树枝状人源性细胞穿膜肽hPP7K、生产及其介导质粒DNA转染的方法与流程

本发明涉及生物医学领域，涉及一种人源性细胞穿膜肽、生产及其介导质粒dna转染的方法。

背景技术：

现阶段，大多数疾病都需要在分子水平进行诊断治疗，而面对细胞膜，许多具有体外生物活性大分子药物无法进入细胞内，从而无法发挥其应有的作用。为克服大分子在体内的转运障碍，人们发展出各种技术。使用病毒载体，虽然转运效率高，但其潜在的毒性不可忽视。非病毒的方法，像电穿孔、显微注射等方法对细胞具有一定的创伤性，可能损伤甚至破坏细胞膜。而非侵袭性的方法如脂质体，要求在低酸环境下使膜失去稳定性从而释放药物进入胞浆，对人体生理环境中药物作用的研究具有一定的局限性。

近年来，作为新型药物载体的树枝状大分子越来越受到科学家的重视。树枝状大分子作为载体具有延长药物有效治疗浓度在血液循环中的保留时间、保护药物免受生物环境破坏、毒副作用小和使用方便等优点，从而显著提高了药物的利用率。20世纪90年代初，haensler等研究表明树枝状聚合物可进行高效的基因转移。树枝状大分子的表面高密度的氨基可与dna等生物大分子结合并在空间上高度压缩，作为非病毒型载体将dna和寡核苷酸等遗传物质高效输送到细胞中，从而具有调节反义抑制的功能。

在过去的几十年里，人们发现了一些肽和蛋白质能穿透细胞膜进入细胞内，而且多种运载分子也可以与这些肽和蛋白质连接并易位进入细胞内。这些肽和蛋白质载体构成一种新的很有潜力的药物运输载体，即细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides,cpps)，它是一大类由10-30个氨基酸组成的短肽，也称为蛋白转导域(proteintranslocationdomain,ptd)。这些肽分子不会产生细胞膜的永久性损伤，并且毒性低。特别是人源性穿膜肽(hcpp)，其与其他生物来源地cpps相比，hcpp引起人体的免疫反应的可能性比较小，潜在的不安全因素相对较少(如hpp10公开号：102863516a)，但对于hpp10来说，其介导质粒dna转染的效率较低，影响其作为药物胞内运载工具的应用前景。本发明结合树枝状大分子高效转染及hpp10低毒的优点，合成生产了一种新型的树枝状人源性细胞穿膜肽。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种树枝状人源性细胞穿膜肽、生产及其介导质粒dna转染方法，以克服现有穿膜肽存在的转染效率低、潜在不安全因素的不足。

为解决上述技术问题，本发明首先提除了一种新型的树枝状人源性细胞穿膜肽hpp7k，其氨基酸其序列表达如下：

本发明的树枝状人源性细胞穿膜肽hpp7k，能够与生物小分子共价或非共价作用相互结合，并携带生物小分子穿过细胞膜进入细胞。

所述树枝状人源性细胞穿膜肽hpp7k在c端或n端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或货物分子穿过细胞膜进入细胞。

优选的，所述标记物选自由荧光素、生物素、亲和基团所组成的组；

优选的，所述货物分子选自由糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子、纳米微球所组成的组。

本发明的树枝状人源性细胞穿膜肽hpp7k生产方法如下：

(1)称取一定量fmoc-arg(pbf)-wang树脂或h-arg(pbf)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至树脂溶胀，抽干；

(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量二甲基甲酰胺(dmf)，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；

(3)称取相当于树脂1～10倍摩尔量的每步投料的氨基酸，1～10倍摩尔量的碳二亚型缩合剂或苯并三唑鎓盐型缩合剂溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氢呋喃(thf)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；

(4)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；

(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；

(6)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；

(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到lys2-lys)2-lys-lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)将干燥后的肽-树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用tfa洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；

(9)运用hplc/ms或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽及加入了绿色荧光标记的多肽链hpp7k。

本发明的树枝状人源性细胞穿膜肽hpp7k的介导质粒dna转染方法如下：

(i)按照上述化学合成方法得到穿膜肽hpp7k，并将质粒pegfp或pdsred与上述穿膜肽分别混合于磷酸盐缓冲液(pbs)中；

(ii)计算质粒与穿膜肽含量间的n/p比(nh+3/po-4),调整两者间n/p比；

(ii)养过夜的细胞，用没有血清的培养基洗两次，加入质粒dna和穿膜肽复合物加入到500ul培养基中；

(iv)6小时候去掉培养基加含有10％fcs的新鲜培养基；

(v)静置1-4小时。

本发明主要具有以下优点和有益效果：

1)所述细胞穿膜肽hpp7k属于人源性细胞穿膜肽的改进与修饰，免疫原性低，安全低毒；

2)该穿膜肽hpp7k的穿膜效果显著，效率高于hpp10；

3)所述细胞穿膜肽hpp7k由固相合成而得，成本较低，便于质量管控。

可广泛用于生产药物、保健品、美容或护肤品、转染试剂或诊断试剂的实际应用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步具体说明。

