专利名称：人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白及构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说是人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白及构建方法。
背景技术：
细胞因子作为一种高效和特异的生物活性药在临床治疗中显示出巨大的潜力。为了得到更为有效的生物因子用于临床治疗，人们已经开始利用现有的技术手段改造和构建生物活性蛋白。目前国内外已报道了多种细胞因子融合蛋白，包括huGM-CSF-IL-3(PIXY321)，rhTpo/GM-CSF，Id/GM-CSF，IL-6/IL-2(CH925)，白细胞介素-2-乙肝表面抗原前S(IL-2-PreS)，hIL-7-GM-CSF(7-127)，GM-CSF/MCAF以及IL-6/IL-6R等多种融合蛋白，其中研究最为成熟的PIXY321已获FDA批准进入III期临床研究。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(huGM-CSF)由127个氨基酸残基组成，是一种已广泛应用于临床的造血细胞因子，它对各种原因引起的骨髓抑制和白细胞减少症疗效显著。GM-CSF目前在临床上的应用主要有以下几个方面(1)改善各种急性和慢性中性粒细胞减少状态，促进骨髓和外周血干细胞的扩增和转运；(2)在无或低中性粒细胞状态时诱导血液中的中性粒细胞增加，作为抗微生物感染的辅助治疗；(3)作为免疫刺激促进剂，与抗原或肿瘤疫苗一起应用，增强抗原或瘤苗的免疫原性，促进机体更快产生更强的免疫反应。(4)通过促进肿瘤细胞分化、补充白细胞数以增加化疗药物的效应和增强机体免疫能力达到抗肿瘤的目的。(5)另外，对于接受高剂量化疗和自身骨髓移植的患者，使用GM-CSF能够加速骨髓细胞的恢复，加速骨髓移植患者重建造血机能，增加存活率，阻止移植物的快速衰竭。
另外目前对GM-CSF融合蛋白研究得最为深入的有两种，一种是HuGM-CSF/IL-3融合蛋白(PIXY321)，另一种则是Hu GM-CSF/EPO融合蛋白。研究表明PIXY321对BFU-E，CFU-GM和CFU-GEMM的促生成作用是单独或联合使用Hu GM-CSF及IL-3的10倍到20倍。从目前对融合蛋白的一些研究结果来看，PIXY321或Hu GM-CSF/EPO比单个的细胞因子对造血细胞有着更强的综合促进作用。针对这两种蛋白所进行的临床研究表明它们对于癌症放、化疗和骨髓移植后造血功能的恢复有着更为明显的促进作用。
IL-6是分子量19～28kD的糖蛋白。IL-6的生物学效应是非常多样的。它能够增加B细胞免疫球蛋白的表达，使B细胞终末分化为浆细胞，并介入了多种免疫球蛋白的合成。
由于IL-6是一种多功能的造血刺激因子，因而在IL-6作为治疗血小板减少症，贫血和以及骨髓移植后造血功能重建药物的临床研究已经大量开展。
目前已经报道的有关IL-6的融合蛋白主要有两种，它们是IL-6/IL-6R和1L-6/IL-2。Takizawa等的研究表明IL-6R/1L-6融合蛋白(FP6)具有活化转录因子、STAT3以及丝分裂素活化蛋白激酶的潜能。Kimura等的研究结果则表明，与IL-3和SCF合用时，IL-6R/IL-6融合蛋白扩增PB来源的BFU-E和CFU-Mix的能力是混合使用sIL-6R和IL-6的两倍。IL-6R/IL-6融合蛋白与IL-3，SCF和/或FL或TPO混合使用时，能够诱导PB来源的造血祖细胞在体外更为有效的扩增，说明IL-6R/IL-6融合蛋白与混合使用sIL-6和IL-6相比能介导更强的细胞内信号传导。
综上所述，huGM-CSF和IL-6均具有众多的生物学功能和潜在的临床应用价值。但是就单个细胞因子而言，它们也存在一定的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供具有较高生物活性，能获得高效表达，并具有对人体造血功能恢复作用的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白及构建方法。
本发明根据现有技术对huGM-CSF和IL-6的研究，可以判断GM-CSF和IL-6这两种细胞因子既具有协同作用，又具有互补作用。GM-CSF和IL-6在骨髓干细胞的增殖分化中均起重要作用，它们具有共同的靶细胞，能共同刺激粒细胞-巨噬细胞系造血祖细胞的生长，使其获得更好的增殖效果。这说明IL-6是一种非常重要的造血系统调节因子，与GM-CSF协同作用具有更强的促增殖效果，另外，IL-6与GM-CSF合用还能够促进多潜能增殖祖细胞的增殖。它们的融合可能构成一种新的具有多重生物学功能的高效造血因子。
根据它们结构与功能来看，GM-CSF N端的1～13位氨基酸并非生物学活性所必需，且干扰与受体的结合。另外，GM-CSF的第9个氨基酸是脯氨酸，把它作为融合蛋白的第1个氨基酸有利于抵抗细菌内切酶的降解。而IL-6 N端的28个氨基酸对其活性也不是必需的，去除可提高其活性，而去除前23个氨基酸的IL-6，其相对活性能达到更高。为了利于融合蛋白的高效表达及高活性产物的获得，本发明设计了六种GM-CSF/IL-6融合蛋白基因序列，它们分别是GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)(简称GI1)，GM-CSF(9-127)-IL-6(1-184)(简称GI2)，GM-CSF(1-127)-IL-6(1-184)(简称GI3)，GM-CSF(9-127)-IL-6(24-184)(简称GI4)，1L-6(1-184)-GM-CSF(9-127)(简称IG1)，1L-6(24-184)-GM-CSF(9-127)(简称IG2)，其基因序列如下1、GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)atg ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgtctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtcatc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gagctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg accatg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgtgca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctgctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag ggt ggc tct gga tctggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct caa att cgg tac atc ctc gac ggcatc tca gcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agcaaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gatgga tgc ttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc actggt ctt ttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agtagt gag gaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttcctg cag aaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc acaaat gcc agc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atgaca act cat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agggct ctt cgg caa atg taa2、GM-CSF(9-127)-IL-6(1-184)atg ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgtctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtcatc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gagctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg