专利名称：一种人类松弛素-2 Relaxin的固相合成方法
技术领域：
本发明涉及一种人类松弛素-2的合成方法，特别涉及一种人类松弛素-2的固相合成方法。
背景技术：
人类松弛素-2，通常简称为RLN2，药物名称也被命名为Relaxin，即松弛肽，是人体内发现的一种多肽激素。人类松弛素-2由两条链组成，A链含M个氨基酸且存在链内二硫键，B链含四个氨基酸，A链与B链通过两个二硫键相连，其结构式如下
pGlu-Leu-Ty-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-C ^tI
H-Asp-Ser-Trp- Met-Glu-Glu-Val- Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg -Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH近年来的一系列研究发现，人类松弛素-2对心力衰竭等心血管疾病具有显著的治疗作用，能够扩张体循环血管、扩张肾脏血管并增加动脉顺应性。美国专利US5166191已公开了人类松弛素用于治疗心血管疾病尤其是急性和慢性心力衰竭的方法专利，中国专利文献CN1052655C(申请号89100947. 7，申请日1989. 02. 25，优先权日1988年2月洸日) 公开了一种用于调节哺乳动物生殖生理的含人类松弛素的液体制剂。人类松弛素-2的结构及分子量与人类胰岛素相似，分子量较大，且存在三个二硫键，因此，目前主要采用基因重组技术生产，美国专利US4758516已公开了编码人Relaxin H2的DNA。但是基因重组技术生产工艺复杂，耗时且费用昂贵，不利于人类松弛素-2的大量生产，无法满足市场需要。因此，需要研发人类松弛素-2的化学合成方法。多肽的化学合成方法目前有固相合成和液相合成两种，其中固相合成法用于多肽合成存在诸多优点简化并加速了多步骤合成的操作；反应在简单反应器皿中便可进行， 可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相连的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤完成中间的纯化，避免了液相多肽合成中冗长的重结晶或柱分离步骤，可避免中间体分离纯化时的损失；使用过量反应物，促使个别反应完全，以便终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚集；固相载体上的肽链和轻度交联的聚合链紧密混合，彼此产生相互的溶剂效应，对多肽自聚集热力学不利而对反应适宜。1991 年生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)发表的文献 “利用固相合成和位点定向的链组合全合成人类松弛素及人类松弛素衍生物”(Total
synthesis of human relaxin and human relaxin derivatives by solid-phase peptide synthesis and site-directed chain combination, 1991 年第 26 卷第 17 期第
10754-10761页)公开了一种人类松弛素_2的固相合成方法，该方法中，松弛素_2的A链采用Fmoc法合成，B链采用Boc法合成，合成过程需要采用HF处理两次，并且需要三步进行链的组合，不同的二硫键采用不同的保护基、不同的脱保护剂，因此操作极其复杂，并且产率很低，以使用的人类松弛素B链计算，总产率仅为1.4%。可以认为，从经济学上讲，其在大规模生产中不可接受。将松弛素-2的A链和B链随机组合可以使合成较为简单且产率较高。但是，据报道，RLXB水溶性极差，用Fmoc-氨基酸进行固相合成非常复杂。2010年，多肽科学杂志(Journal of Peptide kience)发表的文献“一种优 it^iΑΜ Μ -2 ^iit^^S^Tj^" (An optimized chemical synthesis of human relaxin-2,2010年第16卷第四期第200-211页)公开了一种人类松弛素_2的化学方法， 该方法中，松弛素-2的A链和B链均采用Fmoc法合成，二硫键的形成采用随机组合法，各个半胱氨酸的侧链采用同一保护基。这一方法可提高松弛素-2的产率，但产率仅为48%， 且松弛素-2的B链的合成工艺复杂，不利于工业化生产。迄今为止，单链小分子多肽的合成技术已经成熟，并且可利用多肽合成仪实现自动化合成，虽然松弛素-2的A链和B链的固相合成已经可以得到较好的收率，但是将A链和B链链接制备松弛素-2固相合成方法收率仍较低。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种步骤简便、收率高、适用于工业大规模生产的人类松弛素-2的固相合成方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种人类松弛素-2的固相合成方法，包括以下步骤1)单环A链的固相合成a、将Wang树脂在二氯甲烷中溶胀，用N-甲基吡咯酮洗涤树脂；b、以Wang树脂为载体，以1_氧_3_双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺按物质的量比1 3 1配制的混合液为偶联剂，以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，进行程序反应，依次进行缩合反应连接 Fmoc-Cys (4-MeBzl)-0H、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg (Pmc)-0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ser (Bzl)-OH、Fmoc-Arg (Pmc)-0H> Fmoc-Lys (Z)-OH、Fmoc-Thr (Bz1)-OH> Fmoc-Cys (Trt) -OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His (Bum) -OH、Fmoc-Cys (Acm) -OH、 Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Lys (Z)-OH、Fmoc-Asn (Tmob) -0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Ser (Bzl)-0H> Fmoc-Tyr (Bzl)-OH> Fmoc-Leu-OH 禾口 Fmoc-pGlu-OH 得 pGlu-Leu-Tyr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ala-Leu-Ala-Asn(Tmob)-Lys(Z)-Cys(Trt)-Cys(Ac m)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Arg(Pmc)-Ser(Bzl)-Leu-Ala-Ar g (Pmc) -Phe-Cys (4-MeBzl) _0_树脂，其中每次缩合反应中Fmoc保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为(1-2) 1，每次缩合反应中1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1 1;C、将 PGlu-Leu-Tyr(Bzl)-Ser (BzD-Ala-Leu-Ala-Asn (Tmob)-Lys (Z)-Cys (Trt )-Cys(Acm)-His (Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr (Bzl)-Lys(Z)-Arg (Pmc)-Ser (Bzl)-Leu-A Ia-Arg (Rnc)-Phe-Cys G-MeBzl)-O-树脂加入溴化氢和乙酸按体积比3 7配成的混合溶液中，室温下反应20分钟脱除Cys(Trt)的Trt保护基，将树脂抽干用二氯甲烷洗涤树月旨后，将 pGlu-Leu-Tyr z 1)-Ser (BzD-Ala-Leu-Ala-Asn (Tmob)-Lys (Z)-Cys CTrt)-Cys (Acm)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Arg(Pmc)-Ser(Bzl)-Leu-Ala-Ar g (Riic)-Phe-Cys G-MeBzD-O-树脂加入水、乙腈和二甲基亚砜按体积5 4 1配制的混合液，室温下搅拌4小时进行环化反应，其中溴化氢和乙酸的混合溶液用量为每克树脂使用4-9ml，水、乙腈、二甲基亚砜混合液的用量为每克树脂使用5ml ；d、保留CysG-MeBzl)的4_MeBzl保护基，脱除其他侧链保护基，将连接肽链的树脂加入三氟乙酸、硫代苯甲醚、苯酚、二巯基乙醇和水按体积70 8 10 5 7配制的混合溶液，静置2小时，制成存在链内单环的A链；2)B链的固相合成a、将Wang树脂在二氯甲烷中溶胀，用N-甲基吡咯酮洗涤树脂；b、以Wang树脂为载体，以IH-苯并三唑基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、1_羟基苯并三氮唑和1-2氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐按物质的量比为1 :1:4 配制的的混合液物为偶联剂，以盐酸胍、N，N-二甲基甲酰胺和乙醇按质量比为6 :1:7 配制的混合溶液为溶剂，进行程序反应，依次进行缩合反应连接FmOC-Ser(Bzl)-0H、 Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Thr (Bzl)-OH> Fmoc-Ser (Bzl)-OH> Fmoc-Met-OH> Fmoc-(Dmb) Gly-OH、Fmoc-Cys (4-MeBzl) -OH、Fmoc-IIe-OH> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-IIe-OH> Fmoc-Gln-OH、 Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Arg (Pmc)-0H> Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-(Dmb)Gly_0H、Fmoc-Cys(Acm) -0H> Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Lys (Z) -OH、Fmoc-11 e_0H、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc) -OH、Fmoc-Ser (Bzl) -OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH,得 H-Asp (OtBu )-Ser (Bzl)-Trp(Boc)-Met-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Z)-Leu-Cys(Acm)-(Dm b)Gly-Arg(Pmc)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pmc)-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys(4-MeBzl)-(D mb) Gly-Met-Ser (Bzl) -Thr (Bzl) -Trp (Boc) -Ser (Bzl) -O-树脂，其中每次缩合反应中 Fmoc 保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为(1-4) 1，每次缩合反应中IH-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1 1;c、将 H-Asp(OtBu)-Ser(Bzl)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Val-I Ie-Lys (Z)-Leu-Cys(Acm) - (Dmb)Gly-Arg (Pmc)-Glu (OtBu)-Leu-Val-Arg (Pmc)-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys(4-MeBzl)-(Dmb)Gly-Met-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Trp (Boc)-Ser (Bzl)-O-树脂脱除部分保护基制成 H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu -Cys-(Dmb)Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys(4-MeBzl)-(Dmb) Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-O-树脂，然后将连接肽链的树脂加入的三氟乙酸、硫代苯甲醚、 苯酚、二巯基乙醇和水按体积比为70 8 10 5 7配制的混合溶液，静置3小时，得 H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-(Dmb)Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Al a-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys(4-MeBzl)-(Dmb)Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH ；3)人类松弛素-2的化学合成将步骤1)与步骤2~)制备的肽链按物质的量比为 1 1.2溶于二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、三氟乙酸体积比1 1 3组成的溶剂系统搅拌均勻，室温静置1小时，然后勻速搅拌10小时，随后加入与的溶剂系统中三氟乙酸等体积的二氯甲烷，室温静置1-4小时，分离沉淀物，将沉淀物洗涤后溶于lOmol/L的盐酸胍溶液，然后加入体积比为5 95的三氟乙酸与水的混合溶液调节pH为3.0，用C18填料的半制备反相高效液相色谱柱纯化、洗脱、干燥即得。所述步骤1) b中Fmoc保护基采用体积比为1 4的六氢哌啶和N，N- 二甲基甲酰胺的混合溶液液振荡60分钟脱除；所述步骤1) d中Riic、Bzl、Ζ、Bum、Acm和Tmob保护基采用如下步骤脱除将连接多肽的树脂洗涤后加入到三甲基溴代硅烷、硫代苯甲醚、二氯甲烷和三氟乙酸按体积比为3 2 4.5 0.5配制的混合溶液中，10°C恒温静置2小时，然后将连接多肽的树脂洗涤干燥后加入到三氟乙酸、二氯甲烷、N-甲基吗啉和三乙基硅烷体积比为 5.5 2.0 1.5 1.0配制的混合溶液中，0°C恒温静置2小时；所述步骤2) b中Fmoc保护基采用体积比为1 4的六氢哌啶和N，N- 二甲基甲酰胺的混合溶液振荡60分钟脱除；所述步骤2) c中OtBu、Bzl、Boc、Ζ、Acm和Rnc保护基采用如下步骤脱除H-Asp(OtBu)-Ser(Bzl)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Z)-Leu-Cys(Acm) - (Dmb)Gly-Arg(Pmc)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pmc)-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile -Cys (4-MeBzl) - (Dmb) Gly-Met-Ser (Bzl) -Thr (Bzl) -Trp (Boc) -Ser (Bzl) -0-树脂洗涤后加入到三甲基溴代硅烷、硫代苯甲醚、二氯甲烷和三氟乙酸体积比为3 3 1.5 2. 5配制的混合溶液中，10°C恒温静置2小时，然后将连接多肽的树脂洗涤干燥后加入到三氟乙酸、 1，4-二硫代苏糖醇、N-甲基吗啉和三乙基硅烷体积比为7.0 1.0 0. 5 1.5配制的混合溶液中，0°C恒温静置4小时。所述程序反应包括以下步骤(1)将Fmoc保护氨基酸用溶剂溶解后加入树脂中，然后缓慢滴加缩合剂，室温搅拌3-5小时；(2)抽干，将树脂用二氯甲烷洗涤3次，每次洗涤中每克树脂使用5_7ml 二氯甲烷；(3)将步骤a中连接的Fmoc保护氨基酸的Fmoc保护基脱除，将树脂抽干，用二氯甲烷洗涤3次，每次洗涤中每克树脂使用5-7ml 二氯甲烷，抽干。