图1为本发明穿膜肽hpp7k的轮状结构示意图；

图2为本发明穿膜肽hpp7k的螺旋、叠折结构示意图；

图3为本发明穿膜肽hpp7k与质粒dna以不同n/p比的条件下结合后琼脂电泳实验图；

图4为本发明穿膜肽hpp7k及hpp10分别与质粒dna在不同n/p比的条件下结合后，在bhk21细胞系中孵育4小时后绿色荧光效果图；

图5为本发明穿膜肽hpp7k及hpp10分别与质粒dna在不同n/p比的条件下结合后，在b16细胞系中孵育4小时后绿色荧光效果图；

图6为本发明穿膜肽hpp7k及hpp10在不同浓度范围内，在bhk21细胞系中孵育4小时后绿色荧光强度图；

图7为本发明穿膜肽hpp7k及hpp10在不同浓度范围内，在b16细胞系中孵育4小时后绿色荧光强度图；

图8为本发明穿膜肽hpp7k及hpp10在不同浓度范围内，在bhk21细胞系中孵育4小时后，经过mtt检测的细胞存活率结果图；

图9为本发明穿膜肽hpp7k及hpp10在不同浓度范围内，在b16细胞系中孵育4小时后，经过mtt检测的细胞存活率结果图；

具体实施方式

本发明的树枝状人源性细胞穿膜肽hpp7k的氨基酸其序列为：

树枝状人源性细胞穿膜肽hpp7k能够与生物小分子共价或非共价作用相互结合，并携带生物小分子穿过细胞膜进入细胞。

树枝状人源性细胞穿膜肽hpp7k在c端或n端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或货物分子穿过细胞膜进入细胞。标记物选自由荧光素、生物素、亲和基团所组成的组；货物分子选自由糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子、纳米微球所组成的组。

实施例1：

(1)称取一定量fmoc-arg(pbf)-wang树脂或h-arg(pbf)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至树脂溶胀，抽干；

(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量二甲基甲酰胺(dmf)，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；

(3)称取相当于树脂1倍摩尔量的每步投料的氨基酸，1倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(dcc))或苯并三唑鎓盐型缩合剂(如o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸盐(tbtu))溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氢呋喃(thf)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；

(4)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；

(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；

(6)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；

(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到lys2-lys)2-lys-lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用tfa洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；

(9)运用hplc/ms或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽及加入了绿色荧光标记的多肽链；

实施例2：

(1)称取一定量fmoc-arg(pbf)-wang树脂或h-arg(pbf)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至树脂溶胀，抽干；

(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量dmf，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；

(3)称取相当于树脂10倍摩尔量的每步投料的氨基酸，10倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(dcc))或苯并三唑鎓盐型缩合剂(如o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸盐(tbtu))溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氢呋喃(thf)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；

(4)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；

(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；

(6)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；

(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到lys2-lys)2-lys-lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用tfa洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；

(9)运用hplc/ms或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽及加入了绿色荧光标记的多肽链。

实施例3：

(1)称取一定量fmoc-arg(pbf)-wang树脂或h-arg(pbf)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至树脂溶胀，抽干；

(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量dmf，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；

(3)称取相当于树脂5倍摩尔量的每步投料的氨基酸，5倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(dcc))或苯并三唑鎓盐型缩合剂(如o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸盐(tbtu))溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氢呋喃(thf)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；

(4)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；

(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；

(6)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；

(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到lys2-lys)2-lys-lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用tfa洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；

(9)运用hplc/ms或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽及加入了绿色荧光标记的多肽链。

实施例4：

(1)称取一定量fmoc-arg(pbf)-wang树脂或h-arg(pbf)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至树脂溶胀，抽干；

(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量dmf，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；

(3)称取相当于树脂3倍摩尔量的每步投料的氨基酸，7倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(dcc))或苯并三唑鎓盐型缩合剂(如o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸盐(tbtu))溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氢呋喃(thf)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；

(4)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；

(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；

(6)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；

(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到lys2-lys)2-lys-lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用tfa洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；

(9)运用hplc/ms或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽及加入了绿色荧光标记的多肽链。

实施例5：

(1)称取一定量fmoc-arg(pbf)-wang树脂或h-arg(pbf)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至树脂溶胀，抽干；

(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量dmf，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；

(3)称取相当于树脂7倍摩尔量的每步投料的氨基酸，3倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(dcc))或苯并三唑鎓盐型缩合剂(如o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸盐(tbtu))溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氢呋喃(thf)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；

