细胞培养方法以及使用该方法的自动培养装置的制作方法

专利名称：细胞培养方法以及使用该方法的自动培养装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养方法以及实行该方法的细胞培养装置，特别是涉 及不使杂菌等混入(污染)人体的培养细胞而可以得到大量的培养细胞的 细胞培养方法以及自动细胞培养装置。
背景技术：
近年来，大量报道了有关使人体已损伤的组织或功能已降低的脏器等 再生的再生医疗的研究。在再生医疗中，需要大量构成人体组织或脏器的 细胞，再生医疗所需要的细胞可以使用人工培养的培养细胞。
作为以往的与细胞培养有关的装置，有如同专利文献1所公开的那样 可以对培养室内的温度、气体浓度等气氛进行控制的培养装置、和如同专
利文献2所公开的除了控制培养室内的气氛之外还可以控制培养组织向 培养容器的投入、培养药剂的给排、进而可以控制培养室内的气氛的自动 培养装置。
专利文献1:日本专利第3021789号公报 专利文献2:国际公开WO2005/059091号公报
在上述以往的培养装置的前者，培养器内培养基的更换、为了得到大 量的培养细胞而调节细胞密度的传代培养等作业都是通过研究者等的手 工作业进行的。在是该装置的情况下，例如对于培养基更换或传代等作业， 在作业者打开装置的门之后，在注意不要使菌混入到培养器内的同时，拿 起培养皿等培养器的盖，使用已灭菌的吸移管，非常注意地进行。另外， 在重复传代培养的情况下，需要多次进行将增殖的培养细胞移植至多个培 养器中的作业，所以即便是熟练者，也有可能引起污染。
另一方面，就上述以往的培养装置中的后者即自动培养装置而言，如 前所述，也可以控制细胞的投入、培养药剂的给排，进而还可以控制培养室内的气氛。但是，采用的方式是取出在培养装置内培养的细胞并在已注 入到容器内的状态下自动运送至装置外，认为在取出培养细胞时的污染方 面还存在应该解决的问题。
另外，在想要将人体的组织或脏器再生的情况下，需要大量的培养细 胞，但为了得到大量的培养细胞，需要将培养器大型化，需要增加从人体 取出的细胞的量。但是，如果将培养器大型化，则产生培养装置当然也大 型化、设置空间增大的问题。另外，如果增加从人体取出的细胞的量，产 生对人体造成很大损伤的问题。
其中，作为与使草履虫之类的实验用细胞大量增殖的传代培养技术有 关的文献，有专利文献3。关于在该专利文献3中记载的技术，对于在填 充有培养基的培养容器内培养的培养细胞，提供新的培养基，对以前的培 养基和培养细胞的一部分进行冲洗，稀释培养器内的培养细胞。但是，本
技术是培养基冲洗后的细胞直接被供于测量，不适合大量获得供于人体再 生医疗的纯细胞。
专利文献3:日本特开2004—208663号公报

发明内容
本发明的目的在于，对应上述问题，提供能够获得大量在人体的再生 医疗中使用的培养细胞的细胞培养方法以及自动细胞培养装置。
为了解决上述课题，本发明的培养方法包括 (1)将从人体取得的细胞和培养基注入到培养容器内的步骤；(2) 进行放入有培养基和上述细胞的上述培养容器内的换气和培养基的更换， 并同时进行细胞培养的步骤；G)在对于上述培养容器内培养的培养细胞 进行了清洗之后，将上述已清洗的细胞残留其一部分后将其从上述培养容 器内回收到细胞回收容器的步骤；(4)对于在上述步骤(3)中残留在上 述培养容器内的培养细胞，注入培养基的步骤；和(5)反复实行上述步 骤(2)和步骤(4)的步骤。
另外，为了解决上述问题，本发明的自动培养装置具有试剂供给单 元，其分开收纳培养所必需的多种试剂；培养单元，其收纳细胞培养容器; 回收单元，其回收在上述培养容器内培养的培养细胞；给排单元，其进行 向上述培养容器的细胞供给、试剂从上述试剂供给单元向上述培养容器的 供给、和培养细胞从上述培养容器向上述回收单元的排出；控制单元，其 对向上述培养容器的试剂供给动作、上述培养容器内的细胞培养动作、和 培养细胞从上述培养容器的排出动作进行控制，具有对回收培养细胞时残 留在上述培养容器内的培养细胞进行包括基于上述给排单元的试剂供给 工序的细胞培养工序、和培养细胞的排出工序至少一次的机构。
通过本发明，可以得到大量在人体的再生医疗中使用的培养细胞。


图1是表示本发明的自动培养装置的单元构成的方框图。
图2是表示本发明的第一实施方式的自动培养装置的大致构成的方框图。
