通过固相合成制备的肽的纯化的制作方法

专利名称：通过固相合成制备的肽的纯化的制作方法
通过固相合成制备的肽的纯化发明领域
本发明涉及用于纯化通过固相肽合成制备的肽的方法，包括用于所述方法的试 剂的试剂盒和通过所述方法获得的纯化肽。
发明背景
多肽越来越多地用作药剂用于治疗在所有主要治疗领域内的疾病。用于治疗应 用的多肽是待高度纯化的，以便有效且提供在施用于患者后不引起不利事件的确定性。
获得治疗肽的一种方法是通过固相肽合成。固相合成的产物是与不溶性载体结 合的肽。随后使以这种方式合成的肽与树脂切割开，并且分离经切割的肽。
为了避免固相肽合成方法中的副反应，胺基团在偶联反应过程中用氨基末端保 护基团(也称为N末端保护基团)掩蔽，其包括与氨基酸的α氨基偶联的化学部分。一 般地，氨基末端保护基团在将下一个氨基酸加入生长中的肽链前在脱保护反应中去除， 但当肽在固相合成过程中与载体切割开时可以维持。在洗涤或还以其他方式处理肽时， 氨基末端基团可以维持。
来自固相肽合成的粗肽混合物包括大量有机溶剂、试剂和方法相关杂质。通 常，肽混合物显示出高UV吸收，这干扰在层析控制方法中的线内UV测量。此外，大 部分杂质降低离子交换剂的能力并且难以完全去除。因此，即使在纯化后一般也存在杂 质水平。
9-芴甲氧羰基(Fmoc)是优选N末端保护基团的例子。Fmoc是碱敏感性N末 端保护基团，其可以通过碱与氨基酸脱偶联。
已知二苯富烯(DBF)在保护基团例如Fmoc的切割过程中产生，并且后续去除是 复杂且昂贵的。因此，非常需要在固相肽合成后的有效纯化方法。
发明概述
根据本发明的第一个方面，提供了用于纯化通过固相肽合成制备的肽的方法， 其包括使通过固相肽合成制备的肽的粗提取物与固体载体接触的步骤。
根据本发明的第二个方面，提供了固相肽合成试剂盒，其包括用于固相肽合成 的试剂、如本文定义的固体载体、和依照本文定义方法使用所述试剂盒的说明书。
根据本发明的第三个方面，提供了通过本文所述方法获得的肽。
附图简述


图1。通过经由固相合成制备的肽的控制纯化获得的层析谱。
图2。在包括聚乙烯的容器中通过固相合成制备的肽贮存后获得的层析谱。
图3。在100%乙醇的存在下通过固相合成制备的肽层析分离后获得的层析谱。
发明描述
下述是说明书中使用的术语的详细定义。
如本文使用的，术语“缓冲剂”指减少溶液例如层析溶液的pH随着时间过去 改变的趋势的化学化合物，否则将发生所述改变。缓冲剂包括下述非限制性例子乙酸 钠、碳酸钠、柠檬酸钠、甘氨酰甘氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、磷酸钠、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷、乙醇胺及其混合物。
如本文可互换使用的，术语“多肽”或“肽”意指由通过肽键连接的至少5个 组成成分氨基酸组成的化合物。组成成分氨基酸可以来自由遗传密码编码的氨基酸组， 并且它们可以是并非由遗传密码编码的天然氨基酸，以及合成氨基酸。22种编码(也 称为proteogenic)氨基酸是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨 酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲 硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。并非由遗传 密码编码但可以经由肽键掺入肽内的天然氨基酸可以指定为天然非proteogenic氨基酸， 并且是例如Y-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成非 proteogenic氨基酸包括通过化学合成制造的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-同 分异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(a-氨基异丁酸)、Abu(a_氨基丁酸)、 Tle(叔丁基甘氨酸)、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、氨基酸的β类似物例如β-丙 氨酸等、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同组氨酸、 Na-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2_吡 啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨 基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧 酸。
