专利名称：：用于肝祖细胞扩增或分化的细胞外基质组分的制作方法
技术领域：
：本发明一般涉及肝祖细胞的体外增殖或分化。更具体地说，本发明涉及能使包括肝干细胞在内的肝祖细胞在体外增殖和/或分化的细胞外基质组分的鉴定和选择。
背景技术：
：肝干细胞及其子代(如成肝细胞和定向祖细胞)有相当大的扩增潜能。所以，这些细胞是用于细胞治疗(包括生物人造肝脏或细胞移植)的理想的候选群体。尽管前景看好，但是，肝细胞治疗的全部潜能还仍停留在认识阶段。在某种程度上，肝干细胞及其子代的体外增殖已证实很有挑战性。虽然肝干细胞及其子代能在体内成功地增殖，但是其培养条件并非从实验室台面转向临床实践的最佳条件。例如，一些培养条件极大阻碍了细胞分裂或者任意促进细胞分化，从而降低了增殖效能。而且，一些培养条件中需要添加多种因子(如血清或饲养细胞)，而这些因子能引入污染物，从而限制了它们在人类治疗中的应用。所以，需要有能促进肝干细胞及其子代在体外增殖的培养条件和能对干细胞进行世系限制，使其向合适的命运分化的条件。另外，还需要有能消除对词养细胞的需求的培养条件。
发明内容在本发明的一实施例中，提供了一种使肝祖细胞在体外增殖的方法，其包括(a)提供分离出的肝祖细胞，和(b)在包含从肝脏干细胞区室中发现的一种细胞外基质组分或多种细胞外基质组分组合的层上培养分离出的肝祖细胞。所述细胞外基质组分可以是III型胶原、IV型胶原、层粘连蛋白、透明质素、其他糖胺聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸软骨素蛋白聚糖或其组合。在一些实施例中，所述层可以包含其他细胞外基质组分，它们可以是蛋白聚糖如聚集素(agrin)、串珠素(perlecan)、整合素、巢蛋白、肌营养不良聚糖等，或基粘附分子(basaladhesionmolecule)如纤连蛋白，或其他蛋白如弹性蛋白及其组合。在本发明的优选实施例中，第一细胞外基质组分是III型胶原，第二细胞外基质蛋白是层粘连蛋白。根据本发明的方法，分离出的肝祖细胞可以是分离出的肝干细胞、分离出的成肝细胞、定向肝祖细胞，或其组合。另外，该方法可以进一步包括在饲养细胞存在条件下，培养肝祖细胞，所述饲养细胞可以是胚胎细胞、胎儿细胞、新生儿细胞和/或鼠源细胞。饲养细胞优选为成血管细胞。该方法还可以包括在不含血清的培养基中培养肝祖细胞的步骤。优选地，所述不含血清的培养基包含胰岛素(5吗/ml)、转铁蛋白/Fe(5吗/ml)和脂混合物(游离脂肪酸、高密度脂蛋白)、低含量钙(<0.5mM)以及很少量或不含铜。所述肝祖细胞可以从胎儿、新生儿、幼体或成体肝脏中获得。所述层粘连蛋白的浓度可以约为0.1-10jig/cm2，优选为约0.5-5吗/cm2，更优选为0.5吗/cm2或ljig/cm2。III型或IV胶原的浓度各为约0.1-15|ig/cm2，优选为约0.5-8吗/cm2，更优选为约l-7)ig/cm2。在本发明的另一实施例中，提供了一种使肝祖细胞增殖的方法，其包括(a)提供含有从肝脏的干细胞区室中发现的一种或多种细胞外基质组分的第一层；(b)提供含有从肝脏的干细胞区室中发现的一种或多种细胞外基质组分的第二层；以及(c)在第一层和第二层之间培养分离出的肝祖细胞。所述细胞外基质组分可以是m型胶原、IV型胶原、层粘连蛋白、透明质素、蛋白聚糖(如硫酸乙酰肝素和/或硫酸软骨素蛋白聚糖)或其组合。在一些实施例中，所述层可以包含其他细胞外基质组分，它们可以是其他蛋白聚糖(如聚集素(agrin)、串珠素(perlecan)、巢蛋白、肌营养不良聚糖)，其他基粘附分子(如纤连蛋白)和其他细胞外基质蛋白(如弹性蛋白)及其组合。在本发明的一优选实施例中，所述第一细胞外基质组分是m型胶原，所述第二细胞外基质组分是层粘连蛋白。根据本发明的方法，分离出的肝袓细胞可以是分离出的肝干细胞、分离出的成肝细胞、定向肝祖细胞，或其组合。另外，该方法可以进一步包括在提供间充质祖细胞作为饲养细胞的条件下，培养肝祖细胞，所述间充质祖细胞可以来源于胚胎、胎儿、新生儿、幼体或成体组织，而且可以取自任何哺乳类动物。该饲养细胞优选为成血管细胞。该成血管细胞优选来自肝脏。成血管细胞优选来自与肝祖细胞相同的细胞类群。该方法还可以进一步包括在不含血清的培养基中培养肝祖细胞的步骤。所述肝祖细胞可以从胎儿、新生儿、幼体或成体肝脏中获得。所述层粘连蛋白的浓度可以约为0.1-10pg/cm2，优选为约0.5-5昭/cm2，更优选为0.5或ljig/cm2。III型或IV胶原各自的浓度约为0.1-15|ig/cm2，优选为约0.5-8|ig/cm2，更优选为约l-7|ig/cm2。在本发明的再一实施例中，提供了一种用于肝祖细胞增殖的器皿，其包括(a)器皿(如组织培养板、实验室芯片、生物反应器)和(b)含有在肝脏小生境的干细胞区室中发现的至少一种细胞外基质组分的非可溶性层，其中，该非可溶性材料基本上覆盖在器皿内的或器皿的表面上。同样，本领域的技术人员会理解，本文公开内容所依据的思想可以很容易地用作实现本发明几个目的的其他结构、方法和系统的设计基础。因此，很重要的一点是，权利要求应视为包括那些未脱离本图1是培养设计系统和胶原基质基层的示意图。i.)成肝细胞接种在由营养培养基支持的组织培养塑料(TCP)表面上的对照培养；ii.)用来构建胶原基质基层(matrixsubstrate)的各成分的一种比例；iii.)接种了成肝细胞的胶原平板(FlatPlate)设计；iv.)胶原和成肝细胞的"三明治"式设计。图2是往TCP表面上涂布单层基质的技术示意图。v.)TCP表面上进行预涂布的起始步骤。基质分子在设定的时间段内不均匀地分布到该表面上。vi.)灭菌过程；vii.)1XPBS洗涤3次，中和胶原凝胶或纤维构建程序中产生的乙酸pH。viii.)含有以单层形式接种到基质上并由营养培养基支持的肝细胞的终产品。图3提供了用于STO5培养物中发现的基质组分的免疫组织化学结果的图片。图4是培养第0、5、15和31天时肝细胞特征的定时20X显微照片。图4A:第0天显现出较大团块的成肝细胞以及分散的单个细胞。图4B:第5天显现出汇集成片的肝细胞和相关的间充质细胞。图4C:第15天成肝细胞和间充质细胞数量相同。