薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用，薯蓣皂苷具有肾损伤保护作用，可用于制成肾损伤保护药物。薯蓣皂苷对肾损伤而引起的NO、TNOS、iNOS、MDA尿素氮（BUN）和尿肌酐（SCr）升高具有明显的下调作用，对SOD、GSH、GSH-Px及CAT均较Model组的降低具有明显上调作用，均具有剂量依赖性。经薯蓣皂苷干预后，肾损伤导致的肾小管上皮细胞普遍肿胀，刷状缘消失、部分上皮细胞变性坏死，坏死脱落的细胞碎屑充塞管腔等现象明显减轻。根据临床用药需求，可将薯蓣皂苷作为主要有效成分制成药物制剂。薯蓣皂苷具有安全（无毒副作用）、有效、经济、实用等优点。
【专利说明】薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种薯蓣皂苷的具体应用，特别是薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用。
【背景技术】
[0002]肾脏，是人体的重要器官，用于保证机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行。肾损伤是泌尿外科常见的急症之一，对肾损伤做出适当的治疗方案，对减轻患者的伤情，改善预后情况至关重要。因此，近年来肾损伤保护药物在不断的研究和开发之中。研究发现中药对肾损伤具有明显的保护作用，已开发的药物有下列几类。I)黄酮类，如水飞蓟素、银杏黄酮、三羟基查尔酮等；2)三萜皂苷类，如人参皂苷、三七总皂苷；3)多糖类；4)多酚类物质；5)生物碱类。薯蓣皂苷(D1scin)是一种天然留体皂苷类化合物，在薯蓣科植物中含量最为丰富。现代药理学研究证实薯蓣皂苷具有抗肿瘤作用，可以诱导人子宫颈癌Hela细胞的凋亡；抗肝纤维化作用，可以有效改善四氯化碳和扑热息痛诱导的肝损伤；可改善心血管功能，已作为地奥心血康、维奥欣等降脂药物的主要成分；同时还具有调节免疫、抗血小板聚集等药理作用。但迄今为止，未见薯蓣皂苷在肾损伤保护及在制备肾保护药物中应用的相关报道。
【发明内容】
[0003]本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用。
[0004]本发明的技术解决方案是:薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用。
[0005]薯蓣皂苷在制备急性肾损伤保护药物中的应用。
[0006]薯蓣皂苷在制备慢性肾损伤保护药物中的应用。
[0007]以薯蓣皂苷为化学成分制备肾损伤保护的药物。
[0008]薯蓣皂苷在制备由肾缺血再灌注导致的急性肾损伤保护药物中的应用。
[0009]薯蓣皂苷在制备由单侧输尿管结扎导致的慢性肾纤维化保护药物中的应用。
[0010]本发明同现有技术相比，具有如下优点:
经研究发现薯蓣皂苷对肾损伤而引起的NO、TNOS, iNOS、MDA尿素氮(BUN)和尿肌酐(SCr)升高具有明显的下调作用，对SOD、GSH、GSH-Px及CAT均较Model组的降低具有明显上调作用，均具有剂量依赖性。经薯蓣皂苷干预后，肾损伤导致的肾小管上皮细胞普遍肿胀，刷状缘消失、部分上皮细胞变性坏死，坏死脱落的细胞碎屑充塞管腔等现象明显减轻。根据临床用药需求，可将薯蓣皂苷作为有效成分制成药物制剂。以薯蓣皂苷作为主要有效成分制备肾损伤保护药物，具有安全(无毒副作用)、有效、经济、实用等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1本发明实施例1薯蓣皂苷对肾缺血再灌注大鼠生化指标的影响。
[0012]图2本发明实施例1薯蓣皂苷对肾缺血再灌注大鼠保护作用的肾脏BrdU细胞增殖实验，TUNEL染色:荧光素标记(200 X)和组织病理学H&E染色图(100X)。
[0013]图3本发明实施例1薯蓣皂苷对肾缺血再灌注大鼠肾脏超微结构的影响。
[0014]图4本发明实施例1薯蓣皂苷对缺血再灌注大鼠肾脏氧化应激指标的影响。
[0015]图5本发明实施例1薯蓣皂苷对缺血再灌注大鼠炎症因子的影响。
[0016]图6本发明实施例2薯蓣皂苷对单侧输尿管结扎导致的肾纤维化大鼠肾重的影响。
[0017]图7本发明实施例2薯蓣皂苷对单侧输尿管结扎导致的肾纤维化大鼠生化指标的影响。
[0018]图8本发明实施例2薯蓣皂苷对单侧输尿管结扎导致的肾纤维化大鼠肾组织病理学考察结果。