多肽可以包括单条肽链，或它可以包括超过一条肽链，例如其中2条链通过二 硫键连接的人胰岛素。
如本文使用的，术语“胰高血糖素样肽”指促胰岛素分泌肽(exendins)例如促 胰岛素分泌肽-3和促胰岛素分泌肽_4，以及除衍生自胰高血糖素前原基因的胰高血糖素 外的同源肽，即胰高血糖素样肽I(GLP-I)、胰高血糖素样肽2 (GLP-2)和胃泌酸调节素 (OXM)以及其类似物和衍生物。在吉拉毒蜥(Gilamonster)中发现的促胰岛素分泌肽与 GLP-I同源，并且也发挥促胰岛素效应。促胰岛素分泌肽的例子是促胰岛素分泌肽-4和 促胰岛素分泌肽_3。胰高血糖素样肽具有SEQ IDNos. 1-6中所示序列
胰高血糖素6EQ ID NO 1)；
GLP-I (SEQ ID NO 2)；
GLP-2 (SEQ ID NO 3)；
促胰岛素分泌肽-4 (SEQ ID NO 4)；
促胰岛素分泌肽-3 6EQ IDNO 5)；和
OXM (SEQ ID NO 6)。
如本文提及肽使用的术语“类似物”意指经修饰的肽，其中肽的一个或多个氨 基酸残基已由其他氨基酸残基置换和/或其中一个或更多个氨基酸残基已从肽中缺失， 和或其中一个或更多个氨基酸残基已加入肽中。氨基酸残基的此类加入或缺失可以在肽 的N末端上和/或在肽的C末端上发生。2种不同且简单的系统通常用于描述类似物 例如Arg34-GLP-I (7-37)或04R-GLP-1 (7-37)指定GLP-1类似物，其中在第；34位上天 然存在的赖氨酸已由精氨酸置换(根据IUPAC-IUB命名法使用的关于氨基酸的标准单或 三字母缩写)。关于其未陈述旋光异构体的所有氨基酸应理解为意指L-同分异构体。
在本发明的实施方案中，最大限度17个氨基酸已进行修饰。在本发明的实施方案中，最大限度15个氨基酸已进行修饰。在本发明的实施方案中，最大限度10个氨基 酸已进行修饰。在本发明的实施方案中，最大限度8个氨基酸已进行修饰。在本发明的 实施方案中，最大限度7个氨基酸已进行修饰。在本发明的实施方案中，最大限度6个 氨基酸已进行修饰。在本发明的实施方案中，最大限度5个氨基酸已进行修饰。在本发 明的实施方案中，最大限度4个氨基酸已进行修饰。在本发明的实施方案中，最大限度 3个氨基酸已进行修饰。在本发明的实施方案中，最大限度2个氨基酸已进行修饰。在 本发明的实施方案中，最大限度1个氨基酸已进行修饰。
如本文就肽而言使用的术语“衍生物”意指化学修饰的肽或其类似物，其中至 少一个取代基不存在于未修饰的肽或其类似物中，即已进行共价修饰的肽。一般的修饰 是酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化等。GLP-I (7-37)衍生物的例子是 NE26-((4S)-4-(十六酰氨基)-羧基-丁酰)[Arg34, Lys26]GLP-l-(7-37)。
如本文就肽而言使用的术语“其片段”意指具有亲本多肽至少20%氨基酸的肽 的任何片段。因此，对于人血清白蛋白，片段将包括至少117个氨基酸，因为人血清白 蛋白具有585个氨基酸。在一个实施方案中，片段具有亲本肽的至少35%氨基酸。在另 一个实施方案中，片段具有亲本肽的至少50%氨基酸。在另一个实施方案中，片段具有 亲本肽的至少75%氨基酸。
如本文就肽而言使用的术语“变体”意指经修饰的肽，其是亲本肽的类似物、 亲本肽的衍生物、或亲本肽类似物的衍生物。
如本文使用的，术语“GLP-1肽”意指GLP-I (7-37)、GLP_1 (7_37)的类似 物、GLP-I (7-37)的衍生物、或GLP-I (7-37)类似物的衍生物。
如本文使用的，术语“GLP-2肽”意指GLP-2(l-33)、GLP-2的类似物、 GLP-2(l-33)的衍生物、或GLP-2(l-33)类似物的衍生物。
