专利名称：一种人松弛素2前体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种新结构的人松弛素2前体的基因工程制备，具体涉及的是一种人松弛素2前体及其制备方法。背景技术：
松弛素属胰岛素家族，是由两条短肽链通过二硫键连接构成的短肽激素，具有软化生殖道组织、使趾骨联合分离以促进分娩、抑制子宫收缩、刺激乳腺生长与分化、调节卵泡发育、舒张血管、抗炎及促进伤口愈合、影响应激反应及食欲等生理作用。松弛素2可促进 THP-I细胞中cAMP含量的增加。近几年发现，人松弛素被发现在临床上还具有治疗心衰的作用，从而引起人们进一步的关注。目前发现，人的松弛素具有3种不同的氨基酸序列H1、H2和H3，其中H2是最主要的活性存在形式。人松弛素2是有AB两条链组成，其中A链由24个氨基酸残基构成，B链 29个氨基酸残基组成；A、B链之间有两对链间二硫键相连，A链内有一对链内二硫键，见图I。在人体中，松弛素是以松弛素原的状态分泌，其氨基酸一级结构是按B链、C链、A链的顺序排列，其中C链由108个氨基酸残基组成，松弛素原产生后由组织中的转化酶将C链切除后，形成成熟的松弛素。人体内松弛素主要是在妊娠期间由卵巢的黄体产生的，其组织来源很困难，临床上常常使用猪源的松弛素。人松弛素具有强烈地抗心衰作用的发现，极大地拓展了人松弛素的应用领域，并具有极大的市场需求，因此推动了人松弛素制备方法的研究。目前最为常见的制备方式是分别化学合成A和B肽链，然后再进行体外折叠，但因二硫键经常错配而造成产率较低，并且尚需二次纯化，使得化学合成人松弛素的成本较高。国内外也有用哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母等重组表达其前体的报道，但是表达量都较低。同时，多使用 ArgArgGluPheLysArg氨基酸序列作为C肽连接AB链，在将人松弛素前体加工成活性的松弛素时需要使用昂贵的TPCK-胰蛋白酶进行切割，同时也容易在AB链的Lys或Arg羧基端发生切割，而使重组蛋白招到破坏。陈历明等利用大肠杆菌表达天然人松弛素2原，分离纯化后得率约为2 3 mg/ L，但没有进一步加工和生物活性的报道。Yang等利用酵母表达人松弛素2，经大鼠耻骨联合分析证明其具有生物活性，纯化后的重组蛋白最高可达4(^g/L， 产量并不理想。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种人松弛素2前体，这种人松弛素2前体用于解决现有的人松弛素2前体在毕赤酵母中的分泌表达量低及其C肽切除费用昂贵的问题；本发明的另一个目的是提供这种人松弛素2前体的制备方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是这种人松弛素2前体使用 AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，这种人松弛素2前体的氨基酸序列如序列表中的序列I表示，命名为rhR2。上述方案中人松弛素2前体的基因序列如序列表中的序列2表示。
上述人松弛素2前体的制备方法利用基因重组技术，使用AsnGlyPheAsnGly人工C 肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，再根据表达宿主密码子的偏爱性和该人松弛素2前体氨基酸一级序列，使用酵母偏爱密码子优化该蛋白基因，再通过人工合成该基因序列，然后插入到毕赤酵母表达载体，在毕赤酵母中实现该人松弛素2前体的高效、分泌表达，并保持其天然N端结构。上述方案中人松弛素2前体的制备方法
一、rhR2基因的合成和表达载体pGAPZa -rhR2的构建
为了便于构建酵母表达载体，在rhR2基因上加入了 Xhol、XbaI限制性酶切位点、终止密码，并在XhoI后加入了 Kex2切割位点，然后人工化学合成图2所示的基因序列，将其连接到pUC-57克隆载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态，经lOOPg/mL Amp+抗性LB平板筛选， 获得阳性克隆；阳性克隆经lOOPg/mL Amp+抗性LB液体培养基过夜培养，然后使用质粒DNA 小提试剂盒提取其重组质粒；重组质粒和pGAPZ a A质粒分别经Xho I和Xba I双酶切，然后使用DNA凝胶回收试剂盒回收松弛素前体基因片段和pGAPZ α载体片段，两个回收片段再经Τ4 DNA连接酶于16°C连接IOh ;连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，经含25Pg/mL Zeocin的低盐LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆再经25Pg/mL Zeocin低盐LB液体培养基培养，使用质粒DNA小提试剂盒提取重组表达质粒；将经测序正确的重组表达质粒命名为 pGAPZa-rhR2 ；