图4D:第31天富含间充质细胞。图5所示为在对照TCP、平板和三明治式设计系统内培养的人胎儿肝细胞在第10天的IOX显微图片。A)对照培养反应情况一一成肝细胞(h)被间充质细胞(np)被淹没。B)平板培养反应情况一—成肝细胞集落，有少许间充质细胞。C)三明治式培养反应情况一一被免疫染色的表达白蛋白(红色)和CK19(绿色)的成肝细胞(h)。图6显示了在各种不同基质上生长的细胞所产生的尿素产量。A)对胶原III(■)、胶原IV(*)、层粘连蛋白()和胶原IV-层粘连蛋白混合物(▽)上培养的成肝细胞进行分析并与塑料对照(▼)培养进行比较。B)在TCP(*)、胶原I平板()和胶原I三明治(▽)上培养的成肝细胞的尿素功能。图7显示了在各种不同基质上生长的细胞所产生的葡萄糖和尿素产量。A)在对照TCP(■)、平板(□)和三明治(i)系统设计上培养的成肝细胞的葡萄糖肝功能。B)在对照TCP(■)、平板(□)和三明治。)系统设计上培养的成肝细胞的肝脏氨水平图8显示了在肝细胞小生境的基质组分上生长的肝祖细胞的体外生长特征。图中所示为接种到A1)胶原III、Bl)层粘连蛋白和C1)胶原III和层粘连蛋白的混合物上的成肝细胞培养到第10天，从其所在整个平皿表面上方摄取的图像。在IOX放大倍数下，对同一培养物进行观察(A2、B2禾卩C2)以便阐明细胞水平的反应情况。图9显现出在胚胎基质基层(胶原III和胶原IV)上接种人胎儿肝细胞之后肝干细胞集落的过度生长。第3天在所有基质基层上显现出成肝细胞。所有条件下还显现出非实质细胞(np)，并在显微图片中被予以标记。胶原III上的培养物中最初在第3天发现肝干细胞，但在TCP、胶原III和胶原IV上培养到第10天肝干细胞也显现出来。图IO所示为根据本发明选择出的肝干细胞。第12天，长时间培养中伴随不同类型细胞的爆发(确定为成肝细胞)的分化动力学从HSC集落边缘出现。A)中突出标识的区域表示从第3-11天开始进化的HSC集落，B)展现出8小时时段内的爆发。图11为将肝细胞母液纯化成HSC细胞母液的示意图。图12为传代方案的示意图最初将HSCs接种到对照TCP皿上，如A所示；再将HSCs转移到6孔培养皿中的0.4nm多孔培养池上，如B所示；C是未处理培养池的俯视图。D是预先涂覆在培养池上的胶原ni的俯视图。E是转移到培养池表面上的细胞的终产品。图13:A)被接种在TCP的成肝细胞包围的聚集在一起的HSC。A2)Al中HSC聚集体的放大图。Bl)接种在TCP上的经ficol分离法纯化的HSC聚集体。B2)Bl中HSC聚集体的放大图。显微图片下方的信息表显示的是免疫荧光反应情况。高活性(++)、活性(+)、可变(+/-)和阴性(-)。图14显示的是用于标记EpCAM、CK19禾BNCAM的免疫荧光图。EpCAM是显著阳性(Al相)对(A2荧光)。CK19显现出可变性(B1&C1相)对(B2阴性HSC荧光&C2阳性荧光)。NCAM也显现出可变性(D1&E1相)对(D2阳性&阴性HSC荧光&E2阳性荧光)图15是接种在TCP或Bornstcin和Traub(BoTr)胶原I片段基层(SigmaIII型胶原)上时，对所形成的HSC集落数进行的比较图。另夕卜，更详细的图表示在其他成体(胶原I型)和胎儿(BD胶原III&IV)基质上的集落形成图16所示为接种在TCP或Bornstcin和Traub(BoTr)胶原I型片段基层(Sigmam型胶原)上HSC集落扩增的反应情况。箭头指的是第7天新看到的集落。第18天，在4X显微图片中的BoTr表面上显现出较大的集落聚集体，第30天，在两个接种平面上均显现出散开的聚集体。图中显示了塑料、BoTr和胎儿胶原III&IV基质上的20X形态细节。图17所示为接种在TCP(黑色)或Bornstcin和Traub(BoTr)胶原I型片段基层(SigmaIII型胶原)(灰色)上的HSCs的整个聚集体增殖图样。为进行图样标准化，用较大的带有波纹线的圆圈表示整个接种面(35mmD平皿)。接种在BoTr上的HSCs最早开始增殖(第5天)，得到较大的表面覆盖率(第20天)，从表面散开时(第30天)比对照慢。当接种到含购自BD的胶原III&IV和购自Vitrogen的胶原I的不同基质基层上时，用更详细的图像对集落生长进行了比较。图18给出第5-30天的标准化后的细胞数量，图中表示出从对数生长期(第5-10天)到饱和密度动力学时期(第10-20天)再到后期汇集期(第20-30天)的变化情况。HSC的BoTr接种培养物显示出，整个培养期间的增殖数增加。图19所示为对数生长期(第5-10天)、饱和密度动力学时期(第10-20天)和后期汇集期(第20-30天)的变化情况，展示出细胞增殖的"增倍"和"减弱"方面。图20显示出HSC向4个独特表面的转移。最初转移了17个集落。转移后的14天内对HSC集落特性进行了比较。Bomstdn和Traub(BoTr)胶原I型片段基层(SigmaIII型胶原，6jig/cm2)上转移的HSCs提供了最有效的环境。图21所示为标准化后的比较成肝细胞(第5-ll天)、HSCs和成肝细胞(第9-17天)，以及仅HSCs(第12-30天)的白蛋白函数图。图22所示为在TCP(黑框)与Bornstcin和Tmub(BoTr)胶原I型片段基层(SigmaIII型胶原)(浅灰色框)上培养的肝干细胞在第10和20天的端粒酶活性水平一一HeLa细胞(黑灰框)作为"基准比较"。A)经标准化换算为蛋白质水平的样品活性。B)经标准化换算为细胞数的样品活性。显微图片是相同的相中人HSCs、阴性对照，以及具有端粒酶表达的人HSCs。具体实施例方式在本发明的一实施例中，细胞外基质组分被鉴定出，它们能促进肝干细胞及其子代的附着、生存和体外增殖。本文中"肝祖细胞"用来泛指包括肝干细胞及其子代。"子代"可以包括自我复制的肝干细胞、成肝细胞、其多能祖细胞，以及定向分化成特定细胞类型(如肝细胞)的祖细胞。"克隆源细胞扩增"(donogenicexpansion)是指能从一个细胞开始扩增，经传代培养和反复扩增，仍保持母细胞表型的细胞生长特性。"集落形成"是指能在一周或两周内进行有限次细胞分裂(通常5-7次细胞分裂)的二倍体实质细胞的特性，其包括具有能进行传代培养的有限能力的细胞。"