图3是本发明的第一实施方式的培养容器的立体图。 图4是图3所示的培养容器的详细侧视图。 图5是表示培养容器的喷嘴配管部的剖视图。 图6是本发明的培养方法的流程图。
图7是表示本发明的第二实施方式的自动培养装置的大致构成的方 框图。
具体实施例方式
(第一实施方式)
以下，参照

本发明，首先最先说明用实行本发明的细胞培养 方法的自动培养装置的第一实施方式。
图1是表示本发明的自动培养装置的简要构成的方框图。在图1中， 200是分开收纳人体细胞的细胞培养所必需的多种试剂的试剂供给单元， 其内部构成为可以将温度保持成低于常温的规定温度范围以便所收纳的 试剂不会劣化。300是培养单元，在内部收纳有培养容器。400是回收单 元，是对培养单元内培养的细胞或使用完的试剂进行回收的单元。500是 在试剂供给单元200和培养单元300和回收单元之间使试剂或细胞供给、 排出的给排单元。600是环境保护单元，是对从试剂供给单元200向培养 器供给的试剂的温度或培养单元300内的温度、二氧化碳气体(C02)浓 度进行控制的单元。700是用于观察在培养单元300内收纳的培养器内的 细胞培养状态的观察单元，具有显微镜、显微镜的移动装置、或照射培养 容器内的照明器具。800是对上述回收单元400、给排单元500、环境保 护单元600、观察单元700进行控制的中央运算处理单元(CPU)。 900是 具有输入对自动培养装置的操作指令的操作器、或显示由上述观察单元 700得到的图像的监视器等的操作单元。
接着，参照附图2对上述单元进行详细说明。
试剂供给单元200具有具有可以开闭的盖的收纳盒(省略图示)、 和在该收纳盒的内部通过支承构件配置在规定位置的多个(在图示例中为 3个)的试剂收容用的试剂袋5、 7、 9。对于收纳盒，为了放置放入到试 剂袋5、 7、 9内的试剂的劣化，具有用于将试剂袋的收容空间与外部阻断 且将收容试剂袋的空间维持在规定温度的绝热材料。试剂袋5、 7、 9优选 使用由具有可以折叠的柔性并对细胞不具有毒性的材料形成的输液袋。具 体而言，例如优选使用氯乙烯制、或硅橡胶制的袋。其中，在试剂袋5、 7、 9中各自分开收容有培养所必需的试剂，在该例中为清洗液、剥离剂、 培养基。其中，在试剂袋7中收容的剥离剂是在以具有粘附性细胞为培养 对象时所必需的试剂，在培养对象是具有游离性的细胞的情况下，不需要 剥离剂。
培养单元300具有作为恒温槽的培养箱3、和在培养箱3内收纳的培 养容器l。培养箱3与试剂供给单元200—样具有可以开闭的盖，可以通 过关闭盖来密闭内部。此外，培养箱3在面对培养容器1的底面具有由透 明材料形成的观察窗，可以从培养箱3的外部观察到培养容器1。另外， 培养箱3通过后述的加热器进行恒温控制以使内部具有规定温度。为此， 为了提高加热器的加热效率，除了上述观察窗的周围优选用绝热材料覆 盖。培养容器1是对从人体取出的细胞进行培养的设备，是使用对细胞没 有毒性的材料且具有透光性的材料例如聚苯乙烯或聚对苯二甲酸乙二醇 酯进行成形得到的设备。另外，培养容器1是将容器的内部相对于外部空 间维持成密闭状态，以使插入到内部的细胞或所培养的细胞不会与杂菌污
染。为此，安装在培养容器l的管类的容器安装部中实施了密封。
回收单元400具有对在培养容器1内培养的培养细胞进行回收的多
个(在本例中为3个)细胞回收袋11、 13、 15，对以使用完的试剂进行 回收的废液容器65，对细胞回收袋ll、 13、 15的管状注入部进行热密封 的公知的热密封装置66。细胞回收袋ll、 13、 15与试剂袋5、 7、 9一样， 优选使用由具有可以折叠的柔软性且对细胞没有毒性的材料形成的输液 袋。具体而言，例如优选使用氯乙烯制、或硅橡胶制的袋。此外，各细胞 回收袋11、 13、 15的大小优选其收纳量为能够收纳一次培养中在培养容 器l内培养的细胞的量。另外，回收单元400所具有的细胞回收袋的数量 在本例中为3个，但优选该数量至少为在培养容器1内连续多次反复对同 一组织细胞仅仅进行培养的数量。
