没有病毒的方法。认为检测SEQ IDN0:1、2或3的反向互补物或DNA等价物与检测多核苷酸相同，所述多核苷酸包括SEQ ID NO: 1、2或3序列或与任何这些序列至少96%相同的序列。检测能用获自需要诊断的哺乳动物的任何合适生物样品进行。生物样品的合适来源包括但不限于血液、粘膜刮片、组织活检或唾液。在一个实施方式中，生物样品包括鼻和/或咽部拭子或气管灌洗液。可以使用本领域熟知的多种技术测试DNA、RNA或蛋白来检测有或没有病毒。在某些实施方式中，通过检测包括全部或部分病毒基因组的多核苷酸，或从全部或部分病毒基因组扩增的多核苷酸来测定病毒的存在。这方面，通过鉴定来自病毒负链、病毒正链或其组合的多核苷酸序列，发明包括测定病毒存在(或缺失)。发明还包括检测病毒负链，病毒正链或其组合的DNA形式。例如，在一个实施方式中，逆转录酶聚合酶链反应能用于生成病毒负链或其部分的DNA拷贝，并且DNA拷贝能用作病毒基因组扩增的模板以获得在杂交双链体中包括正链和负链或其部分的DNA形式的多个双链DNA分子。本领域技术人员应理解有多种扩增技术能增加遗传物质的数量以用于确定病毒是否或曾经在感兴趣生物样品中，并且扩增(没有扩增)的遗传物质能用很多检测多核苷酸序列的熟知技术和试剂分析。因此，发明包括任何和所有从生物样品中获得和分析核酸的方法，从而能确定有或没有病毒多核苷酸，包括但不限于那些涉及通过核酸和/或其他类型探针的杂交，和通过使用任何已知测序技术测定病毒多核苷酸序列来检测多核苷酸的方法。可测定所有或部分序列并用于鉴定病毒多核苷酸。在某些实施方式中，发明提供包括用于核酸杂交和/或扩增的分离病毒多核苷酸和成分的组合物。因此，所述组成物可额外包括DNA聚合酶、逆转录酶、游离核苷三磷酸、盐、缓冲液和其他通常用于杂交和/或扩增核酸的试剂。在一个实施方式中，发明提供分离病毒多核苷酸和/或从病毒多核苷酸扩增的多核苷酸，其中所述病毒多核苷酸和/或从病毒多核苷酸扩增的多核苷酸与一个或多个用于实时核酸扩增技术的扩增引物和检测探针 杂父。发明还提供分离病毒多核苷酸和/或从病毒多核苷酸扩增的多核苷酸，其中所述多核苷酸与阵列中存在的至少一个探针杂交。例如，阵列可以存在于用以检测多种不同多核苷酸存在与缺失的芯片上。所述芯片市售可得并且能定制检测基本上任何多核苷酸的存在与缺失。在多种实施方式中，发明还包括有形介质中固定检测哺乳动物是否已经被本文公开的病毒感染。有形介质能是任何类型的有形介质，例如任何类型数字媒介，包括但不限于能存储于计算机、DVD、CD-R0M或电子邮件的数字化文件。有形介质能提供给医疗服务人员以发展用于已感染哺乳动物的治疗方案。本领域技术人员会认识到根据本发明的优势，能生成多种试剂并用于检测本文公开病毒的诊断方法。例如，多克隆或单克隆抗体能用病毒颗粒或病毒颗粒部分、或分离或重组病毒蛋白或其片段生成。因此，抗体可制备成特异性识别任何病毒蛋白中存在的任何抗原决定簇。在多种实施方式中，抗体识别NS-I、NS-2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2和L病毒蛋白或部分或其组合。期望生成的抗体能区分本发明病毒和其他相关病毒，例如MPV。抗体能用于任何技术，因此能测定生物样品中或来自生物样品的病毒抗原的存在与缺失。所述技术包括但不限于Western印迹、免疫荧光、免疫组织化学和基于珠的ELISA分析或传统蛋白阵列。在一个实施方式中，发明提供在抗体复合物中出现的分离和/或重组病毒或病毒蛋白。以下实施例旨在说明本发明特定实施方式，但不应以任何方式对本发明构成限制。实施例I从混种犬的鼻和咽部拭子获得样品并且用于接种犬A72细胞(美国典型培养物保藏中心，CRL-1542)培养物以分离呼吸道病毒。在对应于接种后约21天的传代培养后期，一些培养物显示细微细胞病性改变。持续传代后，培养物显示细胞变圆的小灶点，随后整个培养物中细胞快速死亡。所述模式主观评定为非特性的ARDC常见相关病毒。获得十三例个体病毒分离物并且在本实施例中描述。用普通犬呼吸道病毒特异性诊断试剂组的检测未能鉴定出已知病毒。用针对其他病毒的附加试剂进一步测试使用人呼吸道合胞病毒的单克隆抗体(Mab)库(抗HRSV，编号VP-R151，美国加利福尼亚州伯林格姆的载体实验室(VectorLaboratories))通过免疫荧光分析(IFA)最终揭示正识别。所述抗体制品通常用于我们实验室中以检测牛RSV (BRSV)。