多能"表示细胞能形成一种以上命运的子细胞。"专能"或"定向祖细胞"是指具有一种成体命运的细胞。肝干细胞(HSCs)是在胎儿和新生儿肝脏的管板(ductalplate)(又称界板)以及幼体和成体肝脏的赫令管(CanalsofHering)中发现的多能细胞，端粒酶的表达，证明这些细胞能自我复制(ref)，而且移植时(refs)能形成成熟的肝脏细胞。这些细胞是EpCAM+、NCAM+、ALB+、CK8/18+、CK19+、CD133/l+，对所试验的所有造血标志物(如CD34、CD38、CD45、CD14)、间充质细胞标志物(CD146、VEGFr、CD31),以及P450s或a-甲胎蛋白的表达呈阴性。已经发现HSCs是成肝细胞和定向(单能)胆囊祖细胞的源头。成肝细胞(HBs)是在胎儿和新生儿肝脏的整个实质中发现的多能细胞，以单细胞或细胞小集落形式束缚在赫令管的端部。成肝细胞来源于肝干细胞。成肝细胞共用肝干细胞上存在的许多抗原，但有重要区别。例如，成肝细胞不表达NCAM，而是表达ICAMI，而且成肝细胞表达大量的oi-甲胎蛋白和P450s胎儿形式。这些HBs产生单能祖细胞、定向肝祖细胞和胆囊祖细胞。肝定向祖细胞是肝系和胆囊系的单能祖细胞。它们的抗原特性与成肝细胞重叠，但是，胆囊定向祖细胞表达CK19，但不表达AFP或ALB;而肝定向祖细胞表达AFP禾卩ALB，但不表达CK19。定向胆囊祖细胞既直接来源于肝干细胞，也来源于成肝细胞。间充质细胞(MCs)包括许多不同类型(按成熟细胞列举，括号中为它们的前体)的间充质细胞的各种不同世系阶段中的细胞包括基质(间充质干细胞)、内皮(成血管细胞)、星状细胞(星状细胞前体)和各种造血细胞(造血干细胞)。虽然本文讨论和举例的肝祖细胞中大部分(如果不是全部的话)涉及人源细胞群，但本文的教导不应局限于人。事实上，本领域的普通技术人员通常应该可以将本文的教导应用到哺乳动物(如小鼠、大鼠、狗等)肝祖细胞的扩增中。所以，本发明的范围欲包括任一及所有哺乳动物的肝祖细胞。还应注意，适于根据本发明进行体外增殖的肝祖细胞并不局限于根据任一特定方法分离或鉴定出的那些肝袓细胞。作为示例，肝祖细胞的分离和鉴定方法已有文献记载，如美国专利6,069,005;美国专利申请09/487,318、10/135,700禾口10/387,547，其公开内容通过引用整体并入本申请。肝干细胞和成肝细胞具有独特的抗原性，能通过前面叙述的方案进行分离。例如，肝干细胞和成肝细胞共用多种抗原(如细胞角蛋白8、18和19、清蛋白、CD133/1和上皮细胞粘附分子(EpCAM))，对造血标志物(如血型糖蛋白A、CD34、CD38、CD45、CD14)和间充质细胞标志物(如CD146、CD31、VEGFr或KDR)呈阴性。另夕卜，肝干细胞和成肝细胞能通过大小(肝细胞7-9pm;成肝细胞10-12pm)、培养形态学(肝细胞形成浓密的、形态一致的集落，而成肝细胞形成索状结构，其中散布有清晰的沟槽_—假定性小管)、某些抗原表达模式中的差异(EpCAM在整个肝干细胞中都有表达，但只在成肝细胞的细胞表面表达)，或者通过不同的抗原特性(肝干细胞中存在N-CAM，而成肝细胞表达a-甲胎蛋白(AFP)和ICAM1)加以区分。胎儿和新生儿肝脏中，肝干细胞存在于管板(又称"界板")内，而成肝细胞是主要的实质细胞群(>80%)。幼体和成体组织中，肝干细胞存在于赫令管内，而成肝细胞是束缚在赫令管端部的细胞。正常组织中成肝细胞由少量细胞组成，但却大量(如结节)见于病变肝脏中(如肝硬化)。本发明人发现，在肝脏的肝细胞小生境内或附近发现的细胞外基质组分能用于肝祖细胞扩增而不诱导分化，优于现有技术。下面会详细介绍，在基质组分上培养的细胞(在肝脏肝细胞小生境内或附近发现的高丰度细胞)在某些基质组分上(如层粘连蛋白)聚集形成椭球状结构，而在另一些组分(如ni型胶原)上铺展开形成单层。在肝细胞小生境中发现的细胞外基质组分的具体类型属于肝祖细胞按自我复制模式扩增的信号必需物，自我复制模式是指对称的细胞分裂(子细胞与母细胞相同或近乎相同)。我们进一步认为，肝干细胞的成熟依存于指导(至少一定程度上)肝干细胞分化的基质组分的独特组合。某些细胞外基质组分允许肝祖细胞发生由不对称分裂引起的扩增，这类扩增与某些分化一起发生。但另一些位于发现有完全成熟肝细胞的肝脏组织区域中的细胞外基质会引起细胞生长停滞和完全分化。所以，用胚胎组织(或肝细胞小生境)中发现或富含的基质组分进行体外培养，有助于维持成熟形式的肝干细胞。同样，用从成熟组织中发现的或成熟组织中富含的基质组分培养，也可以影响这些细胞的分化。的确，将位于肝腺泡中心静脉附近狄氏间隙内的肝祖细胞平铺到与成熟实质细胞有关的基质组分如I型胶原和某些形式的纤连蛋白上，其分裂缓慢，之后停止增殖，该过程同时伴随着对肝细胞命运的世系限制。肝祖细胞不能附着到纤连蛋白上或者不能在纤连蛋白上生存，那些确实附着的肝祖细胞则快速凋亡和死亡。但是，肝祖细胞产生后代的附着、生存和功能发挥需要有纤连蛋白存在。所以对细胞外基质组分的具体类型或化学特性的要求具有世系依赖性，也就是说，这些需求与细胞的具体成熟阶段相关。本发明的范围不应局限于任何一种基质组分或其组合。与本文的教导一致，本发明描述和讲解了任一种和所有细胞外基质组分及其组合在形成能被用于维持体外细胞扩增或分化的基质方面的应用。虽然这些组分中有许多会在下面讨论，但为了阐述清楚，将以层粘连蛋白、IV型胶原和/或III型胶原作为从胚胎组织或肝细胞小生境中发现或高丰度存在于其中的一类细胞外基质组分的代表例予以讨论。胚胎基质组分的非限制例包括特定类型的胶原，包括胶原IV型(进一步包括al、a2、a3、a4、a5、a6)和胶原III型；层粘连蛋白(包括l、y1、(32、a3、a5);透明质素；多种形式的硫酸软骨素蛋白聚糖或其糖胺聚糖链；多种形式的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或其糖胺聚糖链(如某些多配体蛋白聚糖)。