本发明中所述的固相合成方法适用于传统的固相合成方法，也适于微波固相合成方法。本发明所用的术语偶联剂在部分技术文献中也称为缩合剂，是促进肽键形成所用的试剂，这对本领域的技术人员而言是显而易见的。本发明所用的术语侧链保护基是用于保护氨基酸侧链某些活性基团的物质，各种氨基酸侧链需要保护的活性基团及其保护基的种类，对本领域的技术人员而言是显而易见的。本发明所用的缩写具体含义如下Fmoc为芴甲氧羰基，4-MeBzl为甲基苄基，Bzl为苄基，Pmc为2，2，5，7，8_五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基，Z为苄氧羰基，Trt为三苯甲基，Bum为叔丁氧甲基，Acm为乙酰氨甲基，Tmob为2，4，6-三甲氧基苄基，Boc为叔丁氧羰基，Dmb为2，4-二甲氧基苄基，OtBu 为叔丁酯，PGlu为焦谷氨酸，Tyr为酪氨酸，Ser为丝氨酸，Asn为天冬酰胺，Cys为半胱氨酸，His为组氨酸，Val为缬氨酸，Gly为甘氨酸，Thr为苏氨酸，Lys为赖氨酸，Arg为精氨酸，Leu为亮氨酸，Phe为苯丙氨酸，Asp为天冬氨酸，Trp为色氨酸，Met为蛋氨酸，Glu为谷氨酸，Ile为异亮氨酸，Ala为丙氨酸，Gln为谷酰胺。本发明的技术方案中所使用的Fmoc 保护氨基酸在市场上均有销售，可以自行合成或直接使用市场上销售的产品。本发明中的1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐在多肽合成工艺中常简写为TBTU，1-羟基苯并三氮唑在多肽合成工艺中常简写为HOBt，N, N-二异丙基乙胺在多肽合成工艺中常简写为DIEA，N, N- 二甲基甲酰胺在多肽合成工艺中常简写为DMF，N-甲基吡咯酮在多肽合成工艺中常简写为NMP，IH-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐在多肽合成工艺中常简写为PyBOP。本发明人在人类松弛素-2的合成工艺研究中惊奇的发现，一种部分保护的A链ρ Glul-Leu-Ty-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys-Arg-Ser-L eu-Ala-Arg-Phe-Cys(4-MeBzD24-OH(Cys10 与 Cys15 之间通过二硫键连接)与一种部分保护的 B 链 H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-(Dmb)Gly-Arg-Glu-Leu-Va I-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys (4-MeBzl)-(Dmb) Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH 形成人类松弛素-2的产率相对较高，并且在本发明的反应条件下产率有显著提高。本发明的技术方案可使人类松弛素-2的产率达到74% -82% (实施例5中的产率为89. 2%，此处是不是说少了？)，且生产工艺简单，适于工业化大生产。本发明的技术方案中使用的Fmoc 保护氨基酸有利于上述部分保护的A链PGlul-Leu-Ty-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys(4-MeBzl)24-0H(Cys10 与 Cys15之间通过二硫键连接)及部分保护的B链H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Ly s-Leu-Cys-(Dmb)Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys(4-MeBzl)- (Dmb) Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH的生产，并有利于简化生产步骤、减少杂质的产生，有效地解决了人类松弛素-2的B链难以采用Fmoc策略完成固相合成并且合成工艺过于复杂的问题。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的解释。应当理解的是，以下实施例仅用于解释本发明，而不是限制本发明的保护范围。实施例1pGlu-Leu-Tyr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ala-Leu-Ala-Asn(Tmob)-Lys (Z)-Cys (Trt)-Cys (Acm)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Arg(Pmc)-Ser(Bzl)-Leu-Ala-Ar g (Pmc) -Phe-Cys (4-MeBzl) _0_ 树脂的固相合成(1)取50mmolWang树脂在二氯甲烷中溶胀，用N-甲基吡咯酮洗涤树脂。(2)取60mmol Fmoc-Cys G-MeBzl)-OH用适量N，N_ 二甲基甲酰胺溶解后，将溶液加入树脂中。取60mmol 1_氧_3_双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐、180mmol 1_羟基苯并三氮唑和60mmol N，N-二异丙基乙胺配制成溶液，然后将该溶液缓慢滴加到树脂与 Fmoc-Cys (4-MeBzl) -OH的混合体系中，室温搅拌3小时得到Fmoc-Cys (4-MeBzl) _0_树脂。