本发明涉及保健品制备技术领域，具体是一种具有抑制癌细胞作用的金枪鱼提取物。
背景技术：
众所周知，恶性肿瘤已成为威胁人类健康的主要疾病，其治疗也成为人们关注的热点之一。传统的化疗和放疗在治疗的同时，也产生严重的毒副作用。肿瘤的生物治疗是继传统疗法的第四种治疗手段，目前的研究已证实，生物治疗在肿瘤的治疗中发挥着愈来愈大的作用，并有望成为攻克肿瘤的疗法。
多肽从二十世纪初才开始受到关注，研究发现它区别于蛋白质区别于氨基酸，具有药物的作用。到了上个世纪九十年代才有了长足发展，在不断更新的技术指导下，多肽的应用范围越来越广，作用也越来越大，这才迈进了我们的生活，在我们生活中占据的份额越来越大，多肽类药物高效低毒特异性强具有区别于其他药物的特有优势，正不断影响着我们的生活。而且多肽潜力巨大，是生物科学发展的又一大突破和发展方向。
天然存在的海洋活性多肽由于在生物体中含量低，而且提取困难，难以实现大量生产供给所需，化学人工合成多肽成本昂贵。所以，人们更多地把目光投向开发蛋白酶解产物获得活性多肽这条途径上来。由于海洋生物生存的环境与陆地生物完全不同，如高压、低温、高温和高盐等极端环境，为了适应这些极端的海洋生物环境，海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，同时，海洋生物蛋白资源无论在种类和数量上都远远大于陆地蛋白资源，并且未得到很好的开发。种类繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就释放出有活性的肽段。海洋生物蛋白资源是21世纪人类重要的蛋白类食物及生物活性物质的重要来源。我国目前的海洋生物蛋白资源总量在世界各国名列前茅，但我国目前的蛋白类水产品中，除一部分直接食用外，大部分通过简单的加工技术制成食品进入市场，加工技术落后，产品结构单一，产品的附加值低，使得产品在国际市场上的竞争力较差。因此，我国急需对海洋生物蛋白资源进行优化利用和高值化加工。
现有技术如授权公告号为cn103333940b的中国发明专利，公开了一种利用带鱼制备二肽基肽酶iv抑制肽的方法，步骤包括：将带鱼加水绞碎成均匀的鱼肉浆；鱼肉浆放入酶解罐中，添加内切蛋白酶，搅拌水解4～12h，得水解液；升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；将水解液冷至40～60℃，添加外切蛋白酶，搅拌水解2～8h；升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；内切蛋白酶为木瓜蛋白酶、neutrase中性蛋白酶、alcalase碱性蛋白酶中的一种。外切蛋白酶为flavourzyme风味蛋白酶。将上述所得灭酶后的水解液离心取上清液；将上清液加入到超滤膜分离器中，调节超滤膜的压力为0.05～0.1mpa，超滤膜的截留分子量为3000da，收集超滤膜透过液；采用亲和层析方法分离纯化dpp-iv抑制肽。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，上述方法采用陆地上提取的蛋白酶对海洋生物进行酶解，酶解效率低。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能有效抑制癌细胞dna的复制，使癌细胞停留在细胞分裂间期的金枪鱼提取物。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：具有抑制癌细胞作用的金枪鱼提取物中含有氨基酸序列为hshacasyycrclvlhpcvncycrcsr的活性短肽。上述活性短肽可有效抑制癌细胞dna双螺旋结构的解旋，从而抑制癌细胞dna的复制，使癌细胞停留在细胞分裂间期；并且能促进e-钙黏蛋白的分泌，降低癌细胞的运动性，从而降低其转移的速度。
具有抑制癌细胞作用的金枪鱼提取物的制备方法，包括复合酶酶解、等电点沉淀、超滤和纳滤、hplc洗脱和冷冻干燥；复合酶酶解步骤为采用海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解金枪鱼鱼肉匀浆液，并采用超声波辅助酶解。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶同时对金枪鱼蛋白进行酶解，可得到大量有活性的肽段。
作为优选，复合酶酶解步骤中海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的加入量为1~2wt%，酶解温度为25~35℃，ph为7.0~9.0，酶解时间为50~70min。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，金枪鱼蛋白上有大量海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的酶切位点，酶解后可得到大量长短不同的肽链，酶解效率高。
作为优选，等电点沉淀步骤为调节酶解液的ph为6.0~6.5，静置后离心取沉淀。在上述ph值条件下，目的活性短肽呈电中性，在水中的溶解度快速下降，同时其活性未被破坏。