从成熟组织中发现的基质组分的非限制例包括稳定形式的胶原(如i和n型)，多种形式的纤连蛋白；硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(如聚集素、串珠素)，肝素蛋白聚糖；皮肤素蛋白聚糖(如软骨相关性硫酸皮肤素蛋白聚糖)和弹性蛋白。各种不同的细胞培养基都可以适用本发明。通过向培养基中添加或去除生长因子和/或分化因子，可以影响细胞的增殖和/或分化率。例如，添加血清，能减慢肝祖细胞的生长，引起对肝细胞命运的世系限制，以及引起间充质细胞群(基质和内皮)的快速扩增。添加表皮生长因子会导致对肝细胞命运的世系限制。优选地，在有些实施例中，本文所述基质组分与不含血清的培养基联合使用。现已研发出成肝细胞用的不含血清的培养基，见美国专利申请09/678,953所述，该申请公开内容整体并入本文。目前认为但不受理论限制，本发明的基质组分提供了许多通常由词养细胞提供的生存、生长和/或增殖信号。所以，本发明在相当大程度上可以替代为维持肝祖细胞的活力和扩增潜能而使用胚胎基质饲养细胞的需求。下面通过非限制性例子对本发明的一个实施例进行描述。实施例培养基与缓冲液除非另外说明，处理肝脏组织和维持细胞培养的过程中均使用不含血清的培养基。该培养基含有500ml添加了0.1%牛血清白蛋白(第五组分)的RPMI1640、10ng/ml牛holo-转铁蛋白(饱和铁)、5|ig/ml胰岛素、500^1硒、5mlL-谷氨酰胺、270mg烟酰胺、5mlAAS抗生素、500^1氢化可的松、1.75^12-巯基乙醇和38^1按已公布的美国专利申请09/678,953所述制备的游离脂肪酸混合物。将此培养基灭菌，使用前调节pH至7.4。"细胞洗涤缓冲液"含有添加了1%牛血清白蛋白的500mlRPM11640、50(Hd硒和5mlAAS抗生素。"酶消化缓冲液"含有100ml添加了60mgIV型胶原酶和30mgDNA酶(37。C溶解)的细胞洗涤缓冲液。组织获取与制备从认证机构如美国加利福尼亚州阿拉米达高等生物科学资源所(AdvancedBiosciencesResourcesofAlameda)获取16-22周孕龄之间的人胚胎的肝脏组织。理想的是，组织在被分离后18小时内被接收并抵达，用作多个组织部分或者偶尔用作适度完整的肝脏。一般来说，整个组织的体积约为4-12ml，含有大量红血细胞(RBCs)。用机械法将肝脏解离，再用酶消化缓冲液对组织进行部分消化，产生实质细胞团。洗涤这些细胞团、低速离心，以便基本上去除游离漂浮的造血细胞，但保留肝实质。然后将解离后的肝分割成每份3ml，每份中加入25ml酶消化缓冲液。32°C，温和搅拌30分钟后，倒掉上清液，存放在4"C。再用新鲜的酶消化缓冲液对剩余的没有变成碎片的团块另外消化30分钟。对组织碎片进行的酶消化过程结束后，在250旋转离心力(RCF)下将细胞悬浮液离心；倒掉上清液；将离心团块重悬在等量的细胞洗涤缓冲液中。分离技术取自胎儿肝脏的肝细胞悬浮液中充满造血细胞，尤其是红系细胞。事实上，人胎儿肝脏的初始细胞悬浮液平均由仅6-9%的实质细胞和其余为各种不同的非实质细胞尤其是红系细胞组成。由于去除红系细胞的常规方法如使用裂解缓冲液可能对肝祖细胞有毒性，所以最好选用其他方法。例如，使用已经公布的方法(Lilja等人，1997;Lilja等人，1998)经过反复低速离心，可以将红系细胞和实质细胞分开。可以使用另外一种更有效的方法一一补体介导细胞毒性法，使候选干细胞的损失降低到最小程度。用胶原酶消化后，将抗人红血细胞(RBC)抗体用所述细胞悬浮液(1:5000稀释)在37。C温育15分钟。为了刺穿并裂解抗体标记的红细胞，加入补体(如LowTox豚鼠补体)(1:3000稀释)，在37'C温育10分钟。由于红细胞释放出血红蛋白，所以细胞上清液会变成淡粉红色。造血细胞被去除后，悬浮液由至少80-90%的实质细胞组成。将除去造血细胞后得到的悬浮液再用新鲜胶原酶溶液进行30分钟的第二轮酶消化，以最大程度的减小细胞团块，之后用75iim尼龙筛过筛。用台盼蓝排除法估测细胞活力，其活力常规在95%以上。过滤后，肉眼观察到，大多数成肝细胞呈细胞团块，每个聚集团含4-8个细胞。这些技术组合有助于形成基本上不含红血细胞但富含实质肝细胞的细胞悬浮液。进一步的富集方案包括Ficoll分离法(FicollFractionation),用于分离成肝细胞。简单来说就是，将细胞悬浮在10ml不含苯酚红的基本培养基中，然后覆盖在50ml离心管内等体积的分离介质Ficoll-Paque(AmershamPharmacia)上方。1000Xg离心25分钟。收集分界面细胞和成团细胞。Ficoll分离法得到的团块中实质细胞一般占80%以上，这些细胞基本上都是成肝细胞，界面中含13-14%的初始细胞群，其抗原特性各异，说明存在实质细胞、造血细胞和内皮细胞。Fico11分界面细胞得到0.1%的管板细胞集落，其数量比初始细胞悬浮液中的管板细胞增加10倍。虽然用Ficoll分离法分离成肝细胞时每次得到的结果可能是一致的，但是用该方法分离干细胞时每次制备得到的结果往往变化较大。免疫选择技术是另一种富集和/或分离肝干细胞(管板细胞)或其他亚群的技术。免疫选择方案中使用在细胞上强表达的抗原(如所有肝祖细胞上发现的EpCAM)和一个肝祖细胞亚群上的其他抗原(如管板细胞上的NCAM)是比较理想的。免疫选择技术可以采用这些程序所适用的各种不同方法中的任一方法进行，可以采用细胞仪、亲合板粘附或磁珠。磁性免疫选择法包括细胞表达的分离，例如使用与磁性微珠结合的单克隆抗体HEA125禾nMiltenyiBiotec公司(德国BergischGladbach)的autoMACSTM或CliniMACS⑧磁性柱分离系统，按照生产商推荐的操作方案，从人肝细胞悬浮液中分离EpCAM。NCAM、CD146、KDR(VEGFr)和CD133/1细胞的免疫选择方法与之类似。试验所有进行的试验中，均使用6孔平皿，每个孔接种0.8X106个实质细胞。在接种开始后的第一个IO小时，向培养基中添加10%胎牛血清。一般认为，在起始铺板期间添加血清，会促使组织消化所用的酶失活，而且对初始的附着有帮助。之后，只使用不含血清的培养基。通常每隔24小时更换一次培养基，有些情况下，隔3天更换一次培养基。除非另外说明，实验值均通过标准化换算为营养培养基体积和细胞数。