染色模式包括丝状膜结合和自由漂浮病毒颗粒和胞质包含体，这是通常在RSV感染细胞中观察到的模式。根据初始IFA结果，我们试图使用基于人、牛和绵羊RSV序列比对设计的PCR引物从病毒中扩增核衣壳基因(N)片段。这未成功。抗RSV库中单独Mab的存储和其特异性从生产商获得并用于IFA (图I)。用Mab5H5N (M2蛋白特异)染色显示病毒颗粒和包含体。Mab 2G122 (P蛋白特异)主要染色包含体并给出相对一致的膜相关信号。没有获得Mabs 1C3 (N蛋白特异)或5A6 (F蛋白特异)染色。所有四个单独Mab通过IFA识别BRSV。4个Mab中只有2个识别犬病毒不能扩增RSV基因组保守区域这与RSV有关，但不是典型形式。通过使用C0DEH0P算法基于高度保守氨基酸(aa)序列简并PCR引物。定位L (聚合酶)和N基因中的特异性区域。反应产物测序和BLAST分析揭示该病毒与传统称为小鼠肺炎病毒(或肺炎病毒)的鼠肺炎病毒(MPV)密切相关。发现两个L基因PCR产物与MPV有95%-97%相同并且N基因片段有约96%相同。为解决是否新鉴定肺炎病毒限于所测试收容所犬的问题，我们随机筛选犬血清样品并发现27例动物中的6例有特异性识别感染培养物中病毒的抗体。染色模式与Mab观察到的类似(图2)。包含可变量的BRSV中和抗体的牛血清没有染色受犬病毒感染的细胞。本实施例显示从13例有ARDC的狗分离的病毒似乎与MPV密切相关，并且因此我们认为其为犬肺炎病毒(CnPnV)。鼠肺炎病毒是分类在副粘病毒科肺炎病毒亚科肺炎病毒属的仅有三个病毒种之一。人RSV是模式种并与BRSV密切相关，而MPV相关性更远。例如，人和牛RSV的N蛋白核苷序列互相有约94%相同，但对MPV只有60%相同。只有两个完全测序的MPV菌株“株15”和J3666，并且在核苷水平有99. 7%相同。CnPnV与ARDC的关联在一些病例中有致病性，特别当涉及复杂病因时。通过类比，MPV通常已知感染实验室啮齿动物群落并且血清学证据指出感染几个野生啮齿动物种但对自然生态知之甚少。事实上，不清楚啮齿动物是否是唯一 MPV宿主或如果密切相关，病毒可以在其他物种循环。已经报道了与呼吸道症状相关的人感染证据(Pringle CR等，J GenVirol. 1986 ;67:975_82)。本质上，啮齿动物感染可以是亚临床或潜伏。实验室小鼠临床征兆可从无症状变化到发展为有高发病率和死亡率的肺水肿。包括J3666和株15在内的致病株，能产生严重肺炎并在低剂量接种后6-10天死亡。致病性或其缺失可依赖于病毒和小鼠品系。多个细菌和病毒剂能涉及犬呼吸道疾病。因此认为CnPnV是另一个能引起上呼吸道防护机理受损的事件顺序，造成更严重疾病的的试剂。实施例2本实施例所述的材料和方法用于获得其他实施例所述结果。病毒分离
使用湿拭子从有呼吸道疾病征兆的混种狗收集鼻和咽样品，并且在康奈尔大学动物健康诊断中心收到24小时内进行处理。接种前，拭子浸入3ml有厄尔(Earle)盐的极限必需培养基(吉布可(Gibco) 10370,美国加州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen) ),0. 5%牛血清白蛋白，青霉素(200U/ml),链霉素(200μ g/ml)和两性霉素B(Fungizone)(2. 5 μ g/ml)中30分钟并且然后机械搅拌10秒。合并各O. 5ml的等分鼻和咽部拭子提取物的，并用于接种没有其他培养基的半融合A72细胞的单独T25烧瓶(Binn等，1980) (CRL-1542，美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)。使提取物保持单层1-3小时然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。细胞于37oC维持在6ml培养基(Leibovitz L15培养基，10%热灭活胎牛血清(FBS )，200U/ml青霉素，200 μ g/ml链霉素，50 μ g/ml庆大霉素)中，并且每
6-8天进行继代培养。未接种对照A72培养物在分离过程中平行进行。免疫荧光分析