给排单元500具有用于向培养容器l内供给试剂、细胞、空气的供 给泵35，从培养容器1内排出所培养的细胞或已使用完的试剂的排出泵 61，形成试剂袋5、 7、 9和培养容器1之间的流道的送液管23、 25、 27、 29，连接上述送液管29和设置在培养箱3内的后述过滤器37的气体管 38，连接上述送液管29和储液容器43的细胞注入管39，连接设置培养 箱3的内部的过滤器77和培养容器1的内部空间的气体交换管75，和设 置在上述配管系统上的套筒节流阀17、 19、 21、 33、 40。储液容器43中 贮留从活体取出且与培养基等成为悬浮状态的细胞，开口部被具有柔软性 的薄膜45覆盖。成为储液容器43的盖的膜45的设置是为了穿刺进入上 述悬浮状态的细胞的注射器41。因此，膜45优选为了不使杂菌等混入到 储液容器43内而具有将注射器41的穿刺痕密闭那样的柔软性且具有规定 厚度。
进而，给排单元500具有用于排出培养容器l内的培养细胞或已使 用完的试剂的排出泵61，形成培养容器l和细胞回收袋ll、 13、 15以及 废液容器65之间的流道的排出管53、 55、 57、 59，设置在上述排出流道 上的套筒节流阀47、 49、 51、 53。在本实施方式中，套筒节流阀使用能 够压死具有柔软性的管且封闭流道的电磁驱动式开闭阀。另外，供给泵和 排出泵使用将具有柔软性的管巻成排列成圆筒状的多个巻筒并旋转多个 巻筒将管内的流体挤出的所谓变薄泵。
环境保护单元600具有在使试剂从收纳剥离剂以及培养基的试剂袋
19、 21流向培养容器1的送液管29的一部分设置的加热器31，和虽省略 图示但设置在培养箱3的内部的加热器、温度传感器、二氧化碳气体(C02) 传感器等。另外，在培养箱3上连接有C02供给管，该C02供给管与C02 压缩瓶连接。加热器31在向培养容器1供给剥离剂、培养基的过程中进 行加热。此外，设置在培养箱3内的加热器和温度传感器将培养容器1内 的温度维持在规定温度。另外，C02传感器检测出培养箱3的内部的C02 浓度。
观察单元700具有设置在培养箱3的观察窗的外部且用于观察培养 容器1内的细胞培养状态的显微镜39、设置成夹持培养容器1且与显微 镜1对向的照明用的光源(省略图示)、在与培养容器1的底面平行的平 面内二维移动上述显微镜89的显微镜移动装置(省略图示)。显微镜89 包括可以将已拍摄的图像信息作为电信号输出的相机例如CCD相机而构 成。显微镜移动装置交叉配置由发动机和线形运动引导装置的组合构成的 移动装置，通过使各发动机分开或连动，可以使显微镜向任意位置移动。
中央运算处理单元800根据从后述的操作单元900输入的培养条件， 对上述回收单元400、给排单元500、环境保护单元600、观察单元700 进行控制，由CPU构成。CPU800具有ROM，该ROM中储存有对后述 的装置的动作进行控制的软件。
操作单元900具有自动培养装置的动作(培养)条件的输入用操作 器、显示从该操作器输入的动作条件或由上述显微镜89拍摄的图像的监 视器。其中，装入到以上的自动培养装置的泵、阀、发动机、加热器、其 他促动器类，被驱动电路驱动，但省略对它们的说明。
接着，使用图3、图4，对培养器l进行详细说明。
对培养容器1的横截面形状没有特别限定，但关于在本实施方式中成 圆形的培养皿，在其上部开口形成有凸缘。利用该凸缘的平面，盖67通 过熔敷等被粘着，培养容器1被密闭。此外，向培养容器1的侧面插入喷 嘴69、 71、 73，在喷嘴69上连接有送液管29，在喷嘴71上连接有排出 管59，在喷嘴73上连接有气体交换管75。其中，图5是进一步详细表示 喷嘴69和送液管29的连接状态的图。
接着，对上述喷嘴69、 71、 73的前端和培养容器1的底面的位置关 系进行说明。与送液管29连接的喷嘴69的前端位于培养容器1内的液层 (培养时的液面位置)内或空气层内。此外，就与排出管59连接的喷嘴 71的前端而言，由于有必要将培养已完成的细胞的一部分(少量)残留 于培养容器1内以用于下一次的培养，所以被设定于从培养容器1的内部 底面具有规定间隙的位置。另外，与气体交换管75连接喷嘴73的前端， 成为用于进行培养容器1内的气体和培养箱3内的气体的交换的给排口， 所以被设定于比培养器1内的液层高的位置。
接着，将本发明的细胞培养方法与上述的自动培养装置的动作进行关 联说明。其中，在以下的说明中，以培养对象为具有粘附性的细胞的情况 为例进行说明。
(培养开始的准备)