基于尿素能与二乙酰一肟直接相互作用的原理进行试验，以确定所收集的培养基样品的尿素浓度。诊断试剂盒用的标准和试剂从Sigma公司购买。对这些试剂盒进行调整以适应96孔微板的使用。首先制备稀释后的浓度标准。使用系列稀释，减小标准浓度，使标准范围在0-30.76mg/dL之间。然后将血-尿素-氮(bun)酸性试剂和bun显色剂按1.3:1.0混合，制成混合试剂。本试验方案包括先往各微板孔内加9ml合适的样品(如空白、标准或样品)，再加100ml混合试剂。50°C，温育大约25分钟或者温育到在浓度标准内看到明显的标准颜色变化为止。然后将微板底物置于冰上冷却3分钟。冷却之后立即使用CytoFluor多孔细胞计数仪在535nm测定光密度变化。氨-叫根据NH3能与溴酚蓝(氨指示剂)发生反应的原理进行比色试验，使用VITROSDT60II化学系统(Ortho-ClinicalDiagnostics,RochesterNY)进行试验分析。该自动过程需要10|il样品、5分钟温育时间、37'C环境室和605nm吸收测定管。置于该化学分析仪内部后，玻片上标示出光密度变化，并且相对预先校准的标准标示出所在位置。VITROSDT60II化学系统使用的是双反应序列。首先，葡萄糖氧化酶催化样品葡萄糖氧化形成H202。然后过氧化氢酶在染料前体存在条件下催化氧化偶联，其中，用反射光测定染料浓度。各个试验包括先在各化学玻片上滴加10pl合适的样品(如空白、标准或样品)。置于该化学分析仪内部后，玻片上标示出光密度变化，并且相对预先校准的标准标示出所在位置。免疫染色用乙酮/甲醇(50/50)混合物将培养物固定，持续2分钟，再用1XPBS洗涤，10%山羊血清封闭45分钟。之后进行细胞免疫染色。加入标记荧光探针的人第一抗体，室温下处理l-8小时。使用未标记的第一抗体时，则用标记荧光探针的第二抗体进行细胞染色。增殖使用放大倍数为4X、10X和20X的相差显微术，通过集落生长大小变化成像来评估肝袓细胞的增殖情况；使用低倍物镜，可以观察到全部集落。对集落重复成像，并相对预先在统计比较分析所用MetaMorph图像处理软件上校准的已知尺寸对显微图片进行标准化处理后，获得生长曲线。组织培养基质的制备对照研究包括将人胎儿肝细胞直接接种到组织培养塑料(TCP)上(图1A)。制备3个不同浓度(0.5、1.0或2吗/cm2)的纤连蛋白平板，将pH调节到7.5。制备胶原I型平板，浓度l-1.5mg/ml。制备过程中，按特定比例加入10XDMEM禾B0.1MNaOH，将高密度Vitrogen100(CohesionTechnologies,PaloAlto,CA)变成液态胶原I型。更具体点说，图IB所示为本发明的一个实施例，该实施例中，将0.25ml0.1MNaOH、0.25ml10XDMEM或PBS、1.5mg/mlVitrogen100加到一起，在4'C轻轻地混合成均质溶液。混合过程中，最好避免将气泡混入新形成的胶原I型悬浮液内，因为空气间隙能破坏胶原的稳定性。将该胶原I悬浮液预先铺在平皿孔表面，分别制备图IC和1D所示的平板(FP)和"三明治"式设计。平板制备中，向6孔板的每个孔内加入0.4ml胶原I悬浮液。在37'C和5。/。C02条件下静置1小时，让胶原I悬浮液形成凝胶。然后准备接收肝祖细胞。三明治板的制备可以和平板相同。但是，为了将细胞制成"三明治"，将第二层胶原悬浮液倒在表面上附着细胞的平板上。如平板一样，在37"C和5%(:02条件下温育1小时，以凝固成新的顶部胶原层。之后，加入0.5ml不含血清的培养基，用作营养支持。制备2个不同浓度(0.52或1.0|ig/cm2)的层粘连蛋白平板，pH调节到7.5。使用5个不同蛋白浓度(2.1、4.2、6.3、8.3或10.4吗/cm2)中的1个浓度制备铺在平皿上的胶原覆盖层。铺皿后，在37。C和5%C02下静置10小时，使该基质附着。铺皿过程如图2所示，其中基质分子在醋酸缓冲液中和平皿内不均匀地随机分布。约10小时内，这些基质分子稳定下来并以单一均匀阵列附着在孔表面上。UV灭菌2小时，1XPBS漂洗，使酸性pH中和。用pH3乙酸制备胶原III板，用0.5M乙酸制备胶原IV板，制备方法与上面类似。制备组合板时，将III型胶原和层粘连蛋白共同铺在TCP表面上，它们各自的浓度分别为6.25吗/cn^和0.52昭/cm2。将IV型胶原和层粘连蛋白共同铺在TCP表面上，它们各自的浓度分别为4.2吗/cm2和1.0吗/cm2。肝干细胞区室中基质组分的鉴定通过免疫组织化学技术对胎儿肝部分的肝细胞区室内基质组分进行体内鉴定，通过胚胎间充质词养细胞产生的基质组分试验对肝细胞区室内基质组分进行体外鉴定。使用成血管细胞(肝干细胞的自身间充质搭档)和鼠胚胎基质饲养细胞(如STO细胞)作为这些实验的代表性细胞。如表I所示，该研究确定饲养细胞(如成血管细胞和STO饲养细胞)产生层粘连细胞、in型胶原和iv型胶原、透明质素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。注意，肝干细胞具有透明质素(图3)和己鉴定出的胶原的受体。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>更详细的比较研究见表II。表II<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表II中开展的调査描述了人肝干细胞的反应情况，包括细胞附着、细胞生存、形成几何形状培养物、形成独特集落、分裂率、免疫组织化学应答，以及功能性葡萄糖和尿素产物。对于附着来说，当在层粘连蛋白或III型或IV型胶原或成体基质I型胶原上培养时，人肝干细胞引起细胞基质间的相互作用。在所研究的基质中，仅层粘连蛋白上的附着力最小。另外，层粘连蛋白促进少量附着细胞快速凋亡，所以除层粘连蛋白外，其他所有基质底层上培养的细胞生存时间超过10天。值得注意的是，成熟实质细胞的附着、生存和发挥功能需要有纤连蛋白存在。接着观察形成的培养物几何形状。层粘连蛋白和纤连蛋白诱导形成3D椭球状聚集体，而其他基层诱导形成单层细胞。