(3)将Fmoc-Cys (4-MeBzl) _0_树脂抽干，二氯甲烷洗涤3次，每次洗涤中每克树脂使用5ml 二氯甲烷。(4)将Fmoc-Cys G-MeBzD-O-树脂加入到体积比为1 4的六氢哌啶和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液液振荡60分钟脱除Fmoc保护基，将树脂抽干，用二氯甲烷洗涤3次， 每次洗涤中每克树脂使用5ml 二氯甲烷，抽干。按照步骤⑵-⑷的程序，继续进行程序反应，依次缩合Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Arg (Pmc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser (Bzl) -OH> Fmoc-Arg (Pmc) -0H> Fmoc-Lys (Z)-OH、Fmoc-Thr (Bzl)-OH> Fmoc-Cys (Trt)-0H> Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH> Fmoc-Hi s(Bum)-OH、 Fmoc-Cys(Acm)-0H> Fmoc-Cys(Trt)-OH 、 Fmoc-Lys(Z)-OH、 Fmoc-Asn (Tmob)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser (Bzl) -0H> Fmoc-Tyr (Bzl) -OH、Fmoc-Leu-OH 和 Fmoc-pGlu-OH 得 pGlu-Leu-Tyr (Bzl) -Ser (Bzl) -Ala-Leu-Ala-Asn(Tmob)-Lys(Z)-Cys(Trt)-Cys(Acm)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl) -Lys (Z)-Arg (Pmc)-Ser(Bzl)-Leu-Ala-Arg(Pmc)-Phe-Cys(4-MeBzl)-O-树月旨。
程序反应中，各种氨基酸的用量如下表(表呢？):
实施例2线性A链的环化反应将 pGlu-Leu-Tyr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ala-Leu-Ala-Asn(Tmob)-Lys(Z)-Cys(Trt)-Cy s(Acm)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Arg(Pmc)-Ser(Bzl)-Leu-Ala-Ar g (Pmc) -Phe-Cys (4-MeBzl) _0_树脂加入溴化氢和乙酸按体积比3 7配成的混合溶液中， 溴化氢和乙酸的混合溶液用量为每克树脂使用4-9ml，室温下反应20分钟脱除Cys (Trt)的 Trt保护基，将树脂抽干用二氯甲烷洗涤树脂后，将pGlu-Leu-Tyr (Bzl) -Ser (Bzl) -Ala-Le u-Ala-Asn (Tmob)-Lys(Z)-Cys(Trt)-Cys(Acm) -Hi s (Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys (Z) -Arg (Pmc) -Ser (Bzl) -Leu-Ala-Arg (Pmc) -Phe-Cys (4-MeBzl) -O-树月旨力口入水、乙腈和二甲基亚砜按体积5 4 1配制的混合液，室温下搅拌4小时进行环化反应，其中溴化氢和乙酸的混合溶液用量为每克树脂使用4-9ml，水、乙腈、二甲基亚砜混合液的用量为每克树脂使用5ml。反应主产物结构式如下
权利要求
1. 一种人类松弛素-2的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤1)单环A链的固相合成a、将Wang树脂在二氯甲烷中溶胀，用N-甲基吡咯酮洗涤树脂；b、以Wang树脂为载体，以由1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐、 1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺三者按物质的量比1 3 1配制的混合液为偶联剂，以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，进行程序反应，依次进行缩合反应连接 Fmoc-Cys (4-MeBzl)-0H、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg (Pmc)-0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-0H> Fmoc-Lys (Z)-OH、Fmoc-Thr(Bzl)-0H> Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH> Fmoc-His (Bum)-OH、Fmoc-Cys (Acm) -0H> Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Lys (Z)-OH、Fmoc-Asn (Tmob) -0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser (Bzl)-OH> Fmoc-Tyr (Bzl)-OH、Fmoc-Leu-OH 禾口 Fmoc-pGlu-OH， 