细胞附于载玻片，然后用PBS冲洗并在冷丙酮中固定10分钟。载玻片在空气中干燥并在染色前于-20° C保存。在PBS中稀释的初级和二级抗体用于载玻片并且37° C孵育30分钟。每个孵育中，载玻片用PBS冲洗15分钟。染色用荧光显微镜观察。针对HRSV的Mab库在1:400稀释下用于初始鉴定(VP-R151，美国加利福尼亚州伯林格姆的载体实验室)。以IX浓度提供的小鼠抗PVM (CL-603IFA，马萨诸塞州威尔明顿的查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))在1:20稀释下使用。二抗FITC标记山羊抗小鼠IgG(02-18-06，KPL，美国马里兰州盖瑟斯堡)在1:40 (12. 5 μ g/ml)稀释下使用。RNA 纯化总细胞RNA从A72细胞(74106，美国加州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen))中纯化。从一个显示约50-75%细胞病变效应(CPE)的感染25cm2烧瓶收集细胞并经各柱纯化。包括拭子洗脱液的无细胞上清液和培养基用140 μ I样品纯化(52906，凯杰公司)。纯化的RNA重悬于40 μ I无RNase的水中。PCR起始用于获得基因组片段的简并引物序列是基于肺炎病毒亚科病毒的比对，并用 C0DEH0P 算法设计(blocks, fhcrc. org/codehop. html) (Rose 等，1998)。逆转录 PCR(RT-PCR)根据生产商说明以25 μ I体积用一步反应(210212，凯杰公司)完成。每一个反应使用1:5-1:10稀释的Iyl总RNA和10皮摩尔的各引物。RT步骤的反应条件是在50° C 30分钟，然后95° C 15分钟。循环条件是95° C 60秒，54-56° C 30秒，和72。C 60-90 秒，共 35 个循环。N 基因的引物组N276F, tccgtgcaggccgaratggarcarg/PlR, (SEQ ID NO:35) ggaactcgggggcgaayttytccat ；SEQ ID NO:36) ;L 基因号 I :L428F，ccggatcttcggccayccnatggt/SEQ ID NO:37) L538R, ttcttaggaggggagatggcyttrtcrtt ；SEQ ID NO:38)L 基因号 2 :L698F, catcaccgacctgtccaagttyaaycargc/SEQ ID NO:39)L894R, ttgaagtcgtccaggatggtrttdatcca SEQ ID NO:40。两个用于来自多个地理位置的拭子样品的PCR引物组基于CnPnV，MPV J3666和菌株15序列比对而设计。G蛋白G715F, ggcttctgtttcttcctttctgg/SEQ ID NO: 41 )G1062R, ccgtggtggtgcctgtgSEQ ID NO:42) ；SH1 蛋白SH1F, atggatcctaacatgacctcayacSEQ ID NO:43) /SH187R,gattgggatgaacygtgcattg SEQ ID N0:44)。用于扩增低传代 Brne 分离物的引物G84F,tgtaaaagtgaaccaaatgtgta SEQ ID NO:45) /G404R, aaatcttcaggtaaatcaggtc SEQ IDNO:46) ；G849F, ttttaacaacaagaatcagtc SEQ ID NO:47) /G1048R, ctcctaggtgcgggggttggSEQ IDN0:48)。用于G和SH扩增子的反应条件是RT在50° C 30分钟，灭活/变性在95° C15分钟，和PCR在95° C 60秒，54° C 30秒和72° C 90秒，共35个循环。基因组分析PCR产物用康奈尔大学测序和基因型核心实验室的应用生物系统自动3730DNA分析仪测序。用于检测完全序列的引物是基于MPV序列或前面测定的CnPnV序列。生成重叠PCR产物以覆盖间隙和引物结合区域。所有区域在2条链上测序。CnPnV分离物与MPV株15 (GenBank AY729016)和 J3666 (GenBank NC006579)的序列使用 Lasergene (DNASTAR,美国威斯康星州麦迪逊)作比较。实施例3 分离和鉴定采用鼻和咽部拭子洗脱液接种A72细胞。相对长时间培养后，通常在第三或第四传代后观察到有限CPE。起始CPE通常包括细胞变圆的散布小灶点，有时有小合胞体和形成空泡。静置培养的所述CPE在几天内进展缓慢。继代培养常导致维持此低级CPE的单层，但是一些培养物在24-48小时内有快速进展和单层的分解。