另外观察到覆在层粘连蛋白、in型胶原和iv型胶原上的细胞出现克隆原扩增，而在I型胶原和纤连蛋白上分别观察到形成集落或无生长。III型胶原使分裂率约小于24小时，而接种在I型胶原上的细胞生长缓慢，然后进入生长停滞期，之后保持细胞活力和功能。还对白蛋白(ALB)、细胞角蛋白(CK19)、a-胎蛋白(AFP)、E-钙粘着蛋白(E-CAD)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、神经细胞粘附分子(NCAM)和细胞角蛋白8和18(CK8禾tl18)的免疫组织化学应答做了比较。最主要和活跃的应答表现为NCAM(+)、EpCAM(++)、ALB(+)禾卩CK8和CK18(+)。有趣的是，CK19由层粘连蛋白、III型胶原和IV型胶原上培养的肝细胞强表达，但覆盖在I型胶原和纤连蛋白上的细胞则不表达，表现为阴性。这一发现暗示，早期的双潜能(bipotent)活性受到成熟组织中富含的基质组分的世系限制。而且，胶原I上培养的细胞的高AFP和ALB活动说明实质细胞对定向肝祖细胞进行世系限制，葡萄糖和尿素产物的强表达数据证实了这一发现。接着通过一项为期31天的定时研究，从直接覆盖在TCP表面的肝祖细胞转向人成肝细胞和肝干细胞及相关间充质细胞搭档的形态学特征。第0天，肝细胞均匀分布在TCP表面上。最初的成肝细胞(h)群以椭球状团块形式存在，含有3-8个成肝细胞(i)，但也发现存在单个细胞(T)，如图4A中20X显微图片所示。这张图中，成肝细胞的平均直径确定为约10-12|im，而直径小于约10iam的小一些的细胞被认为是间充质细胞、残余的RBCs或肝干细胞。细胞培养物没有汇集到一起，而是形成多个各不相同的椭球状聚集体，附着在表面上。培养到第5天，残余的RBCs脱离TCP表面，发生死亡。剩下的细胞群中大多数为成肝细胞和各种不同的间充质细胞(mes)，它们稳定下来，形成各自如图4B所示的形态。这一稳定过程促使成肝细胞(h)培养物汇集到一起，证明成肝细胞群被铺展开，开始发生细胞-细胞接触。而且，成肝细胞保留了良好的细胞差异，具有清晰的膜轮廓和平滑的细胞质特征。另外，成肝细胞和间充质细胞类型之间的共培养相互作用有限，它们之间的共同边界较少而且离散。培养到第15天(图4C)，成肝细胞具有"颗粒"状细胞膜和细胞质特征，符合衰退细胞的特征。另外，成肝细胞与间充质细胞之间的比例达到相等，这暗示随着成肝细胞的消除，非实质细胞正占据着更大的表面区域。这一发现与"成纤细胞过生长"的典型现象类似，甚至培养基中未添加血清亦是如此。这些变化说明TCP培养条件有利于间充质细胞扩增，而对成肝细胞增殖和生存不利。的确，第31天，由于间充质细胞完全覆盖了培养表面，所以成肝细胞要么死亡，要么重新组织，形成脚手架(scaffolding),如图4D中20X显微图片所示。接下来比较仅在TCP上培养和在FP或三明治式I型胶原凝胶上培养的人肝祖细胞。第10天的培养状况如图5所示。就图4A所示的"TCP上细胞"的培养对照来说，成肝细胞(h)显现出颗粒状细胞质特征，没有明显的细胞边界。另外，间充质细胞(mcs)(大多为内皮和基质)环绕在成肝细胞集落周围。成肝细胞在塑料上的外观与同时在胶原I型(FP)上培养(图5B)的成肝细胞的外观截然不同。后一成肝细胞显现出确定的细胞边界和颗粒状细胞质——稳定成肝细胞的特征。另外，间充质细胞显现出有限的增殖，但也保留了明显的细胞边界特征。使用图4C所示三明治式设计培养的成肝细胞证实了所引起的细胞-细胞接触、确定的细胞边界，以及肝细胞和胆囊功能的双表达(从对白蛋白(红色)和CK19(绿色)表达进行的免疫染色中得到证实)。这些结果说明该祖细胞群中双潜能的稳定性(stabilizationofbipotency)。尿素由成熟肝细胞特异产生。所以，可以用尿素表达来指示组织特异性基因表达和分化的显著程度。因此，为了研究未成熟肝细胞的分化程度与体外基质蛋白质的函数关系，在培养若干小时后，确定培养基中的尿素浓度。图6显示了在胚胎和胎儿肝组织中主要的细胞外基质上培养的成肝细胞。这些体内基质的一部分包括III型胶原(■)、IV型胶原(參)、层粘连蛋白(〇)和胶原IV-层粘连蛋白混合物(▽)，相对于TCP对照(▼)，对这些基质进行分析和比较。为进行尿素分析，对成肝细胞监控l-5天，其标准化的尿素结果标于纵轴上。总体上，TCP上的对照细胞(▼)在整个研究期间的活力较差——最大和最小尿素浓度为5.5X10—6禾卩1.5X10—6mg/dL。更具体一点说，第1天，接种到"胶原IV"或"胶原IV和层粘连蛋白"上的成肝细胞达到9.5Xl(^mg/dL的尿素水平时，立刻观察到区别；所有试验的其他培养产生的尿素水平接近5.3Xl(T6mg/dL——或在高度活跃的和固定附着的成肝细胞之间有56%的偏差。除了接种在"胶原IV和层粘连蛋白"上的成肝细胞显现出尿素功能有轻微下降的迹象外，第1天和第2天的结果之间没有注意到有变化。但到了第3天，IV型胶原(參)培养物显露出最佳的尿素功能活性，其达到1.2X10—5mg/dL，而其他培养物表达的尿素水平量低33%。到第5天，所有尿素水平并入2X10—6mg/dL的最小尿素表达水平，这暗示培养基中氨被耗尽，因为尿素表达需要氨因子的参与。尿素产量用尿素浓度/细胞表示(图6B)。这些图表示经过24小时以后的尿素浓度，在所做的标记中，实心黑圈()数据点表示TCP上的成肝细胞(对照)，实心白圈(〇)数据点表示来自接种在I型胶原(平板，FP)上的培养物中的成肝细胞，灰色三角形(A)数据点分别表示在I型胶原层间(三明治式设计)培养的成肝细胞。这样，在第3-6天对培养物进行定时评估。如各系统所示，第3天尿素浓度水平较高，但在整个研究期间其水平却在连续下降。还注意到，整个研究期间，对照中的尿素水平相对较低。在FP和三明治结构中培养的成肝细胞的活性类似，在第3天和第4天，分别为8.0Xl(T5mg/dL和5.0X10-6mg/dL。与培养塑料上的对照培养相比，这些值相当于活性提高了约80%。同样，平板系统显示，在第5、6天，成肝细胞活性较高。根据显示结果，成肝细胞FP活性比三明治式活性高出约8%，比TCP培养高出约115%。使用另外两项试验比较接种在各种不同基质上的细胞的功能活性。