accatg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgtgca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctgctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag ggt ggc tct gga tctggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct cca gta ccc cca gga gaa gat tccaaa gat gta gcc gcc cca cac aga cag cca ctc acc tct tca gaa cga att gacaaa caa att cgg tac atc ctc gac ggc atc tca gcc ctg aga aag gag aca tgtaac aag agt aac atg tgt gaa agc agc aaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctgaac ctt cca aag agg gct gaa aaa gat gga tgc ttc caa tct gga ttc aat gaggag act tgc ctg gtg aaa atc atc act ggt ctt ttg gag ttt gag gta tac ctagag tac ctc cag aac aga ttt gag agt agt gag gaa caa gcc aga gct gtg cagatg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttc ctg cag aaa aag gca aag aat cta gatgca ata acc acc cct gac cca acc aca aat gcc agc ctg ctg acg aag ctg caggca cag aac cag tgg ctg cag gac atg aca act cat ctc att ctg cgc agc tttaag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agg gct ctt cgg caa atg taa3、GM-CSF(1-127)-IL-6(1-184)atg gca cct gcc cgt tct ccg agc ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aatgcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag
atg aat gaa aca gta gaa gtc atc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acctgc cta cag acc cgc ctg gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc accaag ctc aag ggc ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cctcca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaagag aac ctg aag gac ttt ctg ctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtccag gag ggt ggc tct gga tct ggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct ccagta ccc cca gga gaa gat tcc aaa gat gta gcc gcc cca cac aga cag cca ctcacc tct tca gaa cga att gac aaa caa att cgg tac atc ctc gac ggc atc tcagcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agc aaa gaggca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gat gga tgcttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc act ggt cttttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agt agt gaggaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttc ctg cagaaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc aca aat gccagc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atg aca actcat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agg gct cttcgg caa atg taa4、GM-CSF(9-127)-IL-6(24-184)atg ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgtctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtcatc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gagctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg accatg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgtgca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctgctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag ggt ggc tct gga tctggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct cga att gac aaa caa att cgg tacatc ctc gac ggc atc tca gcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atgtgt gaa agc agc aaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agggct gaa aaa gat gga tgc ttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtgaaa atc atc act ggt ctt ttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aacaga ttt gag agt agt gag gaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtcctg atc cag ttc ctg cag aaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cctgac cca acc aca aat gcc agc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tggctg cag gac atg aca act cat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cagtcc agc ctg agg gct ctt cgg caa atg taa5、IL-6(1-184)-GM-CSF(9-127)atg cca gta ccc cca gga gaa gat tcc aaa gat gta gcc gcc cca cac aga cagcca