在培养开始之前，操作者将自动培养装置的回收单元400安装细胞回 收袋ll、 13、 15，通过放射X射线或Y射线等对自动培养装置进行灭菌 处理。其中，关于细胞回收袋ll、 13、 15的无菌状态，在袋的制造完了 直至捆包时都可以通过照射放射线来确保。此外，在上述灭菌处理完了之 后，操作者将贮留有清洗液、剥离剂、培养基的试剂袋5、 7、 9安装于试 剂供给单元200。另外，操作者使用注射器41将细胞或培养基等成为悬 浮状态的细胞液注入到储液容器43。当结束这些作业时，操作者投入自 动培养装置的电源，从操作单元900输入培养开始指令。于是，根据图6 的操作流程，CPU800通过控制各单元实行细胞培养。 (步骤l:培养基注入)
当输入培养开始的指令时，CPU800首先执行用于注入培养基的控制。 即，CPU800输出使给排单元500的套筒节流阀21和套筒节流阀33开放 的信号，接着输出使供给泵35动作的信号。由此，在开放送液管27、 29 的流道的同时，驱动供给泵35。当驱动供给泵35时，在试剂袋9中贮留 的培养基通过送液管27、 29内向培养容器1内运送。此时，加热器31根 据CPU800的指令被供给电流，由此培养基在管内被加热。当规定量的培 养基被运送向培养容器1时，CPU800在驱动供给泵35的情况下使套筒 节流阀21关闭。于是，培养箱3内的空气借助过滤器37被气体管38、
送液管29吸入。在残留于送液管29内的培养基被用完的时刻，根据 CPU800的指令，供给泵35被暂时停止，另外套筒节流阀33被关闭。在 关闭套筒节流阀21之后，向送液管29送入空气，由此残留在送液管29 内的试剂(培养基)被迅速运送向培养容器l。其结果，防止了由送液管 29的试剂导致的堵塞。
(步骤2:细胞液注入) 当培养基的注入结束时，细胞液的注入控制通过CPU800来进行。细 胞液是事先准备好的，由操作者事先贮留在储液容器43中，当从CPU800 输出使套筒节流阀40开放的指令和使供给泵35驱动的指令时，套筒节流 阀40被开放，供给泵35被驱动。由此细胞液从储液容器43通过送液管 39被注入到培养容器1内。此外，当细胞液的注入结束时，通过来自 CPU800的指令，套筒节流阀40被关闭，供给泵35被停止。 (步骤3:培养开始)
当细胞液的注入结束时，CPU800进行培养箱3的内部的C02的浓度 控制以及培养箱3的内部的温度控制，同时在预先设定的时间内进行细胞 的培养。该预先设定的时间例如为3天左右，但还可以根据细胞的种类、 细胞的增殖速度等进行变更。 (步骤4:空气运送)
在经过了上述设定时间之后，进行培养容器1内的换气。本实施方式 的培养容器1的内部在细胞培养过程中大致处于密闭状态，有必要在适当 的时间内进行培养容器l内的换气。为此，CPU800输出使套筒节流阀33 开放的指令和使供给泵35驱动的指令。当套筒节流阀33开放，供给泵 35被驱动时，借助过滤器37被吸入的培养箱3内的空气借助气体管38、 送液管29被提供给培养容器1内(箭头A方向)，与此同时培养容器1 内的空气借助气体交换管75、过滤器77向培养箱3内(箭头B方向)排 出。在图6的流程图中，空气运送为一次，但只要除外后述的培养基更换 时、细胞回收时，可以为任意次，也可以连续进行。另外，培养容器l内 的空气的交换，可以使从过滤器77向培养容器1内(箭头C方向)供给 培养箱3内的空气，从过滤器37向培养箱3内(箭头D方向)排出培养 容器l内的空气。 (步骤5:培养基更换) 在培养容器l内的换气结束之后，隔开规定时间，进行培养基更换。 关于培养基更换是为了，排出培养容器1内的培养基以便排除在培养基中 洗脱的细胞的代谢物质，向培养容器1内注入新的培养基，由此补充营养
成分，并需要定期进行。通常，图6的自步骤3 (S3)至步骤5 (S5)的 动作要隔开3天 7天实施，该时间是预先设定的，或者可以根据细胞的 增殖状态任意变更。为了排出培养基，从CPU800输出使套筒节流阀63 开放的指令，同时输出驱动排出泵61的指令。由此，套筒节流阀63被开 放，排出泵61被驱动，借助排出管59、 58从培养容器1内将含有细胞的 代谢物质的培养基向废液容器65排出。此外，培养基从培养容器1排出 时，套筒节流阀63被关闭，排出泵61被停止。