尽管与一些疱疹病毒感染相似，所述模式不测试犬疱疹病毒阳性，并不显示通常使用相似过程分离的任何犬呼吸道病毒典型特征。一些早期传代分离物在培养中复制较差，显示新鲜细胞上清液转移后CPE很少或没有。然而，一些持续传代的培养物发展出更一致的转移CPE，并且选择它们用于进一步分析。起始测试显示来自几只不相关狗的血清似乎在CPE培养中识别病毒抗原(数据未显示)，但是普通犬呼吸道病毒测试为阴性。如实施例I所报道，对HRSV特异的Mab有效识别病毒抗原。有抗PVM多克隆血清的正IFA染色用于确证。抗PVM小鼠血清通过IFA中仅微弱结合BRSV。实施例I所述CnPnV的最初13种分离物源自由相同组织管理的2个动物收容所。为检测是否病毒限于所述两个地点，来自其他地理位置的病狗的鼻或咽部拭子样品用PCR测试。美国8个州(C0、GA、FL、IN、M0、NV、SC、VA)的19只狗用G和SH基因的引物组测试。19例样品中，一例来自内华达州，和5例来自南卡罗来纳州的9只狗的组，对G和SH PCR都是阳性并且通过测序证实。没有从其他13例狗中获得PCR阳性结果。对其他6例进行犬呼吸道诊断的来自纽约州和宾夕法尼亚州的鼻拭子样品尝试A72细胞的病毒分离。其中，两例额外分离物来自纽约市兽医院且另一个来自从宾西法尼亚州费城收容所。用抗RSV和抗PVM抗体通过IFA和随后RT-PCR证实所述分离物为CnPnV。尽管所述RT-PCR和病毒分离结果不提供流行性的精确评价，它们确实表明CnPnV感染广泛。序列分析前面研究已经注意到病毒分离物间的差异可归因于存在自然准种，传代培养中的突变或PCR人造产物。为测定CnPnV分离物的最精确共有序列，使用将总细胞RNA用作模板的多个重叠RT-PCR反应。测序两只狗的病毒分离物，一个在组织传代4 (Ane4)且一个在组织传代 17 (Brnel7),并且与序列 J3666 (Thorpe 和 Easton, 2005)和株 15 (Krempl 等，2005)作比较。8598nt序列(SEQ ID NO: I)从CnPnV_Ane4获得，从毗邻NSl的3’前导区开始并延伸到L编码区域的短距离，完全覆盖10个基因组预测基因中的九个。证实基因顺序NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L。此CnPnV_Ane4区域相较MPV株的全部nt序列相同性是J366695. 0%和株1594. 7%。MPV株互相是99. 7%相同性。在CnPnV_Ane4和MPV株比较中没有发现编码区内的间隙。除了部分3. 4和3. 5所述的G和SH的长度不同外，发现所有MPV和CnPnV-Ane4编码区域编码同一长度的蛋白。非翻译区的比较分析CnPnV中GS和GE序列边界通过J3666和株15序列比对来确定(Thorpe, L. C.,Easton, A. J.，2005. J. Gen. Virol. 86,159-169 ；KrempI 等，2005. Virus Genes30, 237-249)。MPV的GS序列由Chambers等(1991)描述，并且最近(Dibben和Easton, 2007)描述为9nt长度，基于由Collins等(1986)测定的RSV GS序列。Kuo等(1997)提供第IOnt还在RSV的GS中重要并且其IOnt的长度与MPV GS相等的证据(Krempl等，2005)。表I中，GS表示为IOnt以包括两种解释。表I提供CnPnV-Ane4相较MPV株15和J3666的编码区域间的GS ,GE和IGR序列。表I
......^Cl..............................................................IGRGS...............................................................涵...5，............................^NTR.....函
aggacaagug NS I
N SI uagimaamiaaaa caaagggu aggacaaauc* N S2没{\ I x:別
NS2 IiaguiiIiiigaaia mm*aggaiiaaana N没 )%觀
Nuauuiiaairaaaaa cuggaiiaiigi* aggauaatia PK I m
(+l|a])
Puaguiitauuaata mmc (-3[acal) aggacaaaiii MPJ 3 nt