ctc acc tct tca gaa cga att gac aaa caa att cgg tac atc ctc gac ggcatc tca gcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agcaaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gatgga tgc ttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc actggt ctt ttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agtagt gag gaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttcctg cag aaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc acaaat gcc agc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atgaca act cat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agggct ctt cgg caa atg ggt ggc tct gga tct ggc ggt tct gga tcc ggt ggc tctgga tct ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cggcgt ctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaagtc atc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctggag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttgacc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcctgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac tttctg ctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag taa6、IL-6(24-184)-GM-CSF(9-127)atg cga att gac aaa caa att cgg tac atc ctc gac ggc atc tca gcc ctg agaaag gag aca tgt aac aag agt aaa atg tgt gaa agc agc aaa gag gca ctg gcagaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gat gga tgc ttc caa tctgga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc act ggt ctt ttg gag tttgag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agt agt gag gaa caa gcc
aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttc ctg cag aaa aag gcaaag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc aca aat gcc agc ctg ctgacg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atg aca act cat ctc attctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agg gct ctt cgg caa atgggt ggc tct gga tct ggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct ccg agc actcag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac ctgagt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc atc tca gag atgttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gag ctg tac aag cagggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc TTg acc atg atg gcc agccac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag attatc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctg ctc gtc atc cccttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag taa上述1～6所述的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白的构建方法是应用PCR技术对huGM-CSF和huIL-6的基因分别加以改造，同时在二者之间加上连接肽序列(Gly-Gly-Ser-Gly-Ser)3[简称(G-G-S-G-S)3]。具体是将GM-CSF N端的8个氨基酸切除，将第9个氨基酸--脯氨酸作为融合蛋白的第1个氨基酸，构成GM-CSF(9-127)；将IL-6 N端的23个氨基酸切除构成IL-6(24-184)，以及将N端28个氨基酸切除构成IL-6(29-184)，然后与原来完整的GM-CSF(1-127)及IL-6(1-184)一起进行不同组合，为了最大程度的保持huGM-CSF及huIL-6的天然生物学活性，在两个蛋白连接处设置一个空间活动较大的连接肽而构成6种不同的融合蛋白。
以上所述的连接肽是由甘氨酸和丝氨酸(Gly-Gly-Ser-Gly-Ser)3构成的一个15个氨基酸的多肽。
克隆PCR产物，构建含有上述六种融合蛋白基因的pUC18质粒，并测序，测序结果表明，所构建的六种融合蛋白基因序列均与理论设计完全一致，进一步将融合蛋白基因克隆到pBV220载体，获得融合蛋白表达质粒，表达质粒分别导入E.coli DH5α和BL-21(Gold)中诱导表达，结果六种融合蛋白在两种宿主菌中均获得高效表达，它们在BL-21(Gold)宿主菌中的表达量均占总蛋白含量的30％以上，表达产物以包涵体的形式存在。
由于六种融合蛋白的理化性质相近，因而可以采用类似的纯化方案。六种融合蛋白的包涵体通过Q Sepharose H.P.8M尿素变性离子交换柱层析和Sephacryl S-200分子筛柱柱上复性和进一步纯化后均获得了高纯度的复性融合蛋白，其纯度均达到95％以上。
六种融合蛋白的纯化技术路线为1、超声破菌提包涵体收集诱导表达后的菌液，8000rpm离心10分钟收集菌体，按照10ml/g(V/W)将菌体细胞重悬于pH8.0的TE缓冲液中，洗菌体一次，8000rpm离心10分钟收集菌体，按6ml/g(V/W)将菌体重悬于pH8.0的TE缓冲液中，冰浴中超声破菌。超声条件为功率240W，超声时间30秒，间隔时间15秒，全程工作时间为30分钟。超声裂解液在4℃12000rpm离心15分钟，收集包涵体，用4mol/L尿素、2mol/L尿素、漂洗液(2％Triton X-100，0.5％ β-ME，0.5％NaCl)以及pH(8.0)的TE缓冲液分别漂洗一遍，4℃1200rpm离心15分钟收集包涵体。
2、重组融合蛋白的层析纯化(1)包涵体溶解物在变性条件下的离子交换层析纯化包涵体溶于A液(50mmol/L Tris·HCl，0.5％β-ME，8.0mol/L尿素，pH8.9)中，12000rpm离心5分钟，将上清以2.5ml/min流速上已用A液平衡好的Q Sepharose H.P.离子交换柱，冲平后用B液(0.6mol/L NaCl+A液)洗脱，从A液到B液的梯度洗脱时间为85分钟，洗脱流速为2.5ml/min，收集蛋白峰。
(2)Sephacryl S-200分子筛柱柱上复性和进一步纯化经Q Sepharose H.P.离子交换柱层析收集到的蛋白峰经SDS-PAGE电泳及活性鉴定后，将目的蛋白组分上已平衡好的Sephacryl S-200分子筛柱而得到复性和进一步纯化，平衡液为PBS(pH8.0)，0.2％Tween80，1.5mmol/LEDTA，流速为0.8ml/min，收集蛋白峰。