如本文使用的，术语“促胰岛素分泌肽-4肽”意指促胰岛素分泌肽-4(1-39)、 促胰岛素分泌肽-4类似物、促胰岛素分泌肽-4衍生物、或促胰岛素分泌肽-4类似物的 衍生物。
如本文使用的，术语“血浆稳定的”胰高血糖素样肽例如GLP-I、GLP-2、胰 高血糖素、促胰岛素分泌肽-3或促胰岛素分泌肽-4意指化学修饰的胰高血糖素样肽， 即例如GLP-1、GLP-2、胰高血糖素、促胰岛素分泌肽-3或促胰岛素分泌肽-4的类似 物或衍生物，其在人中显示出至少10小时的体内血浆清除半衰期，如通过下述方法测定 的。用于测定胰高血糖素样肽在人中的血浆清除半衰期的方法是使化合物溶解于等渗 缓冲液，pH7.4，PBS或任何其他合适缓冲液中。剂量外周地优选在腹部或大腿上部内 注射。用于测定活性化合物的血样以频繁间隔并且以足够持续时间获得，以覆盖终末消 除部分(例如剂量前、剂量后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(天2)、36(天2)、 48 (天3)、60 (天3)、72 (天4)和84 (天4)小时)。活性化合物浓度的测定如Wilken 等人，Diabetologia 43 (51) A143，2000中所述执行。衍生的药代动力学参数通过使用 非区室法由关于每个个别受试者的浓度时间数据计算，使用商购可得的软件WinNonKn版 本2.lCPharsight，Cary, NC, USA)。终末消除速率常数通过对浓度时间曲线的末端对 数线性部分的对数线性回归进行估计，并且用于计算消除半衰期。
如本文使用的，术语“促胰岛素试剂”意指其为人GLP-I受体的激动剂的化合物，即在包含人GLP-I受体的合适培养基(一种此类培养基在下文公开)中刺激cAMP 形成的化合物。促胰岛素试剂的效力通过如下所述根据剂量应答曲线计算EC5tl值进行测定。
表达克隆人GLP-I受体(BHK-467-12A)的幼仓鼠肾(BHK)细胞在DMEM培 养基中生长，所述DMEM培养基添加有100IU/mL青霉素、lOOyg/mL链霉素、5%胎 牛血清和0.5mg/mL遗传霉素G_418 (Life Technologies)。细胞在磷酸盐缓冲盐水中洗涤 2次，并且用维尔烯(Versene)收获。通过用Ultraturrax在缓冲液1 QOmM HEPES-Na> IOmM EDTA，pH 7.4)中勻浆化由细胞制备质膜。使勻浆物在48,000 下在4°C下离心 15分钟。通过在缓冲液2(20mMHEPES_Na、O.lmMEDTA，pH 7.4)中勻浆化使团块悬 浮，随后在48,000 下在4°C下离心15分钟。洗涤操作再重复一次。使最终团块悬浮 于缓冲液2中，并且紧用于测定或贮存于-80°C下。
功能受体测定通过测量作为响应经由促胰岛素试剂刺激的环状AMP(cAMP)来 执行。所形成的 cAMP 通过 AlphaScreen cAMP Kit (Perkin Elmer Life Sciences)进行 定量。温育在一半面积96孔微量滴定板中在50μL缓冲液3(50mMTris-HCI、5mM HEPES> IOmMMgCl2, pH 7.4)总体积中执行且伴随下述添加ImM ATP、1 μ M GTP> 0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.01 % Tween-20、0.1 % BSA、6 μ g 膜制 剂、lSyg/mL受体珠、与6nM生物素基-cAMP预温育的20 μ g/mL供体珠。使待测 试激动剂活性的化合物在缓冲液3中溶解且稀释。新鲜制备GTP用于每次实验。使板 在黑暗中伴随缓慢搅拌在室温下温育3小时，随后为在Rision 仪器(Perkin Elmer Life Sciences)中计数。对于个别化合物描绘浓度应答曲线，并且使用4参数对数模型与Prism v.4.0 (GraphPad, Carlsbad, CA)估计 EC50 值。
如本文使用的，术语“DPP-IV保护的胰高血糖素样肽”意指与天然肽比 较进行化学修饰的胰高血糖素样肽，以使得所述胰高血糖素样肽对血浆肽酶二肽氨肽 酶-4 (DPP-IV)更有抵抗力。
肽对经由二肽氨肽酶IV降解的抵抗力通过下述降解测定法进行测定