[0019]图9本发明实施例3薯蓣皂苷对肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的治疗作用的MTT分析结果。
[0020]图10本发明实施例3薯蓣皂苷对肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的治疗作用的细胞形态学结果。
【具体实施方式】
[0021 ] 下面将说明本发明的【具体实施方式】。
[0022]实施例1薯蓣皂苷对肾缺血再灌注大鼠急性肾损伤的预防作用研究
1.实验方法
1.1动物模型建立及分组
8-10周健康成年SD雄性大鼠50只，随机分成5组:假手术组(Sham)，缺血再灌注组(Model),高剂量给药组(薯菌阜苷60 mg/kg),中剂量给药组(薯菌阜苷40 mg/kg),低剂量给药组(薯蓣皂苷20 mg/kg)。给药组给药7天后进行手术。
[0023]实验动物术前12 h禁食，自由进水，术前以10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定于操作台上。沿腹部正中线在中腹部正中切口，逐层切开分离皮肤、肌肉、腹白线进入腹腔后，用止血钳拉开两侧皮肤及腹部肌肉，用无菌纱布包裹腹腔内胃肠等脏器并拉向左侧，术中注意保护大血管，暴露右侧肾脏，可见右侧肾脏位于腹膜后，小心分离右侧肾蒂后结扎，切除右侧肾脏，于结肠脾曲外侧切开后腹膜，暴露左侧肾脏，游离左输尿管和肾上腺避免损伤，再游离左肾蒂。假手术组(Sham)分离肾蒂但不夹闭左肾动脉；Model组及高、中、低剂量给药组持续夹闭左、右肾动脉45 min再灌注24 h后处死。大鼠处死前再次用10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)将大鼠麻醉，心脏采血，放入_20°C冰箱中保存，摘除左、右肾，放入-80°C冰箱中保存。
[0024]1.2生化指标检测
用试剂盒测定各组大鼠血尿毒氮(BUN)和血肌酐(Cr )。
[0025]1.3 BrdU细胞增殖实验
取Sham组，Model组，高、中、低剂量组动物肾脏空白切片，按照试剂盒说明书进行操作。荧光显微镜下观察细胞增殖情况(棕色斑)。
[0026]1.4 TUNEL法检测肾细胞凋亡取Sham组，Model组，高、中、低剂量组动物肾脏空白切片，按照试剂盒说明书进行操作。荧光显微镜下观察阳性细胞数(绿色斑)。
[0027]1.5肾组织病理学考察
处死动物后，将一部分组织包埋进石蜡中制成蜡块，石蜡包埋组织标本进行连续切片(厚度5 ym)，37°C烘干12 h后进行HE染色，光镜下观察各组肾脏损伤的形态学变化。形态学损害表现:小管上皮细胞刷状缘丢失、小管内管型形成、小管扩张、红细胞溢出、炎症和肾小管萎缩。
[0028]1.6透射电子显微镜检查
取Sham组，Model组,高、中、低剂量组动物肾脏样品(3 mm X 3 mm),放入2%戍二醒中固定，包埋，用超薄切片术切片，染色。在透射电子显微镜观察病理变化。
[0029]1.7分子机制的初步研究
用试剂盒测定各组大鼠肾脏组织超氧化物岐化酶(S0D)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO),一氧化氮合酶(iNOS、TNOS)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)。
[0030]1.7 Real-time PCR 分析
动物肝脏中的RNA按照RNAiso Plus试剂盒操作步骤提取，计算提取的RNA样本的纯度和含量，分装保存于-8(TC,以备后续实验使用。按照PrimeScript? RT reagent Kit withgDNA Eraser试剂盒说明书上的比例配制逆转录反应液,加入相应的RNA样本,进行反转录得到cDNA。按照SYBR>re?办位Taqw II (Tli RNaseH Plus)试剂盒说明，进行mRNA水平的测定。
[0031]1.8统计学分析
实验数据用平均数土标准误差(Mean ±S.Ε.Μ.)表示，实验结果用SPSS 11.5统计软件进行分析。两组间的均数比较采用t检验；多组间均数样本比较采用One-Way ANOVA方差分析；两两比较采用P检验，当/7〈0.05，认为有显著性差异。
[0032]2.结果
2.1各组大鼠肾功能的变化