本发明的六种融合蛋白使用huGM-CSF依赖细胞株TF-1和huIL-6依赖细胞株B9并通过MTT法分别进行体外生物学活性测定，结果六种融合蛋白均具有GM-CSF和IL-6双重生物学活性。进一步以BALB/c系小鼠作为实验动物模型研究六种融合蛋白在体内的生物学活性，观察它们对环磷酰胺所致BALB/c系小鼠白细胞减少，血小板减少以及对造血功能损坏的影响，结果表明它们对环磷酰胺所致小鼠造血功能的损坏具有不同程度的恢复作用。另外，为了探讨所构建融合蛋白进一步运用的可能性，以小鼠作为动物模型进行了急性毒性预实验和最大耐受量实验，结果表明六种融合蛋白毒性均较低。
本发明成功地构建了六种融合蛋白的基因序列，并获得高效表达，探索出一条快速有效的纯化方案。从体内和体外两方面对融合蛋白的活性进行研究，并考察了融合蛋白在体内的毒性。为上述融合蛋白的进一步应用研究打下了良好的基础。
具体实施例方式
实施例1GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白基因序列为atg ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgtctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtcatc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gagctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg accatg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgtgca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctgctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag ggt ggc tct gga tctggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct caa att cgg tac atc ctc gac ggcatc tca gcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agcaaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gatgga tgc ttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc actggt ctt ttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agtagt gag gaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttcctg cag aaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc acaaat gcc agc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atgaca act cat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agggct ctt cgg caa atg taa以上融合蛋白按以下方法构建、表达和纯化应用PCR技术对huGM-CSF和huIL-6的基因分别加以改造将GM-CSF N端的8个氨基酸切除，构成GM-CSF(9-127)；将1L-6 N端的28个氨基酸切除构成IL-6(29-184)，用一连接肽(G-G-S-G-S)3将它们连接起来构建成GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)。
克隆PCR产物构建含有上述六种融合蛋白基因的pUC18质粒，进一步将融合蛋白基因克隆到pBV220载体，获得融合蛋白表达质粒，表达质粒分别导入E.coli DH5α和BL-21(Gold)中诱导表达，结果在两种宿主菌中均获得高效表达，它们在BL-21(Gold)宿主菌中的表达量均占总蛋白含量的30％以上，表达产物以包涵体的形式存在。
按以下技术路线纯化1、超声破菌提包涵体收集诱导表达后的菌液，8000rpm离心10分钟收集菌体，按照10ml/g(V/W)将菌体细胞重悬于pH8.0的TE缓冲液中，洗菌体一次，8000rpm离心10分钟收集菌体，按6ml/g(V/W)将菌体重悬于pH8.0的TE缓冲液中，冰浴中超声破菌。超声条件为功率240W，超声时间30秒，间隔时间15秒，全程工作时间为30分钟。超声裂解液在4℃12000rpm离心15分钟，收集包涵体，用4mol/L尿素、2mol/L尿素、漂洗液(2％Triton X-100，0.5％ β-ME，0.5％NaCl)以及pH(8.0)的TE缓冲液分别漂洗一遍，4℃1200rpm离心15分钟收集包涵体。
2、重组融合蛋白的层析纯化(1)包涵体溶解物在变性条件下的离子交换层析纯化包涵体溶于A液(50mmol/L Tris·HCl，0.5％β-ME，8.0mol/L尿素，pH8.9)中，12000rpm离心5分钟，将上清以2.5ml/min流速上已用A液平衡好的Q Sepharose H.P.离子交换柱，冲平后用B液(0.6mol/L NaCl+A液)洗脱，从A液到B液的梯度洗脱时间为85分钟，洗脱流速为2.5ml/min，收集蛋白峰。
(2)Sephacryl S-200分子筛柱柱上复性和进一步纯化经Q Sepharose H.P.离子交换柱层析收集到的蛋白峰经SDS-PAGE电泳及活性鉴定后，将目的蛋白组分上已平衡好的Sephacryl S-200分子筛柱而得到复性和进一步纯化，平衡液为PBS(pH8.0)，0.2％Tween80，1.5mmol/LEDTA，流速为0.8ml/min，收集蛋白峰。
在以上的进一步纯化后均获得了高纯度的复性融合蛋白，其纯度均达到95％以上。
实施例2GM-CSF(9-127)-IL-6(1-184)融合蛋白基因序列为atg ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgtctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtcatc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gagctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg accatg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgtgca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctgctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag ggt ggc tct gga tctggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct cca gta ccc cca gga gaa gat tccaaa gat gta gcc gcc cca cac aga cag cca ctc acc tct tca gaa cga att gacaaa caa att cgg tac atc ctc gac ggc atc tca gcc ctg aga aag gag aca tgtaac aag agt aac atg tgt gaa agc agc aaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctgaac ctt cca aag agg gct gaa aaa gat gga tgc ttc caa tct gga ttc aat gaggag act tgc ctg gtg aaa atc atc act ggt ctt ttg gag ttt gag gta tac ctagag tac ctc cag aac aga ttt gag agt agt gag gaa caa gcc aga gct gtg cagatg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttc ctg cag aaa aag gca aag aat cta gatgca ata acc acc cct gac cca acc aca aat gcc agc ctg ctg acg aag ctg caggca cag aac cag tgg ctg cag gac atg aca act cat ctc att ctg cgc agc tttaag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agg gct ctt cgg caa atg taa以上融合蛋白按以下方法构建、表达和纯化应用PCR技术对huGM-CSF和huIL-6的基因分别加以改造将GM-CSFN端的8个氨基酸切除，构成GM-CSF(9-127)；用一连接肽(G-G-S-G-S)3将它与完整的IL-6相连，构建成GM-CSF(9-127)-IL-6(1-184)。