得 pGlu-Leu-Tyr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ala-Leu-Ala-Asn(Tmob)-Lys(Z)-Cys(Trt)-Cys(Ac m)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Arg(Pmc)-Ser (Bzl)-Leu-Ala-Ar g (Pmc) -Phe-Cys (4-MeBzl) _0_树脂，其中每次缩合反应中Fmoc保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为(1-2) 1，每次缩合反应中1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1 1;C、将 pGlu-Leu-Tyr (Bzl)-Ser(Bzl)-Ala-Leu-Ala-Asn(Tmob)-Lys(Z)-Cys(Trt)-C ys(Acm)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Arg(Pmc)-Ser(Bzl)-Leu-Ala -Arg (Rnc)-Phe-Cys G-MeBzl)-O-树脂加入由溴化氢和乙酸按体积比3 7配成的混合溶液中，室温下反应20分钟脱除Cys(Trt)的Trt保护基，将树脂抽干用二氯甲烷洗涤树月旨后，将 pGlu-Leu-Tyr z 1)-Ser (BzD-Ala-Leu-Ala-Asn (Tmob)-Lys (Z)-Cys CTrt)-Cys (Acm)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Arg(Pmc)-Ser (Bzl)-Leu-Ala-Ar g (Riic)-Phe-Cys G-MeBzl)-O-树脂加入由水、乙腈和二甲基亚砜按体积5 4 1配制的混合液，室温下搅拌4小时进行环化反应，其中溴化氢和乙酸的混合溶液用量为每克树脂使用4-9ml，水、乙腈、二甲基亚砜混合液的用量为每克树脂使用5ml ；d、保留CysG-MeBzl)的4_MeBzl保护基，脱除其他侧链保护基，将连接肽链的树脂加入由三氟乙酸、硫代苯甲醚、苯酚、二巯基乙醇和水按体积70 8 10 5 7配制的混合溶液，静置2小时，制成存在链内单环的A链；2)B链的固相合成a、将Wang树脂在二氯甲烷中溶胀，用N-甲基吡咯酮洗涤树脂；b、以Wang树脂为载体，以由IH-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、1_羟基苯并三氮唑和1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐按物质的量比为1 1 4配制的的混合液物为偶联剂，以由盐酸胍、N，N-二甲基甲酰胺和乙醇按质量比为6 :1:7 配制的混合溶液为溶剂，进行程序反应，依次进行缩合反应连接FmOC-Ser(Bzl)-0H、 Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Thr (Bzl)-OH> Fmoc-Ser (Bzl)-OH> Fmoc-Met-OH> Fmoc-(Dmb) Gly-OH、Fmoc-Cys (4-MeBzl) -OH、Fmoc-I Ie-OH> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-I Ie-OH> Fmoc-Gln-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pmc)-0H> Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu) -0H> Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Cys(Acm) -0H> Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Lys (Z)-OH、Fmoc—Ile—OH、Fmoc—Val—OH、Fmoc-Glu(OtBu) -0H> Fmoc-Glu (OtBu) -0H>Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Ser (Bzl)-OH> Fmoc-Asp (OtBu) -OH,得 H-Asp (OtB u)-Ser (Bzl)-Trp(Boc)-Met-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Val-Ile-Lys (Z)-Leu-Cys (Acm) - (Dm b)Gly-Arg (Pmc)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pmc)-Ala-Gln-Ile-Ala-11e-Cys(4-MeBz1)-(D mb) Gly-Met-Ser (Bzl) -Thr (Bzl) -Trp (Boc) -Ser (Bzl) -O-树脂，其中每次缩合反应中 Fmoc 保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为(1-4) 1，每次缩合反应中IH-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1 1;C、将 H-Asp (OtBu)-Ser(Bzl)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Z) -Leu-Cys(Acm) - (Dmb)Gly-Arg (Pmc)-Glu (OtBu)-Leu-Val-Arg (Pmc)-Ala-Gln-11e-Ala-11 e-Cys (4-MeBz 1) - (Dmb) Gly-Met-Ser (Bzl) -Thr (Bzl) -Trp (Boc) -Ser (Bzl) -O-树脂脱除部分保护基制成 H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-(Dmb)Gly-Arg-Glu-Le U-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys(4-MeBzl)-(Dmb)Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-O-树脂，然后将连接肽链的树脂加入由三氟乙酸、硫代苯甲醚、苯酚、二巯基乙醇和水按体积比为 70 8 10 5 7 配制的混合溶液，静置 3 小时，得 H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-V al-IIe-Lys-Leu-Cys-(Dmb)Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys (4_MeB zl)- (Dmb)Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH ；3)人类松弛素-2的化学合成将步骤1)与步骤幻制备的肽链按物质的量比为 1 1.2溶于由二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、三氟乙酸体积比1 1 3组成的溶剂系统搅拌均勻，室温静置1小时，然后勻速搅拌10小时，随后加入与溶剂系统中三氟乙酸等体积的二氯甲烷，室温静置1-4小时，分离沉淀物，将沉淀物洗涤后溶于lOmol/L的盐酸胍溶液，然后加入体积比为5 95的三氟乙酸与水的混合溶液调节pH为3.0，用C18填料的半制备反相高效液相色谱柱纯化、洗脱、干燥即得。
2.根据权利要求1所述的人类松弛素-2的固相合成方法，其特征在于所述步骤l)b 中Fmoc保护基采用体积比为1 4的六氢哌啶和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液液振荡60 分钟脱除。
3.根据权利要求1所述的人类松弛素-2的固相合成方法，其特征在于所述步骤l)d 中Rnc、Bzl、Z、Bum、Acm和Tmob保护基采用如下步骤脱除将连接多肽的树脂洗涤后加入到由三甲基溴代硅烷、硫代苯甲醚、二氯甲烷和三氟乙酸按体积比为3 2 4.5 0.5配制的混合溶液中，10°C恒温静置2小时，然后将连接多肽的树脂洗涤干燥后加入到由三氟乙酸、二氯甲烷、N-甲基吗啉和三乙基硅烷体积比为 5.5 2.0 1.5 1.0配制的混合溶液中，0°C恒温静置2小时。
4.根据权利要求1所述的人类松弛素-2的固相合成方法，其特征在于所述步骤2)b 中Fmoc保护基采用体积比为1 4的六氢哌啶和N，N- 二甲基甲酰胺的混溶液振荡60分钟脱除。
5.根据权利要求1所述的人类松弛素-2的固相合成方法，其特征在于所述步骤2)c 中OtBu、Bzl、Boc、Ζ、Acm和Rnc保护基采用如下步骤脱除H-Asp (OtBu)-Ser (Bzl)-Trp (Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Val-Ile-Lys (Z)-Leu-Cys(Acm) - (Dmb)Gly-Arg(Pmc)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg (Pmc)-Ala-Gln-Ile-Ala-11e-Cys (4-MeBz 1) - (Dmb) Gly-Met-Ser (Bzl) -Thr (Bzl) -Trp (Boc) -Ser (Bzl) -0-树脂洗涤后加入到由三甲基溴代硅烷、硫代苯甲醚、二氯甲烷和三氟乙酸体积比为3 3 1.5 2. 5配制的混合溶液中，10°C恒温静置2小时，然后将连接多肽的树脂洗涤干燥后加入到由三氟乙酸、 1，4-二硫代苏糖醇、N-甲基吗啉和三乙基硅烷体积比为7.0 1.0 0. 5 1.5配制的混合溶液中，0°C恒温静置4小时。
6.根据权利要求1所述的人类松弛素-2的固相合成方法，其特征在于所述程序反应包括以下步骤(1)将Fmoc保护氨基酸用溶剂溶解后加入树脂中，然后缓慢滴加缩合剂，室温搅拌3-5 小时；(2)抽干，将树脂用二氯甲烷洗涤3次，每次洗涤中每克树脂使用5-7ml二氯甲烷；(3)将步骤a中连接的Fmoc保护氨基酸的Fmoc保护基脱除，将树脂抽干，用二氯甲烷洗涤3次，每次洗涤中每克树脂使用5-7ml 二氯甲烷，抽干。
全文摘要
本发明公开了一种人类松弛素-2的固相合成方法，包括以下步骤1)单环A链的固相合成；2)B链的固相合成；3)人类松弛素-2的化学合成。采用本发明的方法生产人类松弛素-2，产率高，可达到74％-82％。本发明的方法生产步骤简便、生产过程中无杂质产生，有效地解决了人类松弛素-2的B链难以采用Fmoc策略完成固相合成并且合成工艺过于复杂的问题。
文档编号C07K1/06GK102180964SQ20111006236
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者厉保秋, 厉凌子 申请人:济南环肽医药科技有限公司