二、转化筛选高表达的重组菌株
5-l(^g重组表达质粒pGAPZ a -rhR2经Avr II限制性内切酶线性化后，电转化SMDl 168 菌株,经lOOPg/mL Zeocin YPD抗性平板初步筛选重组酵母，获得的重组酵母再经40(^g/mL Zeocin YPD抗性平板复筛，将获得的高抗性重组酵母菌株接种于YPD培养基中，在30°C、 260rmp/min、72h震荡培养后，离心取上清，经进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析表达量，筛选出高效表达菌株，经Western Blot分析,表达产物可与兔子抗人Relaxin_2抗体发生特异性结合，在相对分子质量约6500处可见特异性反应条带；获得的最高表达量菌株命名为 G-rhR20上述方案中人松弛素2前体制备人松弛素的方法
一、种子液的准备
重组酵母G-rhR2在YPD平板上划线分离，30°C倒置培养48h ;提取单菌落，接种于50ml YPD培养液的250ml摇瓶中，30°C、260rmp/min、20h震荡培养；镜检酵母细胞形态正常无杂菌,2000rmp/min离心IOmin收集沉淀，按200ml YPD培养基IL的摇瓶中，30 °C、260rmp/ min、20h震荡培养，0D600达到4_6时，镜检酵母细胞形态正常无杂菌，即可作为种子培养液；
二、增值及分泌表达
将上述种子液接按I :10接种于已经灭绝的5L YPD罐培养基中，进行30°C发酵表达， 通过调节搅拌转速、罐压、空气流量，使溶氧量不低于20%，并保持该状态发酵48h ；
三、发酵液上清的获得及纯化
发酵结束后，4000rmp/min离新15分钟，收集上清液。上清液经O. 22 μ m滤膜过滤后， 经截流分子量30000的膜超滤收集滤过液，再经截流分子量3000的膜超滤回收浓缩液，采用50 mmol/L Tris-HCl pH7. 6洗涤超滤浓缩液2次，超滤浓缩组份上DEAE-FF柱，柱直径I.6cm,柱高 IOcm,洗脱液50mmol/L Tris-HCl, lmol/L NaCl,pH7. 6,流速5mL/min,收集穿透组分，真空低温浓缩；经直径为I. 0cm,高度为30cm的Sephadex G-50进一步分离,用浓度 10 mmol/L, pH 7. 6 的 PBS 洗脱,流速:lmL/min,收集主洗脱峰,进行 Tricine-SDS-PAGE 检测；
四、松弛素2前体C肽的切除
采用2mol/L pH8.0盐酸羟胺盐切割人松弛素前体的C肽，42°C 4h ;然后使用截流分子量3000的透析袋在10 mmol/L PBS透析液中10°C搅拌透析12h，透析液的pH值为7. 6，更换透析液4 5次；透析完成后，使用PEG20000包埋浓缩至一定体积，进行Tricine-SDS-PAGE 检测，O. 22 μ m膜过滤除菌，-20°C保存。外源蛋白表达水平的高低和诸多因素有关，如外源基因密码子本身、启动子、信号肽、表达系统种类、基因的拷贝数、宿主菌及发酵条件等。各种生物对基因密码子的使用有其偏爱性；很多实验证明，宿主细胞密码子的偏爱性极大地影响了外源蛋白的表达量; Cregg等和Kliman等对外源蛋白在酵母中的表达和密码子的使用做了详细的阐述。如果按照宿主细胞对密码子的偏爱性改造目的基因，即使只改造基因上连续出现的稀有密码子， 也将大幅度提高表达量。我们使用AsnGlyPheAsnGly这种人工C肽和经密码子优化后人工合成的基因，在毕赤酵母中实现了该松弛素2前体的高效分泌表达，表达量达到了 48(^g/ mL,远远高于Yang等的4(^g/L，完全优化的松弛素前体基因和C肽结构可能是主要原因。松弛素属于胰岛素家族，其结构和胰岛素极其相似。研究发现C肽的长短可能对胰岛素A、B链的重组表达产生影响。Thim等利用酵母表达系统对不同长度C肽的胰岛素原进行比较，发现C肽缩短后胰岛素原的达量上升。