通过测定肾损伤特征性生化指标血尿毒氮(BUN)和血肌酐(Cr)考察薯蓣皂苷对肾损伤的预防作用。结果见图1，Model组的SCr和BUN均明显高于Sham组(P <0.05)，提示Model组大鼠由肾缺血再灌注诱导的肾损伤严重，而各给药组的SCr及BUN均较Model组的SCr和BUN有明显下降(P < 0.05)，且不同浓度给药组的SCr和BUN均呈浓度依赖性降低，薯蓣皂苷浓度越大，SCr和BUN降低越大。说明薯蓣皂苷对肾缺血再灌注导致的肝损伤具有明显的预防作用。
[0033]2.2 BrdU细胞增殖实验
BrdU细胞增殖实验的结果见图2。结果表明,Model组的细胞增殖数明显低于Sham组和给药组，且不同浓度给药组的细胞增殖数具有剂量依赖性，随着给药剂量的增大，细胞增殖数增加。说明薯蓣皂苷可以促进肾细胞的增殖。
[0034]2.3 TUNEL 测定结果
TUNEL测定结果见图2所示，经荧光素标记后，凋亡细胞的细胞核发出绿色荧光。与Model组相比，给药组中显绿色荧光的阳性细胞数少于Model组。结果表明，薯蓣皂苷可以显著减少缺血再灌注凋亡导致的细胞凋亡。
[0035]2.4各组大鼠肾组织HE染色结果
肾组织HE染色结果见附图2，Sham组未见明显的病理改变。Model组受损肾小管上皮细胞普遍肿胀，可见小管扩张、刷状缘消失、部分上皮细胞变性坏死，坏死脱落的细胞碎屑充塞管腔。经薯蓣皂苷干预后，小管受损状况明显减轻，其中高剂量组改善最明显，组织基本恢复正常。
[0036]2.5透射电子显微镜检测结果
透射电镜检测结果见图3。由结果可知，肾组织细胞中粗面内质网和线粒体的数量下降，大多数线粒体肿胀或畸形的，线粒体电子密度不均匀，线粒体嵴不清晰或消失，而薯蓣皂苷能明显改善肾脏线粒体的受损情况。
[0037]2.6薯蓣皂苷对大鼠肾脏氧化应激指标的影响
肾缺血再灌注可诱发肾脏的氧化应激，造成肾损伤。如图4所示，与Sham组相比，Model组中肾脏的 N0、TN0S、iNOS 及 MDA 均明显高于 Sham 组(P < 0.05) ; SOD、GSH、GSH-Px 及 CAT均明显低于sham组(P < 0.05)。而各给药组的N0、TN0S、iN0S及MDA均较Model组有明显下降(P < 0.05)，不同浓度给药组的N0、TN0S、iN0S及MDA均呈浓度依赖性降低；S0D、GSH、GSH-Px及CAT均较I/R组有明显升高(P < 0.05)，且不同浓度给药组的SOD、GSH、GSH-Px及CAT均呈浓度依赖性升高。结果表明，薯蓣皂苷可以提高机体的抗氧化能力，有效减轻大鼠肾脏的脂质过氧化和自由基损伤，改善肾功能。
[0038]2.7薯蓣皂苷对炎症因子的影响
薯蓣皂苷对炎症因子的作用结果如图5所示。给药组与模型组相比有显著性差异(p <
0.01)，11^1，几-6和了即-0的表达水平明显下调，且呈薯蓣皂苷剂量依赖性。说明薯蓣皂苷可以通过抑制炎症因子的表达而抵抗缺血再灌注诱导的肾损伤。
[0039]实施例2薯蓣皂苷对单侧输尿管结扎导致的大鼠肾纤维化的治疗作用的研究
1.实验方法
1.1动物模型建立及分组
雄性SD大鼠随机分成5组，每组10只:假手术组(Sham组)，单侧输尿管结扎组(Model组)，高剂量给药组(薯菌阜苷60 mg/kg),中剂量给药组(薯菌阜苷40 mg/kg),低剂量给药组(薯蓣皂苷20 mg/kg)。
[0040]实验动物术前12 h禁食，自由进水，术前均用10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉。Model组和给药组:左侧腹部切口打开腹腔，钝性分离左侧输尿管，于中上1/3处以4-0线双重结扎，分层缝合关闭腹腔。Sham组:左侧输尿管不予结扎，麻醉及其余手术步骤与模型组相同。术后第一天给药组开始给药，给药四周后处死大鼠，处死前再次用10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)将大鼠麻醉，心脏采血，放入_20°C冰箱中保存，摘除左肾，称量，放入_80°C冰箱中保存。
[0041 ] 1.2肾组织生化指标检测
用试剂盒测定各组大鼠血尿毒氮(BUN)和血肌酐(Cr)。
[0042]1.3肾组织病理学考察
1.3.1肾脏HE染色
按照组织病理学常规方法，将固定于10%甲醛溶液中的肾脏组织包埋入石蜡中，切成5μ m的组织薄片，制成切片，经苏木精和伊红染色(HE染色)后于100倍镜下进行组织病理学观察。
[0043]1.3.2天狼星红苦味酸染色法(Sirius Red)