当培养基的培养基完了时，从试剂袋9向培养容器1供给新的培养基。 为了进行培养基的供给，CPU800输出使套筒节流阀21、 33开放的指令， 同时输出使供给泵35驱动的指令。由此，借助送液管27、 29运送试剂袋 9内的培养基，通过加热器31进行加热，向培养容器1的内部注入规定 量。当进行该培养基更换时，CPU800进行是否为预先设定的培养基更换 次数的判定。此外，在培养基更换未达到设定次数的情况下，返回至步骤 4 (S4)，反复进行步骤5 (S5)的空气运送、步骤6 (S6)的培养基更换。 (步骤7:空气运送)
此外，在培养基更换达到了规定次数的情况下，上述步骤7 (S4)的 最后的空气运送与步骤4 (S4)同样进行。其中，在自步骤3 (S3)至步 骤7 (S7)之间的细胞的培养期间内，利用CPU800持续进行培养箱3内 的C02浓度管理、温度管理。另外，在培养期间内，由操作者适当操作观 察单元700，由此对培养容器l内的培养状态进行拍摄，在监视器显示所 拍摄的图像。操作者通过观察在监视器显示的图像，确认培养的进展状态。 (步骤8:细胞的回收次数的判定)
当步骤7 (S7)的空气输送在规定时间内、例如数天内进行时，进行 培养细胞的回收步骤。在培养细胞的回收步骤中，首先，进行针对自此进 行的细胞回收的设定次数的判定。在本实施方式中，对装置进行设定以便 三次回收细胞。此外，在该步骤8 (S8)中，如果判定培养细胞的回收为
三次，则下一道工序进行至步骤13 (S13)的最终的细胞回收工序。另外， 如果培养细胞的回收为一次或两次，则下一道工序进行至步骤9 (S9)。
(步骤9:细胞的回收次数的判定)
在步骤8 (S8)中，进行细胞回收是否为两次的判定。此外，当其判 定结果不是两次而是一次时，下一道工序进行至步骤IO (S10)的细胞回 收工序，另外，当其判定结果为两次时，下一道工序进行至步骤ll (S11) 的细胞回收工序。
(步骤10:第一次的细胞回收)
当判定细胞回收为第一次时，进行培养容器1内的培养基的排出工
序、在试剂袋5内贮留的清洗液的注入工序、和随之其后的排出工序，进 行培养细胞的清洗。随后，实行将在试剂袋7内贮留的剥离剂注入到培养 容器1内的工序。当剥离剂被注入到培养容器1内并经过规定时间时，培 养细胞从培养容器1被剥离。接着，与判定细胞回收为第一次的结果相对 应，实行向从培养容器1的底面剥离的培养细胞向细胞回收袋11的回收 工序。
为此，为了排出培养基，CPU800首先与在步骤5 (S5)中描述的培 养基排出一样，输入使套筒节流阀63开放的指令和使排出泵61驱动的指 令。由此，排出培养容器1内的培养基。如果培养基的排出结束，通过 CPU800的指令，套筒节流阀63被关闭，排出泵61被停止。接着，为了 向培养容器1内注入清洗液，CPU800输出使套筒节流阀17、 33开放的 指令，同时输出使供给泵35驱动的指令。由此，套筒节流阀17、 33被开 放，另外，供给泵35被驱动，在试剂袋5中贮留的清洗液被注入到培养 容器l内。当向培养容器l内注入必要量的清洗液时，供给泵35被停止， 套筒节流阀17、 33被关闭。在通过清洗液对培养细胞的清洗结束之后， 与在步骤5中描述的培养基排出一样向废液容器65中运送清洗液。此外， 从将清洗液从培养容器1排出时，为了向培养容器1内注入剥离剂， CPU800输出使套筒节流阀19、 33开放的指令、和使供给泵35驱动的指 令。由此，筒节流阀19、 33被开放，供给泵35被驱动，在试剂袋7中贮 留的剥离剂被注入到培养容器1内。当剥离剂的注入结束时，供给泵35 被停止，套筒节流阀19、 33被关闭。此外，经过短时间后，剥离剂使附
着在培养容器1的底面的培养细胞浮起。在培养细胞从培养容器1的底面
被剥离的时刻，CPU800向培养容器1内注入培养基。在这里，培养基的 注入是为了削弱对细胞造成不良影响的剥离剂的作用而进行的。为此， CPU800输出使套筒节流阀21、33开放的指令和使供给泵35驱动的指令。 由此，套筒节流阀21、 33被开放，供给泵35被驱动，培养基从试剂袋9 被注入到培养容器l内。当培养基的注入结束时，供给泵35被停止，套 筒节流阀21、 33被关闭。