使等分试样的肽(5nmol)在37°C下和与5mU酶促活性对应的1 μ L纯化二肽氨 肽酶IV在100 μ L 0.1Μ三乙胺-HCl缓冲液，pH 7.4中温育10-180分钟。酶促反应通 过加入5 μ L 10%三氟乙酸得到终止，并且使用HPLC分析使肽降解产物分离且定量。用 于执行这种分析的一种方法是
将混合物应用到Vydac C18 大孔(widepore) (30nm 孔，5 μ m 颗粒)250x4.6mm 柱上，并且以lml/分钟的流速用在0.1%三氟乙酸中的乙腈线性阶式梯度洗脱(0%乙腈3 分钟，0- %乙腈17分钟，24-48%乙腈1分钟)，根据Skgel等人，Regul.Pept.1999 ； 79: 93-102 和 Mentlein 等人 Eur.J.Biochem. 1993 ； 214 829-350 肽及其降解产物可以通 过其在220nm(肽键)或^Onm(芳香族氨基酸)下的吸光度进行监控，并且通过其与标 准那些相关的峰面积的积分进行定量。肽通过二肽氨肽酶IV的水解速率在导致小于10% 的肽被水解的温育时间下进行估计。
如本文使用的，术语“免疫调节的促胰岛素分泌肽-4化合物”意指这样的促胰 岛素分泌肽-4肽，与促胰岛素分泌肽-4 (1-39)比较，其是在人中具有减少的免疫应答的 促胰岛素分泌肽-4 (1-39)类似物或衍生物。用于评估免疫应答的方法是在患者治疗4周后测量对促胰岛素分泌肽-4化合物反应的抗体浓度。
如本文使用的，术语“胰岛素肽”意指其为人胰岛素、人胰岛素类似物或化学 修饰的人胰岛素的肽，即人胰岛素的衍生物或人胰岛素类似物。
如本文使用的，术语“人胰岛素”意指其结构和性质众所周知的人激素。人胰 岛素具有通过在半胱氨酸残基之间的二硫桥连接的2条多肽链，即A链和B链。A链是 21氨基酸肽，并且B链是30氨基酸肽，所述2条链通过3个二硫桥连接一个在A链的 第6和11位中的半胱氨酸之间，第二个在A链的第7位中的半胱氨酸和B链的第7位中 的半胱氨酸之间，并且第三个在A链的第20位中的半胱氨酸和B链的第19位中的半胱 氨酸之间。
如本文使用的，术语“多肽产物”意指待用于制造药物组合物的纯化肽产物。 因此，多肽产物通常作为来自最终纯化、干燥或条件处理步骤的产物获得。产物可以是 晶体、沉淀物、溶液或悬浮液。多肽产物在本领域中也称为原料药，即活性药学成分。
如本文使用的，术语“等电点”意指其中大分子例如多肽的净总电荷是零的pH 值。在可能存在许多荷电基团的多肽中，并且在等电点下，所有这些电荷的总和是零。 在高于等电点的pH下，多肽的净总电荷将是负的，而在低于等电点的pH值下，多肽的 净总电荷将是正的。
如本文使用的，术语“药学上可接受的”意指适合于正常药学应用，即在患者 中不产生不利事件。
如本文使用的，术语“赋形剂”意指通常加入药物组合物中的化学化合物，即 缓冲剂、张度剂、防腐剂等。
如本文使用的，术语“有效量”意指与不治疗比较，足以有效治疗患者的用量。
如本文使用的，术语“药物组合物”意指包括活性化合物或其盐连同药学赋形 剂例如缓冲剂、防腐剂和任选地张度改性剂和/或稳定剂的产物。因此，药物组合物在 本领域中也称为药物制剂。
如本文使用的，术语“疾病治疗”意指已发展疾病、病状或病症的患者的管理 和照顾。治疗目的是对抗疾病、病状或病症。治疗包括施用活性化合物以消除或控制疾 病、病状或病症，以及减轻与疾病、病状或病症相关的症状或并发症。
应当理解固相肽合成是本领域技术人员众所周知的。此外，保护基团与肽的偶 联和后续脱保护步骤也是本领域技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，固相肽合成包括使用Fmoc作为氨基末端保护基团。在一 个进一步的实施方案中，本发明的纯化方法包括用于从粗肽提取物中去除二苯富烯的方 法。在一个实施方案中，固相肽合成产物的脱保护步骤包括碱的使用。在一个进一步的 实施方案中，碱选自仲胺和/或能够氢解的试剂。在一个再进一步的实施方案中，碱选 自哌啶、二乙胺和哌嗪。
在一个实施方案中，固相肽合成产物的脱保护步骤在溶剂例如N-甲基吡咯烷酮 (NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)中执行。
在一个实施方案中，在脱保护步骤后获得的粗肽提取物的纯化包括将粗肽提取 物应用于固体载体，随后从其中洗脱纯化产物。