中性甲醛液固定组织，石蜡包埋组织标本进行连续切片(厚度5 ym)，37°C烘干12 h后进行染色:人天青石蓝液染5?10 min,蒸懼水洗3次,天狼星红饱和苦味酸染15?30 min,无水酒精直接分化和脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光镜下观察各组肾脏损伤的形态学变化及组织纤维化程度。以lmage-Pix) Plus图像分析软件进行自动测量分析，计算肾间质纤维组织相对面积(肾间质绿染区面积/视野总面积X 100%)。
[0044]1.3.3 Masoon 染色
按照组织病理学常规方法，将固定于10%甲醛溶液中的肝脏组织包埋入石蜡中，切成5μ m的组织薄片,制成切片。组织固定于bouin氏液或zenker氏液,流水冲洗过夜,常规脱水包埋。切片脱腊至水，weigert铁苏木素(weigert铁苏木素A、B液等比例混和)染5?10min，流水稍洗，1%盐酸酒精分化，流水冲洗数分，丽春红酸性品红染液染5-10 min，流水稍冲洗。磷钥酸溶液处理约5分钟，不用水洗，直接用苯胺蓝人染液复染5 min。1%冰醋酸处理I min，95%酒精脱水多次。无水酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。
[0045]1.3.4 肾脏的 a-SMA 染色
按照组织病理学常规方法，将固定于10%甲醛溶液中的肝脏组织包埋入石蜡中，切成5μπι的组织薄片，制成切片。使用免疫组织化学方法进行染色，所用一抗为α-SMA。二抗为IgGF。无水酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。
[0046]2.结果
2.1单侧输尿管结扎对大鼠肾脏的影响
摘下的肾脏的形态、大小见图6，根据左肾的称量结果计算肾重/体重比，结果见图6。结果表明，当对大鼠进行单侧输尿管结扎后，大鼠的肾脏明显肿大，当采用薯蓣皂苷进行干预后，肾脏大小得到一定的控制。
[0047]2.2各组大鼠肾功能的变化
对大鼠单侧输尿管结扎可导致的肾纤维化，结果见图7。Model组的SCr和BUN均明显高于Sham组(P < 0.05)，而各给药组的SCr及BUN均较Model组有明显下降(P < 0.05)。不同浓度给药组的SCr和BUN均呈浓度依赖性降低。
[0048]2.3各组大鼠肾组织病理学考察结果
光学显微镜下观察各组大鼠HE染色切片，结果见图8,HE染色显示Sham大鼠肾脏病理未见明显改变。Model组肾小球硬化，肾小管高度扩张，小管基底膜变薄，间质区细胞大量增生，间质纤维化；薯蓣皂苷给药组部分肾小球部分硬化，肾小管轻度扩张，局灶性间质区细胞增生，给药组较Model组肾损伤程度有明显改善。
[0049]胶原纤维是细胞外基质成分之一，定量测定肾脏皮质胶原含量，可以用来判断肾脏间质纤维化的程度。Masson染色法和Sirius Red都具有显示大鼠肾脏胶原纤维的效果。附图8中Sirius Red染色结果胶原呈红色，胞核呈绿色，其他呈黄色。Masson染色结果胶原呈蓝色，胞质、肌纤维和红细胞呈红色，胞核呈蓝褐色。两种方法染色后测定的胶原面积无显著差异。结果显示，Sham组中的胶原纤维明显少于Model，且给药组中胶原纤维也明显少于Model。因此，给药组较Model组纤维化程度有明显改善(P < 0.05)，不同浓度给药组的纤维化程度均呈浓度依赖性降低。
[0050]肾脏的a -SMA染色结果(图8)显示，Model组的a -SMA阳性表达面积明显多于Sham组，但给药组较Model组有显著的改善，且呈剂量依赖性。
[0051]本研究通过对肾功能生化指标的检测和组织病理学检查，证明了薯蓣皂苷可以显著减轻单侧输尿管结扎导致的肾纤维化，对肾损伤具有显著的保护作用。
[0052]实施例3薯蓣皂苷对肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的治疗作用的研究
1.实验方法
1.1 NRK-52E细胞的复苏、培养、传代及实验分组
从液氮罐中取出冻存的NRK-5 2E细胞，3 7 °C水浴解冻。吸出细胞悬液加入DMEM/F12(10%FBS)培养液，1000 r/min离心5 min,弃上清液后再重复洗涤I次。用DMEM/F12(10%FBS)培养液稀释混匀，接种于50 ml培养瓶中，37°C下置于体积分数为5%的CO2细胞培养箱中静置12 h，换液除去未贴壁细胞后至细胞长满成片80%以上，用0.25%的胰酶消化传代。实验随机分为5大组，分别为空白组、模型组、三个剂量给药组，各大组又分为3小组，分别培养不同的时间3 h,6 h和9 ho