当为了削弱剥离剂的作用而注入培养基时，减少了剥离剂对培养细胞 的不良影响，相反，培养细胞再次变得容易附着于培养容器l上，所以有 必要迅速地进行培养细胞的回收。为此，CPU800在培养基的注入之后迅 速输出使套筒节流阀开放的指令(在这里是第一次的回收，所以套筒节流 阀47被开放)和使排出泵61驱动的指令。由此，培养容器l内的培养细 胞通过排出管59、 53被细胞回收袋11回收。如果培养细胞未被吸入到排 出管59、 53， CPU800使套筒节流阀47关闭，另外使排出泵61停止。然 后，从CPU800向热密封装置66输出热压接细胞回收袋11的管部分的指 令。由此，细胞回收袋ll的管部分被热密封。随后，细胞回收袋ll被操 作者从装置断开。从装置断开的培养细胞放置袋由保冷库保管。
在这里，在安装于培养容器1的喷嘴71的前端和培养容器1的底面 之间设置有规定的空隙，所以培养细胞的一部分未被回收而直接残留于培 养容器1内。本发明的宗旨是通过对残留于或不得不残留于该培养容器1 内的培养细胞进行反复培养，会得到大量的培养细胞。 (第二次的细胞培养)
为此，当步骤10 (S10)的第一次的细胞回收结束时，CPU800对在 培养容器l内残留的细胞再次执行步骤3 (S3)至步骤9 (S9)。由此，对 在培养容器l内残留的细胞进行培养。CPU800通过步骤8 (S8)、步骤9 (S9)判定此次的细胞回收为第几次。在这里，判定结果为第二次。 (步骤ll:第二次的细胞回收)
当在步骤9 (S9)中判定细胞回收为第二次时，在步骤ll (S11)中， 以与步骤IO (S10)中的细胞回收相同的顺序进行第二次的细胞回收。不 过，在该步骤ll (S11)的第二次细胞回收中，对应于步骤9 (S9)的判
定结果，根据CPU800的指令，从培养容器1排出的细胞被细胞回收袋 13回收，热密封装置66在对细胞回收袋13的管部分进行热压接这一点 上与步骤10 (S10)相同。 (第三次的细胞培养)
当步骤11 (S11)的第二次的细胞回收结束时，CPU800对残留在培 养容器l内的细胞再次反复实行步骤3 (S3)到步骤9 (S9)。由此，对残 留在培养容器1内的细胞进行培养。CPU800通过步骤8 (S8 )、步骤9 ( S9) 判定此次的细胞回收为第几次。在这里，判定结果为第三次。 (步骤12:第三次的细胞回收)
当在步骤9 (S9)中判定细胞回收为第三次时，在步骤12 (S12)中， 以与步骤IO (S10)中的细胞回收相同的顺序进行第三次的细胞回收。不 过，在该步骤12 (S12)的第三次细胞回收中，对应于步骤9 (S9)的判 定结果，根据CPU800的指令，从培养容器1排出的细胞被细胞回收袋 15回收，热密封装置62在对细胞回收袋15的管部分进行热压接这一点 上与步骤10 (S10)相同。
当第三次的培养细胞的回收结束时，收容有所回收的培养细胞的细胞 回收袋ll、 13、 15被运至临床，培养细胞被供于人体的组织再生。
如上述说明所示，通过本实施方式，在对培养容器内培养的细胞进行 回收时，其一部分残留于培养容器中，对残留在培养容器中的细胞再次进 行培养，由此可以使细胞大量增殖。此外，在本实施方式中，再次对残留 于培养容器中的细胞进行培养，所以可以使用小尺寸的培养容器。将其与 如以往的传代培养那样把用培养容器培养了一次的培养细胞转移至其他 多个培养容器继续培养的情况下进行比较，实现了装置的小型化。进而， 通过本实施方式，从活体取出组织细胞一次即可，所以可以减小对活体的 损伤。
另外，通过本实施方式，从活体取出的细胞通过注射器被注入带有过 滤器的储液容器，所以可以防止在向培养容器中收容细胞时细胞和杂菌的 污染。进而，通过本实施方式，培养细胞被自动回收至细胞回收袋，同时 细胞回收袋被热密封，阻断细胞回收袋与外部环境，然后取出，所以可以 防止在细胞回收时的细胞和杂菌的污染。
进而，通过本实施方式，在将试剂向培养容器内供给时，培养容器内 的空气，从与培养箱内相通的喷嘴赶走与所供给的试剂的量相对应的培养 容器内的空气，所以可以顺利地将试剂注入到培养容器内。另外，同样地， 在排出培养容器内的试剂等液体时，从与培养箱内相通的喷嘴，与排出的 试剂或含有细胞的液体的排出量相对应，向培养容器内供给空气，所以可 以顺利地进行培养容器内的液体的去除。
另外，通过本实施方式，空气向培养容器的给排是借助过滤器进行的， 所以可以提供干净的培养环境并维持。
在本实施方式中，是以反复进行细胞培养和回收共计三次为例进行说 明的，但^:发明并不限于此。细胞培养和回收的反复次数只要根据所需的 细胞的量至少为2次以上，就可以任意设定。此时，与回收培养细胞的次