Kjeldsen等发现缩短C肽能提高单链胰岛素原的分泌水平，在C肽中加入芳香族氨基酸可以使胰岛素原的表达量提高5倍；因此我们根据这些在胰岛素高效表达上的发现，参照人松弛素2的肽链一级结构，并结合酵母的偏爱密码子，设计含短C肽的人松弛素2前体的cDNA序列,将其命名为rhR2。由于使用 ArgArgGluPheLysArg这种C肽所表达出的单链松弛素前体，需要使用胰蛋白酶酶切除去C 肽才能形成具有生物活性的成熟松弛素。由于胰蛋白酶酶切是在Lys和Arg的羧基端进行的，而松弛素肽链上有3个Lys (A9、A17、B9)和4个Arg (A18、A22、B13、B17)，并且从松弛素的空间结构(ID:3341)上来看，多在其亲水侧面；从理论上讲，胰蛋白酶极容易将这一重组肽链切碎，而无法获得所需结果；从Yang等的SDS-PAGE图中也可以看出，切除C肽后的重组蛋白呈弥散状，也证实了这一点。因此我们将C肽设计成AsnGlyPheAsnGly的目的是利用廉价的羟氨切除C肽，既可降低成本，又可避免肽链的非特异性切割。pPICZaA和pGAPZaA是常用的酵母分泌表达载体，pPICZaA是含有AOXl启动子的甲醇诱导型分泌表达载体，PGAPZaA含有GAP启动子的组成型分泌表达载体，它们仅启动子不同，这两个载体的信号肽后均含有Kex2和Stel3两个信号肽切除位点。pPICZaA和 pGAPZaA两种载体相比较而言，pGAPZaA在培养基成本和操作简便上更具有优势。异源基因可插入到这两个载体羧肽酶B (Kex2)或二肽基氨肽酶(Stel3)的识别位点之后，在表达时使用Kex2或Stel3切除信号肽，但这两个位点在蛋白表达时有所不同；只使用Kex2位点切除信号肽时，表达产物N端均一；如果将目的基因插入Stel3酶切位点后，信号肽切除时会出现Glu、Ala氨基酸切除不完全的问题，造成表达产物N端不均一的现象。为了保持表达产物天然N端的均一性和天然的N端氨基酸，我们将rhR2核苷酸设计序列的5’端和3’端
6分别加入Xho I和Xba I位点，并在Xho I后只使用Kex2的识别序列，并在Xba I前加上终止密码子。虽然毕赤酵母具有一定的糖基化能力，但从SDS-PAGE图中可以看出，我们表达的重组毒素以非糖基化形式存在，这与松弛素的氨基酸序列和空间结构有关。常规的SDS-PAGE分离分子量小于10 000的多肽效果较差，蛋白容易弥散不成带。 Tricine-SDS-PAGE凝胶分离蛋白质范围是100-10 000，可有效分离分子量较小的蛋白。我们根据人松弛素H2的氨基酸一级结构，设计带有人工C肽的松弛素2前体结构，并使用酵母菌的偏爱密码子，反向编码，人工合成松弛素2前体的基因，利用毕赤酵母具有较强的蛋白子后加工能力和分泌能力，在毕赤酵母中实现松弛素2前体的高效表达， 再经表达产物的提取、人工C肽的切除，获得促进THP-I细胞cAMP含量增加的重组松弛素 2。有益效果
本发明提供的人松弛素2前体及其优化的基因，使得人松弛素2前体在毕赤酵母中的分泌表达量大幅度提高；该人松弛素2前体的C肽切除使用廉价的羟胺，而不使用昂贵的 TPCK-胰蛋白酶，降低了 C肽切除成本；在毕赤酵母中分泌表达时，只使用Kex2信号肽切割位点，确保了人松弛素2前体 N端的均匀性，并保持其天然N端结构。在毕赤酵母中分泌表达时，使用组成型GAPl启动子的表达该人松弛素2前体，其表达量略高于使用甲醇诱导型AOXl启动子的表达量；与么(《1启动子相比，在毕赤酵母中使用GAPl启动子表达该人松弛素2前体还具有培养基成本低和操作简便的优势。四
图I现有人松弛素2的一级氨基酸组成结构示意图2本发明人松弛素2前体结构及合成基因序列示意图3表达产物的Tricine-SDS-PAGE分析；
图4表达产物的Western Blot鉴定；
图5纯化产物的Tricine-SDS-PAGE分析；
图6松弛素前体的C肽切除的Tricine-SDS-PAGE分析；
图7不同浓度重组松弛素对THP-I细胞的刺激活性。五具体实施例方式
这种人松弛素2前体使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，这种人松弛素2前体的氨基酸序列见序列1，命名为rhR2。本发明人松弛素2前体的基因序列见序列2。本发明人工C肽的氨基酸序列见序列表3。实施例I :