[0053]1.2 NRK-52E细胞缺氧/复氧模型的建立和MTT分析
将已汇合约80%的细胞从细胞培养瓶中消化成单个细胞，调整细胞密度至IXlO5个细胞，并接种于96孔板中，5%C02，37°C培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，实验组中用PBS冲洗，再加入实验前预冲高纯氮气30 min的缺氧液，再置入已调整为94%氮气，5%C02，1%02的37°C饱和湿度三气培养箱。实验组培养时间按预先设计分别为3，6，9 h，在缺氧相应时间后，用PBS洗涤，加入DMEM/F12 (10%FBS)培养液，给药组给予200，100和50 ng/ml的薯蓣皂苷，置入5%C02，37°C培养箱中培养12 h。以未缺氧/复氧的细胞作为空白组，另设置空白调零孔，每个实验小组设5个复孔。在各个时间段的前4个小时加入10 μ I MTT (5 mg/ml)，4小时后加入100 μ I三联液，于孵箱中培养过夜，酶标仪测定吸光度A57tl,计算缺氧复氧后的存活率。每组实验重复3次。
[0054]1.3细胞形态学观察
将已汇合约80%的细胞从细胞培养瓶中消化成单个细胞，调整细胞密度至IXlO5个细胞，并接种于6孔板中，5%C02，37°C培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，实验组中用PBS冲洗，再加入实验前预冲高纯氮气30 min的缺氧液，再置入已调整为94%氮气，5% CO2,1%02的37°C饱和湿度三气培养箱。实验组培养时间为6 h，在缺氧相应时间后，用PBS洗涤，加入DMEM/F12 (10%FBS)培养液，给药组给予200，100和50 ng/ml的薯蓣皂苷，置入5%C02，37°C培养箱中培养12 h,在倒置光学显微镜下拍照。
[0055]2.实验结果
MTT测定结果见图9，当缺氧6 h/复氧12 h时细胞存活率在55%左右。细胞缺氧6h/复氧12 h后，薯蓣皂苷作用9 h后，50、100、200、400 ng/mL薯蓣皂苷细胞存活率分别是63.77%、76.17%、83.23%、78.28%。不同剂量(50,100,200 ng/mL)和不同处理时间(3、6 和9 h)的薯蓣皂苷对细胞存活率的影响情况见图。由图可见，在相同作用时间下，随着给药剂量的加大，薯蓣皂苷使缺氧/复氧后的细胞存活率均逐渐增大，但6 h与9 h时，不同给药剂量细胞存活率很接近；在相同给药剂量时，随着给药时间的延长，薯蓣皂苷使缺氧/复氧后的细胞存活率也有所增大，但当药物作用时间9 h，给药浓度在200 ng/mL时细胞存活率最大，达到84%。
[0056] NRK-52E细胞缺氧6 h/复氧12 h模型和给药后的细胞形态学图谱见图10。结果表明薯蓣皂苷对缺氧6 h/复氧12 h导致的NRK-52E细胞损伤具有治疗作用。
【权利要求】
1.薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用，其特征在于:薯蓣皂苷在制备急性肾损伤保护药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用，其特征在于:薯蓣皂苷在制备慢性肾损伤保护药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用，其特征在于:以薯蓣皂苷为化学成分制备肾损伤保护的药物。
5.根据权利要求1所述的薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用，其特征在于:薯蓣皂苷在制备由肾缺血再灌注导致的肾损伤保护药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的薯蓣皂苷在制备肾损伤保护药物中的应用，其特征在于--薯蓣皂苷在制备由单侧输尿管结扎导致的肾纤维化保护药物中的应用。
【文档编号】A61P13/12GK104352508SQ201410511379
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】彭金咏, 尹连红, 郑玲俐, 齐蒙, 许丽娜, 齐艳, 许有威, 韩旭, 赵艳艳 申请人:大连医科大学