(4)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；

(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；

(6)将反应器中的溶液抽干，加适量dmf洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；

(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到lys2-lys)2-lys-lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用tfa洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；

(9)运用hplc/ms或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽及加入了绿色荧光标记的多肽链。

(10)按照上述化学合成方法得到穿膜肽hpp7k，并将质粒pegfp或pdsred与上述穿膜肽分别混合于磷酸盐缓冲液(pbs)中；

(11)计算质粒与穿膜肽含量间的n/p比(nh⁺3/po^-4),调整两者间n/p比分别为0、1、2、3、5、10、20、40、80；

(12)将上述调整好n/p比的混合液进行琼脂糖电泳实验，确定最优n/p比，结果如图3所示，n/p在5时，质粒与穿膜肽已结合的较好。

cpps一级结构、二级结构分析，预测、鉴定新型人源性cpps：

对本发明获得的细胞穿膜肽hpp7k的二级结构进行分析，采用了emboss的在线分析程序(其分析程序请参见网页：http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/pepwheel在线分析多肽的轮状结构；http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/在线分析二级结构的螺旋、叠折等)。hpp7k的轮状结构示意图，螺旋、叠折结构示意图分别如图1和图2所示。

穿膜肽hpp7k与质粒dna结合后的穿膜效果实验：

(1)本发明所合成穿膜肽hpp7k与pegfp或pdsred按0、5、10、20、40、80的n/p比混合，室温或者37℃孵育半个小时或一个小时；穿膜肽hpp10与pegfp或pdsred按0、5、10、20、40、80的n/p比混合，室温或者37℃孵育半个小时或一个小时。分别得到阳性对照组使用2000，实验方法按照说明书所示；

(2)实验细胞分别为bhk21和b16细胞系。培养细胞过夜，用没有血清的培养基洗两次，加入质粒dna和穿膜肽复合物加入到500ul培养基中；

(3)6小时候去掉培养基加含有10％胎牛血清的新鲜培养基；

(4)4小时后显微镜观察，在bhk21细胞系中，结果如图4所示，hpp7k与质粒dna在n/p比为5的条件下结合时，其已能将质粒dna带入胞内，且在n/p比为10时，其穿膜效率最高，但仍低于2000。而hpp10在n/p比为40时，其才能将质粒dna带入胞内，且穿膜效率远低于hpp7k。在b16细胞系中，结果如图5所示，与bhk21细胞系情况类似，hpp7k与质粒dna在n/p比为10的条件下结合时，其转染效率较高，但穿膜效率低于2000。而hpp10在n/p比为40时，其才能将质粒dna带入胞内，且穿膜效率远低于hpp7k。

(5)bhk21或b16细胞系细胞经上述处理4h后经流式细胞仪检测，得到荧光定量结果，在bhk21细胞系中，如图6所示，hpp7k在8um时，其荧光强度最强，且在0-16um的浓度范围内，其荧光强度均远远大于hpp10的荧光强度，但均小于2000；在b16细胞系中，如图7所示，hpp7k在8um时，其荧光强度最强，且在0-16um的浓度范围内，其荧光强度均远远大于hpp10的荧光强度，但均小于2000。

(6)综上所述，在chr1-6的系列穿膜肽中，chr5的细胞穿膜效率最优。

细胞毒性实验：

(1)取对数生长期培养细胞bhk21和b16，以每孔1×10⁴个细胞接种于96孔板，37℃，5％二氧化碳培养箱培养24小时，使细胞贴壁；

(2)至对数生长期，换成无血清的培养液，继续培养1小时；

(3)配置不同浓度的穿膜肽hpp7k及hpp10，同时设置三个阴性对照孔及阳性对照孔(2000)，阳性对照孔(2000)按照说明书操作进行实验。37℃，5％二氧化碳培养箱培养1-24h；

(4)孵育时间结束后，每孔加入pbs洗涤；

(5)贴壁细胞每孔加入20ulmtt(0.5％)，继续孵育4-6h之后弃掉培养液，每孔加入150uldmso(二甲基亚砜)，震荡10min；

(6)比色：选择490nm或570nm波长，在酶标仪免疫检测仪上测定光吸收值，处理数据得到细胞存活率，对于bhk21细胞系，结果如图8所示，本发明细胞穿膜肽hpp7k在1-16umol/l的浓度范围内，细胞存活率均高于阳性对照组和hpp10处理组；对于b16细胞系，结果如图9所示，本发明细胞穿膜肽hpp7k在1-16umol/l的浓度范围内，细胞存活率均高于阳性对照组，而与hpp10处理组差别不大。上述实验结果证明本发明涉及的细胞穿膜肽安全低毒，其毒性均低于2000，且各浓度的毒性变化不大，无浓度依赖性。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。