数相对应，可以对设置在回收单元上的细胞回收袋的数量和套筒节流阀的 数量进行变更。其中，只要可以设置防止细胞回收时细胞和杂菌的污染的 装置，就没有必要向自动培养装置中预先装填多个细胞回收袋，必要时可 以采用向自动培养装置装填细胞回收袋的方法。
另外，在本实施方式中，如图5所示，在培养容器的侧面设置有喷嘴 69、 71、 73，所以也可以对应于将多个培养容器重叠配置于培养箱内的变 形例。
进而，本实施方式的培养装置可以大致持续的进行细胞的培养，另外， 可以以规定时间间隔回收细胞。因此，在分多次对患者的脏器或组织等进 行再生治疗的情况下，例如在进行辅助利用间质系干细胞的白血病治疗等 的情况下，可以以规定间隔数次供给间质系干细胞。
如上述实施方式所示，分别借助套筒节流阀47、 49、 51、 63将细胞 回收袋ll、 13、 15和废液容器65连接于一台排出泵61的喷出管路上， 此时有可能出现废液或回收细胞残留于管路的情况。当这些废液或死亡细 胞、进而是细胞的代谢物质残留于回收系管路时，在反复进行的下一次培 养细胞回收时会发生污染。有必要防止这样的污染的发生。 (第二实施方式)
图7表示可以防止这样的污染的发生的第二实施方式的自动培养装 置。如图7所示，本实施方式的自动培养装置与上述第一实施方式相比，
其不同点在于，用设置有与细胞回收袋ll、 13、 15和废液容器65的数量 (共计4个)相对应的喷嘴101、 103、 105、 107，来代替设置在第一实 施方式的培养容器1上的排出系统的喷嘴71。即，喷嘴IOI、 103、 105、 107分别与排出管119、 121、 123、 125连接。这些排出管119、 121、 123 分别与细胞回收袋ll、 13、 15连接，排出管125与废液容器65连接。此 外，在这些排出管119、 121、 123、 125的中间，分别如图所示连接有套 筒节流阀47、 49、 51、 63以及排出泵111、 113、 115、 117。其中，附图 中套筒节流阀47、 49、 51、 63分别安装在排出泵的吸引侧，但它们也可 以安装在排出泵的喷出侧。其中，即便在本实施方式中，排出泵lll、 113、 115、 117以及套筒节流阀47、 49、 51、 63都根据CPU800的指令完成动 作。
如上所述构成的本发明的自动培养装置，与第一实施方式的自动培养 装置相比，排出培养容器l内的液体时的动作不同。即，在排出培养容器 1内的废液时，套筒节流阀63被开放，排出泵117被驱动。另外，在对 培养容器1内的细胞进行回收时，在第一次的细胞回收时，套筒节流阀 47被开放，排出泵111被驱动。另外，在第二次的细胞回收时，套筒节 流阀49被开放，排出泵113被驱动；在第三次的细胞回收时，套筒节流 阀51被开放，排出泵115被驱动。
通过本实施方式，除了第一实施方式的效果之外，排出管119、 121、 123、 125独立设置，所以在第二次以后回收的细胞中不会混入废液或细 胞的代谢物质。因此，可以得到干净的培养细胞。
上述第二实施方式是避免在前次回收时残留在管路中的废液和细胞 的代谢物质两者混入到第二次以后的回收细胞中的实施方式，但可以按照 仅有废液不会混入到第二次以后的回收细胞的方式进行变形。该实施方式 参照上述第二实施方式，对于第一实施方式仅是独立设置废液的回收系 统，由此完成。
权利要求
1.一种自动培养装置，其特征在于，具有试剂供给单元，其分开收纳培养所必需的多种试剂；培养单元，其收纳细胞培养容器；回收单元，其回收在所述培养容器内培养的培养细胞；给排单元，其进行向所述培养容器的细胞供给、试剂从所述试剂供给单元向所述培养容器的供给、和培养细胞从所述培养容器向所述回收单元的排出；以及控制单元，其对向所述培养容器的试剂供给动作、所述培养容器内的细胞培养动作、和培养细胞从所述培养容器的排出动作进行控制，具有对回收培养细胞时残留在所述培养容器内的培养细胞进行包括基于所述给排单元的试剂供给工序的细胞培养工序、和培养细胞的排出工序至少一次的机构。
2. 如权利要求l所述的自动培养装置，其特征在于， 所述给排单元具有用于从设置于所述试剂供给单元的多个试剂袋选择性地将一种试剂供给至所述培养容器的供给用管道、设置于所述管道上 的阀、和供给泵。
3. 如权利要求l所述的自动培养装置，其特征在于，在收纳于所述多个试剂袋的试剂中含有培养基和清洗液。