作为优选，超滤和纳滤步骤为用纯水将等电点沉淀得到的沉淀溶解，先用2-4kda的超滤膜加压超滤，再用纳滤膜纳滤去盐，浓缩滤液。通过超滤，对目的活性短肽进一步纯化。
作为优选，hplc洗脱步骤中洗脱步骤为0~5min，用1~3%三氟乙酸和98~99%乙腈洗脱，流速为0.8~1.5ml/min；5~15min，用5~7%三氟乙酸和93~95%乙腈洗脱，流速为0.8~1.5ml/min；15~30min，用8~12%三氟乙酸和88~92%乙腈洗脱，流速为0.8~1.5ml/min。根据活性短肽的极性设计洗脱液组分及洗脱操作，将对癌细胞有抑制作用的活性短肽与其他物质分离开来，对产品进行进一步纯化。
作为优选，hplc洗脱步骤中洗脱结束后收集在250nm有吸收的洗脱物，合并并浓缩。活性短肽在250nm处有较强吸收，可根据这个特性收集并富集活性短肽。
作为优选，冷冻干燥步骤为：预冻：-35~-45℃预冻3~5h；冷冻干燥：-45~-35℃，0~4pa冷冻干燥5~7h，-10~-5℃，6~14pa冷冻干燥1~2h；升华干燥：13~20℃，50~60pa升华干燥2~3h；解析干燥：5~10℃，3~5pa解析干燥2~4h，得到金枪鱼提取物。冻干整个过程都在程序的控制下，操作简单，工序简洁，自动化程度高，减少了人力、物力。低温下干燥能更好地保留活性短肽的活性；低压下干燥，活性短肽不易氧化，疗效更好；冻结时活性短肽形成“骨架”，干燥后保存原形，为多孔疏松结构且颜色基本不变，产品外观更加优良；复水性好，冻干活性短肽能迅速吸水还原成冻干前状态，使用方便；脱水彻底，活性短肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于长途运输和长期保存。
作为优选，冷冻干燥前加入40~50wt%辅料，辅料为甘露醇。上述辅料有利于产品成型，即防止在抽真空时药物与水蒸气一起飞散或成型时收缩。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，金枪鱼蛋白上有大量海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的酶切位点，酶解后可得到大量长短不同的肽链，酶解效率高；2）制备得到的活性短肽的纯度高，活性短肽可有效抑制癌细胞dna双螺旋结构的解旋，从而抑制癌细胞dna的复制，使癌细胞停留在细胞分裂间期；并且能促进e-钙黏蛋白的分泌，降低癌细胞的运动性，从而降低其转移的速度。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
具有抑制癌细胞作用的金枪鱼提取物中含有氨基酸序列为hshacasyycrclvlhpcvncycrcsr的活性短肽。上述活性短肽可有效抑制癌细胞dna双螺旋结构的解旋，从而抑制癌细胞dna的复制，使癌细胞停留在细胞分裂间期；并且能促进e-钙黏蛋白的分泌，降低癌细胞的运动性，从而降低其转移的速度。
具有抑制癌细胞作用的金枪鱼提取物的制备方法，包括复合酶酶解、等电点沉淀、超滤和纳滤、hplc洗脱和冷冻干燥；复合酶酶解步骤为采用海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解金枪鱼鱼肉匀浆液，并采用超声波辅助酶解。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶同时对金枪鱼蛋白进行酶解，可得到大量有活性的肽段。
复合酶酶解步骤中海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的加入量为1.5wt%，酶解温度为30℃，ph为8.0，酶解时间为60min。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，金枪鱼蛋白上有大量海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的酶切位点，酶解后可得到大量长短不同的肽链，酶解效率高。
等电点沉淀步骤为调节酶解液的ph为6.2，静置后离心取沉淀。在上述ph值条件下，目的活性短肽呈电中性，在水中的溶解度快速下降，同时其活性未被破坏。
超滤和纳滤步骤为用纯水将等电点沉淀得到的沉淀溶解，先用2-4kda的超滤膜加压超滤，再用纳滤膜纳滤去盐，浓缩滤液。通过超滤，对目的活性短肽进一步纯化。
hplc洗脱步骤中洗脱步骤为洗脱步骤为0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脱，流速为1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脱，流速为1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脱，流速为1ml/min。收集在250nm有吸收的洗脱物，合并并浓缩。根据活性短肽的极性设计洗脱液组分及洗脱操作，将对癌细胞有抑制作用的活性短肽与其他物质分离开来，对产品进行进一步纯化。
hplc洗脱步骤中洗脱结束后收集在250nm有吸收的洗脱物，合并并浓缩。活性短肽在250nm处有较强吸收，可根据这个特性收集并富集活性短肽。