Muagu猶咖獅a c (-l|u[)aggauaagua* SH没{j'|<YA
SHUcigmiaacaaaaa unaggiiuaagua G没 ff|< 別
a
Giiaginiaatigaaaa iiaagcuaiigaua aggacaaaua
a (-t-1 [aj)uaau*("l|c|)
Fuagutiaeuuaaaa Ciiubaggauaagugb M2K I m
im (+l[aj)
M2 uaguiiauauaais uaaucaauu* aggaucaaua L%j 2 nt
a (部φ表I中，两个MPV株的NTR长度没有区别。RNA序列是5’ -3’方向。* :指示从J3666和株15的至少Int改变。nt差异采用粗体和下划线。GE :基因末端；IGR :基因间区域；GS:基因起点；没有区别；长度没有区别。3对M-SH总体NTR长度没有区别；一个u从IGR删除和另一个u在NTR上游加入。b3核苷酸IGR和看似M2GS是基于Dibben和 Easton (Dibben，0.，Easton，A. J.，2007. Mutational Analysis of the Gene StartSequences of Pneumonia Virus of Mice (《小鼠肺炎病毒基因起始序列的突变分析》).Virus Res. 130，303-309)分析。表I所示有10个或更多核苷酸的序列具有以下SEQ ID:对于“GE，，列序列NS1 uaguuaauuaaaa (SEQ ID NO: 18) ；NS2 uaguuauagaaaaa (SEQ IDNO:19) ；N uauuuaauuaaaaa (SEQ ID NO:20) ；P (SEQ ID NO:18) ；M uaguuaaauaaaa (SEQID NO:21) ；SH uaguuaacaaaaaa (SEQ ID NO:22) ；G uaguuaaugaaaaa (SEQ ID NO:23) ；Fuaguuaauuaaaaaa (SEQ ID NO:33);和 M2uaguuauauaaaaa (SEQ ID N0:34)。对于“IGR，，列序列N cuggaaaauau (SEQ ID N0:24);和 G uaagcuaugauauaau (SEQ ID NO:25);对于“GS，，列序列；NS1 aggacaagug (SEQID NO: 26 ；NS2 aggacaaauc (SEQ ID NO: 27) ；N aggauaaaua(SEQ ID NO:28)；P (SEQ ID NO:28)；M aggacaaaua (SEQ ID NO:29);SH aggauaagua (SEQIDNO:30) ；G (SEQ ID NO::30) ；M2 aggauaagug (SEQ ID N0:31)；F (SEQID N0:29)和 Laggaucaaua SEQ ID NO:32)。在CnPnV-Ane4NTR中鉴定了一些长度变化和nt差异，主要在IGR中发现。IGR内的两个MPV 株没有不同。Chambers 等(Chambers,P. ,Matthews,D. A. ,Pringle,C. R. ,Easton,A. J.，1991. Virus Res. 18，263-270)从 cDNA 克隆中测定 M2 的 GS,也注意到 56nt IGR 中存在2个额外潜在GS序列(GSl和GS2)。稍后的突变分析测定由于位点6的G取代A，推定的GS序列没有功能。随后，他们测定GSl和GS2序列能在最重要的弟一序列(GSl)中指导转录起始。他们的结论是最初鉴定的GS序列可能由于cDNA克隆中的自发缺失而错鉴定。CnPnV中，立即跟随F GE序列的M2GS I序列与SH和G基因起始序列相同，除了第10nt。认为主要使用 GSl 并示于表 I。M2 的 GS2，AGGACAGGG，与(Dibben，O. , Easton, A. J. ,2007.Virus Res. 130，303-309)报道的共有序列仅差异2个位置，但可有有限活性，因为其在位点7没有保守性A。这不同于J3666和株15，其中A是保守的。CnPnV_Ane4中的第三潜在M2GS (GS3)与J3666和株15相同，并且因此假定由于位点6的G而功能较差。非结构蛋白的分析非结构小疏水蛋白看来耐受显著变化，因为其是两个MPV株之间分歧最大的蛋白，其中它们共有的92aa中只有92. 