在一个实施方案中，固体载体包括离子交换层析柱。在一个进一步的实施方案 中，固体载体包括阴离子树脂或阳离子树脂。在一个再进一步的实施方案中，固体载体 包括选自 Source 30Q、Poros 50HQ、QSepharose HP> Q Ceramic HyperD F 的树脂。在一个再进一步的实施方案中，固体载体包括阴离子树脂(例如季铵树脂例如Source 30Q)。
在其中固体载体包括离子交换层析柱的本发明的一个实施方案中，本发明的纯 化方法包括下述步骤
(a)在标准层析条件下，用得自固相合成的粗肽提取物装载离子交换层析柱；
(b)用醇执行洗脱步骤；和
(c)用一种或更多种缓冲剂执行层析分离。
在一个实施方案中，在步骤(b)中的醇是CV5醇，即具有1-5个碳原子的醇。 在另一个实施方案中，醇是CV3醇。在一个实施方案中，醇是选自下述的未分支或分支 醇甲醇、乙醇、1-丙醇(丙醇)、2-丙醇(异丙醇)、2-甲基-1-丙醇(异丁醇)、 2-甲基-2-丙醇(叔丁醇)、1-丁醇(丁醇)、2-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁 醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、1-戊醇(戊醇)、2-戊醇和3-戊醇。在一个进 一步的实施方案中，醇选自乙醇和丙醇。在一个实施方案中，在步骤(b)中的醇选自 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇(在水中)和100%乙醇。在一个实施方案中，在步骤 (b)中的醇是100%乙醇。
本发明的这个实施方案提供了洗脱步骤(步骤(b))有效去除来自离子交换柱的 杂质的优点。例如，当Fmoc已在肽合成方法中用作N末端保护基团时，已惊奇地发现这 个步骤选择性洗脱二苯富烯。层析分离步骤(步骤(C))随后在不存在任何残留杂质(例 如二苯富烯)的情况下分离纯化肽，如本文证实的。
在步骤(c)中可以使用的缓冲剂的例子包括Tris(三(羟甲基)甲胺)、 TAPS(3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸、Bicine(N，N-二(2-羟乙基)甘氨 酸)、Tricine(N_三(羟甲基)甲基甘氨酸)、HEPES 羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)、 TES(2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸、MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸、PIPES(哌 嗪-N，N'-双O-乙磺酸))、Cacodylate ( 二甲基胂酸盐)、MES (2- (N-吗啉代)乙 磺酸)或乙酸盐。在一个实施方案中，在步骤(c)中使用的缓冲剂包括Tris缓冲剂(例 如缓冲至 pH 8.0 的 0.02mol/kg Tris)。
应当理解缓冲剂可以在步骤(C)中任选在一种或更多种溶剂(例如乙醇，例如 50% (w/w)乙醇)的存在下使用。还应当理解用于分离步骤(C)的条件一般是本领域 技术人员已知的那些。例如，用第一种缓冲液平衡，随后通过应用从第一种缓冲液到 第二种缓冲液(其一般将与第一种缓冲液相同，除一种或更多种盐(例如氯化钠，例如 0.0625mol/kg氯化钠)的存在外)的线性梯度洗脱。
在一个实施方案中，固体载体包括包含热塑性聚合物例如聚乙烯、聚丙烯、聚 苯乙烯或相似材料的包装材料，例如容器、粒状物、颗粒物或漏斗架。在另一个实施方 案中，固体载体包括包含聚乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯的包装材料，例如容器、粒状物、 颗粒物或漏斗架。在另外一个实施方案中，固体载体包括包含聚乙烯的包装材料，例如 容器、粒状物、颗粒物或漏斗架。
当在本文中使用时，术语“容器”应意指在纯化前或后用于包含待纯化肽的任何装置。
在其中固体载体包括包含热塑性聚合物的包装材料的本发明的实施方案中，本 发明的纯化方法包括下述步骤
(a)将得自固相合成的粗肽提取物加入包装材料中；
(b)使提取物在包装材料中温育；