在毕赤酵母中利用GAPl启动子表达人松弛素2前体(rhR2)及其C肽切除。一、rhR2基因的合成和表达载体pGAPZ a -rhR2的构建。为了便于构建酵母表达载体，我们在rhR2基因上加入了 Xhol、XbaI限制性酶切位点、终止密码，并在XhoI后加入了 Kex2切割位点，然后人工化学合成图2所示的基因序列，，将其连接到pUC-57克隆载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态，经lOOPg/mL Amp+抗性LB平板筛选，获得阳性克隆；阳性克隆经lOOPg/mL Amp+抗性LB液体培养基过夜培养，然后使用质粒DNA小提试剂盒提取其重组质粒；重组质粒和pGAPZ a A质粒分别经Xho I和Xba I 双酶切，然后使用DNA凝胶回收试剂盒回收松弛素前体基因片段和pGAPZ α载体片段，两个回收片段再经Τ4 DNA连接酶于16°C连接IOh ;连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，经含 25μ§Μ Zeocin的低盐LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆再经25Pg/mL Zeocin低盐LB液体培养基培养，使用质粒DNA小提试剂盒提取重组表达质粒；我们将经测序正确的重组表达质粒命名为pGAPZ a-rhR2。本发明中人工化学合成图2所示的基因序列的技术为公知技术。二、转化筛选高表达的重组菌株。5-10μδ重组表达质粒pGAPZ a -rhR2经Avr II限制性内切酶线性化后，电转化 SMD1168菌株，经lOOPg/mL Zeocin YPD抗性平板初步筛选重组酵母，获得的重组酵母再经40(^g/mL Zeocin YPD抗性平板复筛，将获得的高抗性重组酵母菌株接种于YTO培养基中，在30°C、260rmp/min、72h震荡培养后，离心取上清，经进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析表达量，筛选出高效表达菌株，见图3，经Western Blot分析，表达产物可与兔子抗人 Relaxin-2抗体发生特异性结合,在相对分子质量约6500处可见特异性反应条带,见图4 ； 我们将获得的最高表达量菌株命名为S-rhR2。表达量经测定达48(^g/mL。三、重组人人松弛素2前体的发酵、纯化及C肽切除。I.种子液的准备。重组酵母S_rhR2在YPD平板上划线分离，30°C倒置培养48h ;提取单菌落，接种于50ml YPD培养液的250ml摇瓶中，30°C、260rmp/min、20h震荡培养；镜检酵母细胞形态正常无杂菌，2000rmp/min离心IOmin收集沉淀，按200ml YPD培养基IL的摇瓶中，30°C、 260rmp/min、20h震荡培养，0D_达到4_6时，镜检酵母细胞形态正常无杂菌，即可作为种子
培养液。2.增值及分泌表达。将上述种子液接按I :10接种于已经灭绝的5L YPD罐培养基中，进行30°C发酵表达，通过调节搅拌转速、罐压、空气流量，使溶氧量不低于20%，并保持该状态发酵48h。3.发酵液上清的获得及纯化。发酵结束后，4000rmp/min离新15分钟，收集上清液。上清液经O. 22 μ m滤膜过滤后，经截流分子量30000的膜超滤收集滤过液，再经截流分子量3000的膜超滤回收浓缩液，采用50 mmol/L Tris-HCl pH7. 6洗涤超滤浓缩液2次，超滤浓缩组份上DEAE-FF 柱，柱直径 I. 6cm,柱高 IOcm,洗脱液50mmol/L Tris-HCl, lmol/L NaCl, pH7. 6,流速 5mL/min,收集穿透组分,真空低温浓缩；经直径为I. 0cm,高度为30cm的Sephadex G-50 进一步分离，用浓度10 mmol/L, pH7. 6的PBS洗脱，流速lmL/min,收集主洗脱峰,进行 Tricine-SDS-PAGE 检测，见图 5。4.松弛素2前体C肽的切除。采用2mol/L pH8. O盐酸羟胺盐切割松弛素前体的C肽，42°C 4h ;然后使用截流分子量3000的透析袋在10 mmol/L PBS透析液中10°C搅拌透析12h，透析液的pH值为7. 6，更换透析液4 5次。透析完成后，使用PEG20000包埋浓缩至一定体积，进行 Tricine-SDS-PAGE检测，见图5，0. 22 μ m膜过滤除菌，_20°C保存。图6中I为切除C肽的重组松弛素2为重组松弛素2前体3为Marker。5.重组松弛素细胞活性的检测。使用改良型RPMI1640培养基培养THP-1细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔
150μ I (IXlO5 cells/well)，培养12h后，分别加入经培养基稀释切除C肽的重组松弛素 (111 2)，每孔2(^ 1，PBS 为空白对照，再分别加入 50ymol/L IBMS 和 I μ mol/L Forskolin, 37 °C CO2培养箱培养30min，离心移去培养基上清，经O. lmol/L HCl裂解细胞，37°C 30min,使用O. lmol/L NaOH进行中和后，经酶联免疫cAMP检测试剂盒检测各孔cAMP含量。 切除C肽的重组松弛素具使THP-I细胞cAMP含量增加的有生物活性，未切除C肽的重组松弛素前体活性较低，见图7。图7中I为空白对照，2为0. 5 ng/mL的hR2，3是Ing/mL hR2，4 是 5ng/mL 的 hR2, 5 是 5ng/mL hR2 前体。序列表I 〈110〉郭德军
〈120〉一种人松弛素2前体及其制备方法 〈160〉 3 〈210〉 I 〈211〉 58
〈212〉氨基酸序列 〈213〉人工序列 〈400〉 I
I Asp Ser Trp MET Glu Glu Val He Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu
16ValArgAlaGlnIleAlaIleCysGlyMetSerThrTrpSerAsn31GlyPheAsnGlyGlnLeuTyrSerAlaLeuAlaAsnLysCysCys46HisValGlyCysThrLysArgSerLeuAlaArgPheCys
序列表2 〈110〉郭德军
〈120〉一种人松弛素2前体及其制备方法
〈160〉 3
〈210〉 2
〈211〉 174
〈212〉DNA 序列
〈213〉人工序列
〈400〉 2
I GACTCTTGGA TGGAAGAAGT TATCAAGTTG TGTGGTAGAG AATTGGTTAG 51 AGCGCAAATC GCTATCTGTG GTATGTCTAC TTGGTCTAAC GGTTTCAACG 101 GTCAATTGTA CTCTGCTTTG GCTAACAAGT GTTGTCACGT TGGTTGTACT
151AAGAGATCTT TGGCTAGATT CTGT 序列表3 〈110〉郭德军
〈120〉一种人松弛素2前体及其制备方法〈160〉 3 〈210〉 3 〈211〉 5
〈212〉氨基酸序列 〈213〉人工序列 〈400〉 3
I Asn Gly Phe Asn Gly
权利要求
1.一种人松弛素2前体,其特征在于这种人松弛素2前体使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，这种人松弛素2前体的氨基酸序列如序列表中的序列I表示，命名为rhR2。
2.根据权利要求I所述的人松弛素2前体，其特征在于所述的人松弛素2前体的基因序列如序列表中的序列2表示。
3.—种权利要求I或2所述的人松弛素2前体的制备方法，其特征在于利用基因重组技术，使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，再根据表达宿主密码子的偏爱性和该人松弛素2 前体氨基酸一级序列，使用酵母偏爱密码子优化该蛋白基因，再通过人工合成该基因序列， 然后插入到毕赤酵母表达载体，在毕赤酵母中实现该人松弛素2前体的高效、分泌表达，并保持其天然N端结构。
4.根据权利要求3所述的人松弛素2前体的制备方法，其特征在于所述的人松弛素2 前体的制备方法具体如下一、rhR2基因的合成和表达载体pGAPZa -rhR2的构建为了便于构建酵母表达载体，在rhR2基因上加入了 Xhol、XbaI限制性酶切位点、终止密码，并在XhoI后加入了 Kex2切割位点，然后人工化学合成图2所示的基因序列，将其连接到pUC-57克隆载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态，经lOOPg/mL Amp+抗性LB平板筛选， 获得阳性克隆；阳性克隆经lOOPg/mL Amp+抗性LB液体培养基过夜培养，然后使用质粒DNA 小提试剂盒提取其重组质粒；重组质粒和pGAPZ a A质粒分别经Xho