表达和纯化与实施例1相同。
实施例3GM-CSF(1-127)-IL-6(1-184)融合蛋白基因序列为atg gca cct gcc cgt tct ccg agc ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aatgcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gagatg aat gaa aca gta gaa gtc atc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acctgc cta cag acc cgc ctg gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc accaag ctc aag ggc ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cctcca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaagag aac ctg aag gac ttt ctg ctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtccag gag ggt ggc tct gga tct ggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct ccagta ccc cca gga gaa gat tcc aaa gat gta gcc gcc cca cac aga cag cca ctcacc tct tca gaa cga att gac aaa caa att cgg tac atc ctc gac ggc atc tcagcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agc aaa gaggca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gat gga tgcttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc act ggt cttttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agt agt gaggaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttc ctg cagaaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc aca aat gccagc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atg aca actcat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agg gct cttcgg caa atg taa以上融合蛋白按以下方法构建、表达和纯化应用PCR技术对huGM-CSF和huIL-6的基因分别加以改造将完整的GM-CSF与完整的IL-6用一连接肽(G-G-S-G-S)3相连，构建成GM-CSF(1-127)-IL-6(1-184)。
表达和纯化与实施例1相同。
实施例4GM-CSF(9-127)-IL-6(24-184)融合蛋白基因序列为atg ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgtctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtcatc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gagctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg accatg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgtgca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctgctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag ggt ggc tct gga tctggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct cga att gac aaa caa att cgg tacatc ctc gac ggc atc tca gcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atgtgt gaa agc agc aaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agggct gaa aaa gat gga tgc ttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtgaaa atc atc act ggt ctt ttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aacaga ttt gag agt agt gag gaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtcctg atc cag ttc ctg cag aaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cctgac cca acc aca aat gcc agc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tggctg cag gac atg aca act cat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cagtcc agc ctg agg gct ctt cgg caa atg taa以上融合蛋白按以下方法构建、表达和纯化
应用PCR技术对huGM-CSF和huIL-6的基因分别加以改造将GM-CSFN端的8个氨基酸切除，构成GM-CSF(9-127)；将IL-6 N端23个氨基酸切除，构成IL-6(24-84)，用一连接肽(G-G-S-G-S)3将它们相连，构建成GM-CSF(9-127)-IL-6(24-184)。
表达和纯化与实施例1相同。