图7分别绘出了第3天的葡萄糖和氨产量，该图表示的是尿素日活性最高(图6)的时间。图7A中葡萄糖比较结果显示，TCP培养对照所产生的葡萄糖水平为1.5X10—3mg/dL，用黑色实心框(■)表示，胶原I型FP培养产生的葡萄糖水平为1.63Xl(T3mg/dL，用白色实心框(□)表示，三明治式胶原I型培养产生的葡萄糖水平为2.6X10—3mg/dL，用实心灰色框表示。三明治式和TCP或FP培养之间的比较结果显示，三明治式培养中的葡萄糖水平比其他细胞系统反应高出约64%。图7B显示，TCP培养中积聚的氨浓度为4.5Xl(T3mmol/L，FP系统中为2.8X10-3mmol/L，三明治式胶原系统为2.6X10—3mmol/L。FP和三明治式培养中氨水平下降，对照中氨水平约多出60%。如图8所示，成肝细胞展现出形态变化，其变化是由其基质的几何学控制的。图8A1、8B1和8C1显示的是培养到第10天的低倍图像和整个表面特征。图8A2、8B2禾Q8C2通过相同培养物的高倍图像显现出详细的形态学差异。图8A1中，平皿表面先铺上6.25mg/cn^胶原III，然后接种胎儿肝细胞。第10天，大量相互连接的组织块和粘着的凝胶状基质形成。另外，这一培养显现出新近形成但随机散布的脱细胞圆形亚群(subdivision)。为进行更详细的图像分析，图8A2的显微图片显示了一部分图8A1的放大图。这一放大显现出密集图样中的人成肝细胞网络。为比较这种细胞环境作用，将肝细胞母液接种到覆盖有0.52mg/cmS层粘连蛋白的平皿表面上培养，如8B1和8B2所示。图8B1中，大量分段的"白色斑点"散布在整个接种表面。这些聚集体在图8B2中确认为紧密的椭球状聚集体，其中椭球体伸长至与表面接触。由于椭球体生长以及移动培养基的力引起大的椭球体摆动，所以许多表面附着键断裂，细胞从培养物中被洗脱。但是，椭球体有可能移植到胶原I和胶原in基质上，再次使细胞附着和进一步铺展开。为进行细胞-基质作用的第三次比较，将同样的肝细胞置于预先分别铺有6.25和0.52mg/cm1交原III-层粘连蛋白的平皿表面上培养。如图8C1所示，使用白色背景，整个培养结果显现出大量相互连接的组织团。另外，还显现出了不含组织和基质组分的非均质脱细胞区域。同样，图8C2显现出有活性并且稳定的共同培养的成肝细胞和非实质细胞。大多数细胞是成肝细胞，它们呈"圆石块"状排列。另外观察到实质细胞和非实质细胞搭档之间的一些边界的相互作用。使用由胚胎组织中富含的基质(如层粘连蛋白和胶原ni和IV)制备的培养基，诱导成肝细胞的特定形态和功能变化，同时还进行肝干细胞(HSC)的选择(前体到成肝细胞)。图9显示了分别接种在TCP、层粘连蛋白、胶原III和胶原IV表面上、培养了3-10天的胎儿肝细胞的形态。将第3天的IOX图像分别称为TCP3、层粘连蛋白3、胶原III3和胶原IV3，而将第10天的4X图像分别称为TCPIO、层粘连蛋白10、胶原III10和胶原IV10。第3天对照TCP3集落显现出大量成肝细胞(h)和少量非实质细胞(np)。相对来说，层粘连蛋白上的第3天培养物主要由成肝细胞组成，但附着的细胞减少，铺展开的细胞增多。相比而言，胶原III上的细胞选择出肝干细胞。可以看到肝干细胞集落是紧密聚集在一起的细胞，形态均一，倍增时间是1.2天。这些细胞具有HSC特异性抗原(如EpCAM+、NCAM+、白蛋白+、AFP-、CK19+、CK8+禾卩18+)的特征表达。另外，HSC集落细胞的特征直径为7-9mm，其中细胞核占据了大部分细胞质。集落细胞在大约第3天发生实质化并且仍然被成肝细胞包围。接种在胶原IV上的肝细胞也在整个培养面展现出许多成肝细胞，同时两个小HSC集落开始形成。第10天拍摄第IO天结果的显微照片，放大4X，以便使某些HSC集落整体被摄入照片内。TCP10对照培养中，小HSC集落形成并且仍然被大量成肝细胞包围。这一小集落获得清晰的中间凸起、外部厚实的脊。层粘连蛋白IO培养中，成肝细胞聚集成小的紧密成团的聚集体，在小直径集落内形成具有球形排列的三维结构和厚的组织层。胶原III10培养物中含有大量"平坦并伸展开"的HSC集落，维持紧密聚集的细胞-细胞相互作用，表面上排除其他类型细胞的存在。在所示显微照片中，HSC增殖集落之间没有见到成肝细胞。最后，胶原IVIO培养物同时含有成肝细胞和新出现的HSC集落，该集落具有明显的集落边界和高出来的边界脊。对HSC集落进一步详细研究，如图IO所示。这些图中，附着基质为胶原IV，铺皿浓度为4.15吗/cm2，在第12天给肝干细胞集落拍照。如图所示，在这一集落附近或显微照片的其他位置没有观察到其他细胞表型。所以，这一环境可以认为是对特定类型细胞的选择。在得到如图10A所示的IOX显微照片之前的第4-11天，用肉眼监控HSC集落。这一时段中，紧密的HSCs从少于约IO个细胞的小聚集体开始，增殖成更大的集落，其中含有成百上千的细胞，见图10A中标出的突出圆形区域内所示。但在第12天的8小时时段内，增殖细胞在HSC集落边缘发生两个显著的"爆发"或过度生长，导致细胞具有成肝细胞特有的抗原和形态特征。这些过度生长清楚可辨，是因为其分化细胞松散聚集，具有较大直径和明显的沟(胆小管)。图10B所示为20X显微照片，聚焦中心在该过度生长的细胞上方。这张图中，过度生长的肝袓细胞的直径为15-21nm，细胞质与细胞核的比例增加，具有单一细胞核，发生细胞-细胞接触，仍有确定的细胞边界和细胞外基质间隔。另外，从HSC集落发生的分化细胞的形态追踪显示，在扩增开始的头8小时期间，约有1200个新细胞。门静脉周区内和肝干细胞小生境中的基质组分与所发现的成熟实质细胞相关性基质组分截然不同，并且引起人肝干/祖细胞的纯化亚群发生不同的生物反应。这些差异有可能提供改变细胞反应和激活动态表达的各种不同信号。明确不同种类的细胞外基质组分在体内和体外诱导细胞活性的机理，可以在体外重现微环境以扩增和分化HSC群，供病变组织的更换或再群体化(r印opulation)。这样，通过移植细胞，可以避免将整个器官一起更换。而且，可以植入带有包含在合适细胞外基质和可溶性信号传导环境中的肝祖细胞的体外装置如生物反应器，这些细胞生活在装置亚区室中，具有活组织结构。