4. 如权利要求3所述的自动培养装置，其特征在于， 在收纳于所述多个试剂袋的试剂中还含有剥离剂。
5. 如权利要求l所述的自动培养装置，其特征在于， 所述给排单元具有回收培养细胞的多个回收袋、收容已使用完的试剂的废液容器、用于从所述培养容器选择性地将已使用完的试剂和培养细 胞排出到所述回收袋或废液容器的排出用管道、设置在所述管道上的阀、 和排出泵。
6. 如权利要求l所述的自动培养装置，其特征在于，在所述培养容器上设置有多个与所述给排单元相连接的喷嘴。
7. 如权利要求6所述的自动培养装置，其特征在于， 与所述给排单元的排出用管道相连接的所述喷嘴的位于培养容器内 的前端与所述培养容器的底面之间设置有规定间隙，通过所述间隙，在培 养细胞的回收时，培养细胞的一部分残留于培养容器内。
8. 如权利要求5所述的自动培养装置，其特征在于，所述回收袋由具有热压接性的材料构成，具有用于与所述排出用管道 连接的管部分。
9. 如权利要求8所述的自动培养装置，其特征在于，所述给排单元具有对被来自所述控制单元的指令特定了的回收袋的 管部分进行热压接的热密封装置。
10. 如权利要求5所述的自动培养装置，其特征在于， 所述排出单元的排出用管道由对连接至所述培养容器的单个管、和连接至多个回收袋以及废液容器的多个管进行连接而构成，排出泵配置在所 述单个管上，阀配置在连接至多个回收袋以及废液容器的各管上。
11. 如权利要求5所述的自动培养装置，其特征在于， 所述排出单元的排出用管道具有分别连接所述培养容器、废液容器以及多个回收袋的多个管，在各管配置有排出泵和阀。
12. 如权利要求5所述的自动培养装置，其特征在于， 所述排出单元的排出用管道包括连接所述培养容器和废液容器的废液用管、与所述培养容器相连接的单个管、和连接该单个管和多个回收袋 的多个管；所述废液用管和与所述培养容器相连接的单个管上分别配置有排出 泵和阀。
13. —种培养方法，其特征在于，包括(1) 将从人体取得的细胞和培养基注入到培养容器的步骤；(2) 进行放入有培养基和所述细胞的所述培养容器内的换气和培养 基的更换，同时进行细胞培养的步骤；(3) 在对于所述培养容器内培养的培养细胞进行清洗之后，将所述 已清洗的细胞残留其一部分后将其从所述培养容器内回收到细胞回收容 器的步骤；(4) 对于在所述步骤(3)中残留在所述培养容器内的培养细胞，注 入培养基的步骤；和(5)反复实行所述步骤(2)和步骤(4)的步骤。
14. 如权利要求13所述的细胞培养方法，其特征在于， 进行所述步骤(4)和步骤(5)至少一次。
15. 如权利要求13所述的细胞培养方法，其特征在于， 在所述步骤(3)的细胞的回收步骤中，还包括在对所述培养容器内的培养细胞进行清洗的步骤之后，通过注入剥离剂从所述培养容器剥离培 养细胞的步骤。
16. 如权利要求15所述的细胞培养方法，其特征在于， 在所述步骤(3)中的剥离剂注入之后，还包括为削弱剥离剂对培养细胞的影响而向所述培养容器内注入新的培养基的步骤。
17. 如权利要求13所述的细胞培养方法，其特征在于， 在所述步骤(5)中回收的培养细胞被与步骤(3)中回收细胞的容器不同的容器回收。
18. 如权利要求15所述的细胞培养方法，其特征在于， 在所述步骤(5)中回收的培养细胞被与步骤(3)中回收细胞的容器不同的容器回收。
19. 如权利要求16所述的细胞培养方法，其特征在于， 在所述步骤(5)中回收的培养细胞被与步骤(3)中回收细胞的容器不同的容器回收。
全文摘要
本发明的培养方法，其包括将从人体取得的细胞和培养基注入到培养容器内的步骤；(2)进行放入有培养基和所述细胞的所述培养容器内的换气或培养基的更换，同时进行细胞培养的步骤；(3)在对于所述培养容器内培养的培养细胞进行了清洗之后，将所述已清洗的细胞残留其一部分后将其从所述培养容器内回收到细胞回收容器的步骤；(4)对于在所述步骤(3)中残留在所述培养容器内的培养细胞，注入培养基的步骤；和(5)反复实行所述步骤(2)和步骤(4)的步骤。
文档编号C12M3/00GK101370928SQ200680051118
公开日2009年2月18日 申请日期2006年12月14日 优先权日2006年1月17日
发明者上田实, 冈田邦彦, 加藤龙司, 各务秀明, 家岛大辅, 铃木力 申请人:株式会社日立医药;国立大学法人名古屋大学