实施例5IL-6(1-184)-GM-CSF(9-127)融合蛋白基因序列为atg cca gta ccc cca gga gaa gat tcc aaa gat gta gcc gcc cca cac aga cagcca ctc acc tct tca gaa cga att gac aaa caa att cgg tac atc ctc gac ggcatc tca gcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agcaaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gatgga tgc ttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc actggt ctt ttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agtagt gag gaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttcctg cag aaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc acaaat gcc agc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atgaca act cat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agggct ctt cgg caa atg ggt ggc tct gga tct ggc ggt tct gga tcc ggt ggc tctgga tct ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cggcgt ctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaagtc atc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctggag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttgacc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcctgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac tttctg ctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag taa以上融合蛋白按以下方法构建、表达和纯化应用PCR技术对huGM-CSF和huIL-6的基因分别加以改造将完整的IL-6与N端切除8个氨基酸的GM-CSF(9-127)用一连接肽(G-G-S-G-S)3相连，构建成IL-6(1-184)-GM-CSF(9-127)-。
表达和纯化与实施例1相同。
实施例6IL-6(24-184)-GM-CSF(9-127)融合蛋白基因序列为atg cga att gac aaa caa att cgg tac atc ctc gac ggc atc tca gcc ctg agaaag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agc aaa gag gca ctg gcagaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gat gga tgc ttc caa tctgga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc act ggt ctt ttg gag tttgag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agt agt gag gaa caa gccaga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttc ctg cag aaa aag gcaaag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc aca aat gcc agc ctg ctgacg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atg aca act cat ctc attctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agg gct ctt cgg caa atgggt ggc tct gga tct ggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct ccg agc actcag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac ctgagt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc atc tca gag atgttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gag ctg tac aag cagggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg acc atg atg gcc agc
cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag attatc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctg ctc gtc atc cccttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag taa以上融合蛋白按以下方法构建、表达和纯化应用PCR技术对huGM-CSF和huIL-6的基因分别加以改造将IL-6N端23个氨基酸切除构成IL-6(24-184)；将GM-CSF N端的8个氨基酸切除，构成GM-CSF(9-127)；用一连接肽(G-G-S-G-S)3相连，构建成IL-6(24-184)-GM-CSF(9-127)。
表达和纯化与实施例1相同。
权利要求
1.一种人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白，其特征在于它的融合形式为GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)，其基因序列如下atg ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgtctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtcatc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gagctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg accatg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgtgca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctgctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag ggt ggc tct gga tctggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct caa att cgg tac atc ctc gac ggcatc tca gcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agcaaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gatgga tgc ttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc actggt ctt ttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agtagt gag gaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttcctg cag aaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc acaaat gcc agc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atgaca act cat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agggct ctt cgg caa atg taa