冷冻干燥步骤为：预冻：-40℃预冻4h；冷冻干燥：-40℃，2pa冷冻干燥6h，-7℃，10pa冷冻干燥1.4h；升华干燥：16℃，56pa升华干燥2.4h；解析干燥：8℃，4pa解析干燥3h，得到金枪鱼提取物。冻干整个过程都在程序的控制下，操作简单，工序简洁，自动化程度高，减少了人力、物力。低温下干燥能更好地保留活性短肽的活性；低压下干燥，活性短肽不易氧化，疗效更好；冻结时活性短肽形成“骨架”，干燥后保存原形，为多孔疏松结构且颜色基本不变，产品外观更加优良；复水性好，冻干活性短肽能迅速吸水还原成冻干前状态，使用方便；脱水彻底，活性短肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于长途运输和长期保存。
冷冻干燥前加入40wt%辅料，辅料为甘露醇。上述辅料有利于产品成型，即防止在抽真空时药物与水蒸气一起飞散或成型时收缩。
实施例2：
具有抑制癌细胞作用的金枪鱼提取物中含有氨基酸序列为hshacasyycrclvlhpcvncycrcsr的活性短肽。上述活性短肽可有效抑制癌细胞dna双螺旋结构的解旋，从而抑制癌细胞dna的复制，使癌细胞停留在细胞分裂间期；并且能促进e-钙黏蛋白的分泌，降低癌细胞的运动性，从而降低其转移的速度。
具有抑制癌细胞作用的金枪鱼提取物的制备方法，包括以下步骤：
1）复合酶酶解：采用海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解金枪鱼鱼肉匀浆液，并采用28khz的超声波辅助酶解。海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的加入量为1.9wt%，酶解温度为32℃，ph为7.8，酶解时间为65min；
2）等电点沉淀：用1mol/l的稀盐酸调节酶解液的ph为6.2，静置2h后离心取沉淀；
3）超滤和纳滤：用2倍体积的纯水将等电点沉淀得到的沉淀溶解，先用3kda的超滤膜加压超滤，再用纳滤膜纳滤去盐，浓缩滤液；
4）hplc洗脱：洗脱步骤为0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脱，流速为1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脱，流速为1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脱，流速为1ml/min。收集在250nm有吸收的洗脱物，合并并浓缩；
5）冷冻干燥：预冻：-40℃预冻4h；冷冻干燥：-40℃，2pa冷冻干燥6h，-7℃，10pa冷冻干燥1.4h；升华干燥：16℃，56pa升华干燥2.4h；解析干燥：8℃，4pa解析干燥3h，得到金枪鱼提取物。冷冻干燥前加入45wt%辅料，辅料为甘露醇。
实施例3：
具有抑制癌细胞作用的金枪鱼提取物中含有氨基酸序列为hshacasyycrclvlhpcvncycrcsr的活性短肽。上述活性短肽可有效抑制癌细胞dna双螺旋结构的解旋，从而抑制癌细胞dna的复制，使癌细胞停留在细胞分裂间期；并且能促进e-钙黏蛋白的分泌，降低癌细胞的运动性，从而降低其转移的速度。
具有抑制癌细胞作用的金枪鱼提取物的制备方法，包括以下步骤：
1）复合酶酶解：采用海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解金枪鱼鱼肉匀浆液，并采用26khz的超声波辅助酶解。海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的加入量为1.8wt%，海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的质量比为1:2，酶解温度为30℃，ph为8.0，酶解时间为55min；
2）等电点沉淀：用1mol/l的稀盐酸调节酶解液的ph为6.2，静置2h后离心取沉淀；
3）超滤和纳滤：用2倍体积的纯水将等电点沉淀得到的沉淀溶解，先用3kda的超滤膜加压超滤，再用纳滤膜纳滤去盐，浓缩滤液；
4）hplc洗脱：洗脱步骤为0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脱，流速为1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脱，流速为1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脱，流速为1ml/min。收集在250nm有吸收的洗脱物，合并并浓缩；
5）冷冻干燥：预冻：-40℃预冻4h；冷冻干燥：-40℃，2pa冷冻干燥6h，-7℃，10pa冷冻干燥1.4h；升华干燥：16℃，56pa升华干燥2.4h；解析干燥：8℃，4pa解析干燥3h，得到金枪鱼提取物。冷冻干燥前加入45wt%辅料，辅料为甘露醇。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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2025