(c)从包装材料中取出提取物；和
(d)对提取物实施标准肽分离。
当在本文中使用时，术语“标准肽分离”应意指适合于使肽与杂质分离的 本领域已知的任何分离法，例如层析分离(例如离子交换层析、疏水作用层析或反相 HPLC(高效液相层析))、超滤(UF)、等电沉淀或任何其他合适分离法。
在一个实施方案中，在步骤(d)中的标准肽分离是离子交换层析例如阴离子交 换层析。
提及“聚乙烯”、“聚丙烯”等包括提及由乙烯(IUPAC名称ethene)、丙烯 (IUPAC名称propene)等多个(即超过一个)单体单位组成的聚合物。为了例示，聚乙 烯的一般结构在下文作为式⑴的化合物显示，其中η是整数
(I)
聚乙烯可以以高密度聚乙烯(HDPE)或低密度聚乙烯(LDPE)的形式。在一个 实施方案中，聚乙烯是高密度聚乙烯(HDPE)。HDPE具有低分支度，并且因此具有更 强的分子间作用力和抗张强度，并且由大于或等于0.941g/cm3的密度限定。LDPE由 0.910-0.940g/cm3的强度范围限定。
聚丙烯可以以高密度聚丙烯(HDPP)或低密度聚丙烯(LDPP)的形式。在一个 实施方案中，聚丙烯是高密度聚丙烯(HDPP)。
本发明的这个实施方案提供了给限定包装材料添加粗肽提取物导致杂质与包装 材料表面附着的优点。因此，该方法有效去除来自粗肽提取物的杂质。例如，当Fmoc 已在肽合成方法中用作N末端保护基团时，已惊奇地发现这个步骤使二苯富烯与聚乙烯 包装材料表面选择性附着，如本文证实的。
在一个实施方案中，温育步骤(b) —般包括在环境温度(例如室温)下温育2分 钟-10小时的持续时间。在另一个实施方案中，持续时间是2分钟-2小时。在另外一 个实施方案中，持续时间是2分钟-30分钟。
在一个实施方案中，步骤(b)可以另外包括提取物的搅拌。
在一个实施方案中，步骤(d) —般包括依照已知操作的层析分离，其可以包括批吸附、填充柱或滤器。
在一个实施方案中，步骤(d)包括层析分离，其中使用填充柱或滤器，并且其 中停留时间是至少0.1分钟。在另一个实施方案中，停留时间是至少1分钟。在另外一 个实施方案中，停留时间是0.1分钟-60分钟。在另外一个实施方案中，停留时间是0.1 分钟-10分钟。
当在本文中使用时，术语“停留时间”应理解为肽与包装材料接触的平均时 间，即肽如何快速地移动通过包装材料。
在本发明的一个实施方案中，多肽是胰高血糖素样肽。
在本发明的一个实施方案中，胰高血糖素样肽是DDP-IV保护的胰高血糖素样 肽。
在本发明的一个实施方案中，胰高血糖素样肽是血浆稳定的胰高血糖素样肽。
在本发明的一个实施方案中，胰高血糖素样肽具有赖氨酸残基，例如一个赖氨 酸，其中亲脂取代基任选经由间隔物与所述赖氨酸的ε氨基附着。
在一个实施方案中，亲脂取代基包括酰基基团。酰基基团具有式R(C = 0)_。
在本发明的一个实施方案中，亲脂取代基具有8-40个碳原子，优选8-M个碳原 子，例如12-18个碳原子。
在一个实施方案中，本发明提供了包括亲脂取代基的胰高血糖素样肽的衍生 物，其中所述亲脂取代基包括直链或分支烷烃α，ω-二羧酸。
在一个实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案的胰高血糖素样肽，其 中亲脂取代基是或包括选自下述的部分CH3-(CH2)n-CO_、(COOH)-(CH2)n-CO_、 (COOH)-(CH2)n-CO-NH-(CH2) m-R-CO_、(NH2-CO)-(CH2)n-CO-禾口 HO-(CH2) n-CO-；其中R是选自环戊基、环己基和环庚基的环烷基，4《n《38和0《m《4。
在一个实施方案中，12《n《36。在一个实施方案中，12《n《20。
在一个实施方案中，亲脂取代基选自CH3-(CH2)n-CO_、(COOH)-(CH2) n-CO_、(COOH)-(CH2)n-CO-NH-(CH2) m-R-CO_、(NH2-CO) _ (CH2) n-CO_、 HO-(CH2)n-CO-；其中R是选自环戊基、环己基和环庚基的环烷基，4《n《38和l《m《4。
在一个实施方案中，亲脂取代基选自CH3-(CH2)n-CO_、(COOH)-(CH2) n-CO_、(COOH)-(CH2)n-CO-NH-(CH2) m-R-CO_、(NH2-CO) _ (CH2) n-CO_、 HO-(CH2)n-CO-；其中 R 是环己基，12<n<20 和 l<m<20