2.一种人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白，其特征在于它的融合形式为GM-CSF(9-127)-IL-6(1-184)，其基因序列如下atg ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgtctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtcatc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gagctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg accatg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgtgca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctgctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag ggt ggc tct gga tctggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct cca gta ccc cca gga gaa gat tccaaa gat gta gcc gcc cca cac aga cag cca ctc acc tct tca gaa cga att gacaaa caa att cgg tac atc ctc gac ggc atc tca gcc ctg aga aag gag aca tgtaac aag agt aac atg tgt gaa agc agc aaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctgaac ctt cca aag agg gct gaa aaa gat gga tgc ttc caa tct gga ttc aat gaggag act tgc ctg gtg aaa atc atc act ggt ctt ttg gag ttt gag gta tac ctagag tac ctc cag aac aga ttt gag agt agt gag gaa caa gcc aga gct gtg cagatg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttc ctg cag aaa aag gca aag aat cta gatgca ata acc acc cct gac cca acc aca aat gcc agc ctg ctg acg aag ctg caggca cag aac cag tgg ctg cag gac atg aca act cat ctc att ctg cgc agc tttaag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agg gct ctt cgg caa atg taa
3.一种人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白，其特征在于它的融合形式为GM-CSF(1-127)-IL-6(1-184)，其基因序列如下atg gca cct gcc cgt tct ccg agc ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aatgcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gagatg aat gaa aca gta gaa gtc atc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acctgc cta cag acc cgc ctg gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc accaag ctc aag ggc ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cctcca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaagag aac ctg aag gac ttt ctg ctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtccag gag ggt ggc tct gga tct ggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct ccagta ccc cca gga gaa gat tcc aaa gat gta gcc gcc cca cac aga cag cca ctcacc tct tca gaa cga att gac aaa caa att cgg tac atc ctc gac ggc atc tcagcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agc aaa gaggca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gat gga tgcttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc act ggt cttttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agt agt gaggaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttc ctg cagaaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc aca aat gccagc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atg aca actcat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agg gct cttcgg caa atg taa
4.一种人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白，其特征在于它的融合形式为GM-CSF(9-127)-IL-6(24-184)，其基因序列如下atg ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgtctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtcatc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gagctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg accatg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgtgca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctgctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag ggt ggc tct gga tctggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct cga att gac aaa caa att cgg tacatc ctc gac ggc atc tca gcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atgtgt gaa agc agc aaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agggct gaa aaa gat gga tgc ttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtgaaa atc atc act ggt ctt ttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aacaga ttt gag agt agt gag gaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtcctg atc cag ttc ctg cag aaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cctgac cca acc aca aat gcc agc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tggctg cag gac atg aca act cat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cagtcc agc ctg agg gct ctt cgg caa atg taa