这样，生物人工装置可以被用于药物学研究、疫苗开发，并且可用作器官衰竭和器官移植之间的桥梁。的确，这些研究所得结果暗示，使用这些细胞可以是一种改善细胞起源限制的方法，目前这些限制阻碍了细胞治疗和生物反应器装置介导的治疗选择。虽然结合具体实施例对本发明加以描述，但应当理解，本发明能够被进一步改动，本申请欲涵盖依照本发明原理作出的任何变化、用途或变更，其包括那些脱离本发明公开内容，但属于本发明所属领域内的已知或公知常识，并且可以应用于权利要求范围所述的必要特征的内容。权利要求1.一种使肝祖细胞在体外增殖的方法，其包括(a)提供分离出的肝祖细胞，以及(b)在从肝脏干细胞区室中发现的一种或多种细胞外基质组分上培养分离出的肝祖细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从肝脏干细胞区室中发现的细胞外基质组分选自ni型胶原、iv型胶原、层粘连蛋白、透明质素或其组合。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述从肝脏干细胞区室中发现的细胞外基质组分是III型胶原或IV型胶原或其组合。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述肝祖细胞进一步在选自m型胶原、基粘附分子、蛋白聚糖、糖胺聚糖硫酸乙酰肝素、弹性蛋白或其组合的细胞外基质组分上培养。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述基粘附分子是纤连蛋白。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸软骨素蛋白聚糖或其组合。7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述糖胺聚糖是硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质素或其组合。8.根据权利要求2所述的方法，其中，所述细胞外基质组分是III型胶原和层粘连蛋白。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分离出的肝祖细胞是分离出的肝干细胞、分离出的成肝细胞、定向肝祖细胞或其组合。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述分离出的肝祖细胞是分离出的肝干细胞。11.根据权利要求1所述的方法，其中，在饲养细胞存在条件下进一步培养所述肝祖细胞。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述饲养细胞是胚胎或胎儿的细胞。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述饲养细胞是成血管细胞或肝星状前体细胞。14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述饲养细胞来自任何哺乳动物的组织。15.根据权利要求11所述的方法，其中，所述词养细胞来自与所述肝祖细胞相同的细胞类群。16.根据权利要求11所述的方法，其中，所述词养细胞是鼠源细胞。17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述饲养细胞是STO饲养细胞。18.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括不含血清的培养基。19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝祖细胞从成体肝脏中获得。20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述成体肝脏是成人的肝脏。21.根据权利要求2所述的方法，其中，所述层粘连蛋白的浓度约为0.1隱10jig/cm2。22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述层粘连蛋白的浓度约为0.5-5吗/cm2。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述层粘连蛋白的浓度约为0.5pg/cm2。24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述层粘连蛋白的浓度约为lpg/cm2。25.根据权利要求2所述的方法，其中，所述III型或IV型胶原的浓度各约为0.1-15fig/cm2。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述m型或IV型胶原的浓度各约为0.5-8吗/cm2。27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述m型或IV型胶原的浓度约为l-7pg/cm2。28.—种使肝祖细胞增殖的方法，其包括(a)提供含有从肝脏的干细胞区室中发现的第一细胞外基质组分的第一层；(b)提供含有从肝脏的干细胞区室中发现的第二细胞外基质组分的第二层；以及(c)在上述第一层和第二层之间培养分离出的肝祖细胞。29.—种用于肝祖细胞增殖的器皿，其包括(a)器皿，以及(b)含有在肝脏的干细胞区室中发现的至少一种细胞外基质组分的非可溶性材料，其中，该非可溶性材料基本上覆盖上述器皿的至少一个表面。30.根据权利要求29所述的器皿，其中，所述器皿是组织培养板、生物反应器、实验室培养池或实验室芯片。全文摘要本发明提供了一种使肝祖细胞在从肝脏的干细胞区室或小生境中发现的一种或多种细胞外基质组分上或其内部体外增殖的方法。本发明还提供了用于祖细胞增殖的器皿，其包括培养皿、生物反应器或实验室芯片。文档编号C12N5/074GK101384705SQ200680050921公开日2009年3月11日申请日期2006年11月15日优先权日2005年11月16日发明者兰德尔·E·麦克莱兰,洛拉·M·里德申请人:北卡罗来纳大学教堂山分校