一个或更多个亲脂取代基可以直接或经由合适间隔物与活性组分连接。在一个 实施方案中，亲脂组分经由合适间隔物附着。
在一个实施方案中，间隔物存在并且包括至少一个氨基酸残基。
在本发明的一个实施方案中，间隔物存在并且选自氨基酸，例如β-Ala、L-Glu 或氨基丁酰基。
在一个实施方案中，间隔物存在并且选自Y-或α-谷氨酰接头、β-或α-天 冬氨酰接头、α-酰氨基-Υ-谷氨酰接头、或α-酰氨基-β-天冬氨酰接头、或其组I=I O
在一个实施方案中，间隔物具有通式I
权利要求
1.一种用于纯化通过固相肽合成制备的肽的方法，其包括使通过固相肽合成制备的 肽的粗提取物与固体载体接触的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所述固相肽合成包括使用Fmoc作为氨基末端保护基团。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法包括用于从所述粗肽提取物中去除二苯 富烯的方法。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述固体载体包括包含热塑性聚合物的包 装材料。
5.根据权利要求4的方法，其中所述固体载体选自容器、粒状物、颗粒物和漏斗架。
6.根据权利要求4或5的方法，其中所述热塑性聚合物是聚乙烯或聚丙烯。
7.根据权利要求4-6中任一项的方法，其包括下述步骤(a)将得自固相合成的所述粗肽提取物加入所述包装材料中；(b)使所述提取物在所述包装材料中温育；(c)从所述包装材料中取出所述提取物；和(d)对所述提取物实施标准肽分离。
8.根据权利要求7的方法，其中在步骤(d)中的所述标准肽分离是离子交换层析。
9.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述固体载体包括离子交换层析柱。
10.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述固体载体包括阴离子交换层析柱。
11.根据权利要求9或10中任一项的方法，其包括下述步骤(a)在标准层析条件下，用得自固相合成的所述粗肽提取物或得自权利要求7的方法 中步骤(a)-(c)的肽装载所述离子交换层析柱；(b)用醇执行第一个洗脱步骤；和(c)用一种或更多种缓冲剂执行第二个洗脱步骤。
12.根据权利要求11的方法，其中在步骤(C)中使用的缓冲剂包括Tris(三(羟甲基) 甲胺)、TAPS(3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸、BiCine(N，N-二(2-羟乙基)甘 氨酸)、Tricine (N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、HEPES (4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)、 TES (2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸、MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸、PIPES (哌 嗪-N，N'-双(2-乙磺酸))、Cacodylate ( 二甲基胂酸盐)、MES (2- (N-吗啉代)乙 磺酸)或乙酸盐。
13.根据权利要求11或12中任一项的方法，其中在步骤(b)中使用的所述醇是CV5
14.根据任何前述权利要求的方法，其中所述多肽是胰高血糖素样肽。
15.一种肽，其通过权利要求1-14中任一项中描述的方法获得。
全文摘要
本发明涉及用于纯化已通过固相肽合成制备的肽的有效方法。本发明还包括的是包括用于所述方法的试剂的试剂盒和通过所述方法获得的纯化肽。
文档编号C07K14/435GK102027005SQ200980116943
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者C·科恩贝克, T·B·汉森 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司