5.一种人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白，其特征在于它的融合形式为IL-6(1-184)-GM-CSF(9-127)，其基因序列如下atg cca gta ccc cca gga gaa gat tcc aaa gat gta gcc gcc cca cac aga cagcca ctc acc tct tca gaa cga att gac aaa caa att cgg tac atc ctc gac ggcatc tca gcc ctg aga aag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agcaaa gag gca ctg gca gaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gatgga tgc ttc caa tct gga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc actggt ctt ttg gag ttt gag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agtagt gag gaa caa gcc aga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttcctg cag aaa aag gca aag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc acaaat gcc agc ctg ctg acg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atgaca act cat ctc att ctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agggct ctt cgg caa atg ggt ggc tct gga tct ggc ggt tct gga tcc ggt ggc tctgga tct ccg agc act cag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cggcgt ctc ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaagtc atc tca gag atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctggag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttgacc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcctgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac tttctg ctc gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag taa
6.一种人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白，其特征在于它的融合形式为IL-6(24-184)-GM-CSF(9-127)，其基因序列如下atg cga att gac aaa caa att cgg tac atc ctc gac ggc atc tca gcc ctg agaaag gag aca tgt aac aag agt aac atg tgt gaa agc agc aaa gag gca ctg gcagaa aac aac ctg aac ctt cca aag agg gct gaa aaa gat gga tgc ttc caa tctgga ttc aat gag gag act tgc ctg gtg aaa atc atc act ggt ctt ttg gag tttgag gta tac cta gag tac ctc cag aac aga ttt gag agt agt gag gaa caa gccaga gct gtg cag atg agt aca aaa gtc ctg atc cag ttc ctg cag aaa aag gcaaag aat cta gat gca ata acc acc cct gac cca acc aca aat gcc agc ctg ctgacg aag ctg cag gca cag aac cag tgg ctg cag gac atg aca act cat ctc attctg cgc agc ttt aag gag ttc ctg cag tcc agc ctg agg gct ctt cgg caa atgggt ggc tct gga tct ggc ggt tct gga tcc ggt ggc tct gga tct ccg agc actcag ccg tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac ctgagt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc atc tca gag atgttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gag ctg tac aag cagggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg acc atg atg gcc agccac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag attatc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctg ctc gtc atc cccttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag taa
7.根据权利要求1～6所述的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白的构建方法，其特征在于将GM-CSF N端的8个氨基酸切除，构成GM-CSF(9-127)；将IL-6 N端的23个氨基酸切除构成IL-6(24-184)，以及将N端28个氨基酸切除构成IL-6(29-184)，然后与原来完整的GM-CSF(1-127)及IL-6(1-184)一起进行不同组合，并在两个蛋白连接处设置一个空间活动较大的连接肽而构成6种不同的融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白的构建方法，其特征在于所述的连接肽是由甘氨酸和丝氨酸(Gly-Gly-Ser-Gly-Ser)3构成的一个15个氨基酸的多肽。
全文摘要
本发明是人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素－6融合蛋白及构建方法。融合蛋白为GM－CSF(9－127)－IL－6(29－184)，GM－CSF(9－127)－IL－6(1－184)，GM－CSF(1－127)－IL－6(1－184)，GM－CSF(9－127)－IL－6(24－184)IL－6(1－184)－GM－CSF(9－127)，IL－6(24－184)－GM－CSF(9－127)其构建方法是将GM－CSF N端的8个氨基酸切除，构成GM－CSF(9－127)；将IL－6 N端的23个氨基酸切除构成IL－6(24－184)，以及将N端28个氨基酸切除构成IL－6(29－184)，然后与原来完整的GM－CSF(1－127)及IL－6(1－184)一起进行不同组合，并在两个蛋白连接处设置一个空间活动较大的连接肽而构成6种不同的融合蛋白。它们具有较高生物活性，能获得高效表达，并具有对人体造血功能恢复作用。
文档编号C07K19/00GK1506377SQ0212797
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月7日 优先权日2002年12月7日
发明者孙强明, 戴长柏, 徐维明, 孙茂盛, 李亮助, 李鸿钊, 刘红岩, 谢天宏 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所