I和Xba I双酶切，然后使用DNA凝胶回收试剂盒回收松弛素前体基因片段和pGAPZ α载体片段，两个回收片段再经Τ4 DNA连接酶于16°C连接IOh ;连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，经含25Pg/mL Zeocin的低盐LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆再经25Pg/mL Zeocin低盐LB液体培养基培养，使用质粒DNA小提试剂盒提取重组表达质粒；将经测序正确的重组表达质粒命名为 pGAPZa-rhR2 ；二、转化筛选高表达的重组菌株5-l(^g重组表达质粒pGAPZ a -rhR2经Avr II限制性内切酶线性化后，电转化SMD1168 菌株,经lOOPg/mL Zeocin YPD抗性平板初步筛选重组酵母，获得的重组酵母再经40(^g/mL Zeocin YPD抗性平板复筛，将获得的高抗性重组酵母菌株接种于YI3D培养基中，在30°C、 260rmp/min、72h震荡培养后，离心取上清，经进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析表达量，筛选出高效表达菌株，经Western Blot分析,表达产物可与兔子抗人Relaxin_2抗体发生特异性结合，在相对分子质量约6500处可见特异性反应条带；获得的最高表达量菌株命名为 G-rhR20
5.根据权利要求I或2所述的人松弛素2前体制备人松弛素的方法，其特征在于所述的人松弛素2前体制备人松弛素的方法一、种子液的准备重组酵母G-rhR2在YPD平板上划线分离，30°C倒置培养48h ;提取单菌落，接种于50ml YPD培养液的250ml摇瓶中，30°C、260rmp/min、20h震荡培养；镜检酵母细胞形态正常无杂菌，2000rmp/min离心IOmin收集沉淀，按200ml YPD培养基IL的摇瓶中，30 °C、260rmp/ min、20h震荡培养，0D600达到4_6时，镜检酵母细胞形态正常无杂菌，即可作为种子培养液；二、增值及分泌表达将上述种子液接按I :10接种于已经灭绝的5L YPD罐培养基中，进行30°C发酵表达， 通过调节搅拌转速、罐压、空气流量，使溶氧量不低于20%，并保持该状态发酵48h ；三、发酵液上清的获得及纯化发酵结束后，4000rmp/min离新15分钟，收集上清液，上清液经O. 22 μ m滤膜过滤后， 经截流分子量30000的膜超滤收集滤过液，再经截流分子量3000的膜超滤回收浓缩液，采用50 mmol/L Tris-HCl pH7. 6洗涤超滤浓缩液2次，超滤浓缩组份上DEAE-FF柱，柱直径 I. 6cm,柱高 IOcm,洗脱液50mmol/L Tris-HCl, lmol/L NaCl,pH7. 6,流速:5mL/min,收集穿透组分，真空低温浓缩；经直径为I. Ocm,高度为30cm的Sephadex G-50进一步分离,用浓度 10 mmol/L, pH 7. 6 的 PBS 洗脱,流速:lmL/min,收集主洗脱峰,进行 Tricine-SDS-PAGE 检测；四、松弛素2前体C肽的切除采用2mol/L pH8.0盐酸羟胺盐切割松弛素前体的C肽，42°C 4h ;然后使用截流分子量 3000的透析袋在10 mmol/L PBS透析液中10°C搅拌透析12h，透析液的pH值为7. 6，更换透析液4 5次；透析完成后，使用PEG20000包埋浓缩至一定体积，进行Tricine-SDS-PAGE 检测，O. 22 μ m膜过滤除菌，-20°C保存。
全文摘要
本发明涉及的是一种人松弛素2前体及其制备方法，这种人松弛素2前体使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，这种人松弛素2前体的氨基酸序列如序列表中的序列1表示，命名为rhR2。本发明提供的人松弛素2前体及其优化的基因，使得人松弛素2前体在毕赤酵母中的分泌表达量大幅度提高；该人松弛素2前体的C肽切除使用廉价的羟胺，而不使用昂贵的TPCK-胰蛋白酶，降低了C肽切除成本。
文档编号C12N15/81GK102603888SQ20121010423
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者厉保秋, 王淑慧, 郭德军, 韩佳汕 申请人:郭德军