4%aa相同。CnPnV_Ane4中，相较MPV株15，SH蛋白在所有检测蛋白中分歧最大。CnPnV-Ane4SH与J3666差异4aa (95. 7%)，和与株15差异9aa(90. 2%)，并且因此与J3666比MPV株之间更相似(表2)。另一显著差异是不同分离物的SHORF长度。CnPnV-Ane4和株15 二者都有279nt (92aa)的SH 0RF,而发表的J3666SH序列是345nt(114aa)。然而，已经报道了 J3666的单独扩增序列不同地编码92、96或114aa并且表明这些所示抗体逃避突变。表2提供对肺炎病毒亚科病毒的CnPnV-Ane4基因和蛋白的相同性百分比的总结。表 权利要求
1.一种包括与SEQ ID NO: 1，2或3序列至少96%相同的分离多核苷酸的组合物。
2.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述多核苷酸是与SEQIDN0:1序列至少96%相同的多核苷酸。
3.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述多核苷酸是与SEQIDN0:2序列至少96%相同的多核苷酸。
4.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述多核苷酸是与SEQIDN0:3序列至少96%相同的多核苷酸。
5.一种包括与SEQ ID NO: 1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸的分离病毒。
6.如权利要求5所述的分离病毒，其特征在于，所述分离病毒已经减毒。
7.如权利要求5所述的分离病毒，其特征在于，所述分离病毒包括与SEQID N0:1序列至少96%相同的多核苷酸。
8.如权利要求6所述的分离病毒，其特征在于，所述分离病毒包括与SEQID N0:2序列至少96%相同的多核苷酸。
9.如权利要求7所述的分离病毒，其特征在于，所述分离病毒包括与SEQID N0:3序列至少96%相同的多核苷酸。
10.一种含有病毒的分离细胞或体外细胞培养物，所述病毒包括与SEQ ID ΝΟ:1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸的。
11.一种在哺乳动物中刺激免疫反应的方法，所述方法包括给予哺乳动物含有权利要求5所述分离病毒、或所述分离病毒所含蛋白的片段的组合物，其中免疫反应在给药后于动物中被刺激。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，权利要求5所述的分离病毒包括与SEQIDNO: I序列至少96%相同的多核苷酸，并且其中将所述组合物给予犬。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，权利要求5所述的分离病毒包括与SEQIDNO: 2或SEQ ID NO: 3序列至少96%相同的多核苷酸，并且其中将所述组合物给予猫。
14.一种检测哺乳动物是否被肺炎病毒感染的方法，所述方法包括从哺乳动物中获得生物样品和检测与SEQ ID ΝΟ:1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸，或通过检测由SEQID NO: 1，2或3反向互补物所编码蛋白的存在来检测与SEQ ID NO: 1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸，其中，多核苷酸或蛋白的存在指示哺乳动物被肺炎病毒感染。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是犬或猫。
全文摘要
本发明提供新鉴定的能感染哺乳动物的肺炎病毒，所述哺乳动物包括狗、猫和可能的人。提供分离的病毒多核苷酸和蛋白，和分离的病毒本身。发明包括检测病毒的组合物和方法，和预防和/或治疗与病毒出现正相关的疾病征兆的方法和组合物，和包括病毒的分离细胞。也提供完整病毒颗粒，病毒蛋白和其片段。
文档编号C12N15/45GK102884193SQ201080064234
公开日2013年1月16日 申请日期2010年12月21日 优先权日2009年12月21日
发明者E·杜博维, R·W·瑞沙 申请人:康奈尔大学