类松弛素-2的合成
[0090] I、B链衍生物B-I与PySSPy反应获得B链衍生物B-2
[0091] 将实施例2中获得的B链衍生物B-1，用2. 8L0.1 M NH4HCO3溶解，加入PySSPy (2, 2' -二吡啶二硫）（4. 2g，20mmol)，搅拌1小时，获得B链衍生物B-2溶液，即：
[0092]
[0093] 2、B链衍生物B-2与A链衍生物A-2反应，获得A-B
[0094] 将步骤1中获得的B链衍生物B-2溶液加入到实施例1中 制备的A链衍生物A-2水溶液中，室温搅拌2小时，获得A-B，即：
[0095] 3、碘氧化A-B，获得人类松弛素 -2粗品
[0096] 将碘（10. 2g，40mmol)用IL甲醇溶解后，加入到步骤2制备的溶液中，室温搅拌2 小时，得到人类松弛素-2的粗品溶液，即：
[0097]
[0098] 4、RP-HPLC纯化，获得人类松弛素-2精肽
[0099] 将步骤3中制备的人类松弛素-2粗品，旋干甲醇，过滤，采用Waters600RP_HPLC 系统，波长230nm，色谱柱为50 X 250mm反相C18柱，常规0. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目 的峰馏分，得到纯度大于98. 5%的精肽。将精肽溶液采用Waters600RP-HPLC系统，色谱柱 为50 X 250mm反相C18柱，0. 2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓 缩，冻干得到人类松弛素-2精肽36g，HPLC大于纯度98. 5%，总收率为30% (以起始20mmol 计算)。
[0100] 实施例4 :人类松弛素-2的合成
[0101 ] I、A链衍生物A-2与PySSPy反应获得A链衍生物A-3
[0102] 将实施例1获得的A链衍生物A-2，加入PySSPy (2, 2' -二吡啶二硫）（4. 2g， 20mmol )，搅拌1小时，获得A链衍生物A-3溶液，即：
[0103]
[0104] 2、A链衍生物A-3与B链衍生物B-I反应，获得A-B
[0105] 将实施例2中制备的70g B链衍生物B-I用2. 5L水溶解，将步骤1中制备的A链 衍生物A-3溶液加入到B链衍生物B-I溶液中，室温搅拌2小时，获得A-B，即：
[0106]
[0107] 3、碘氧化A-B，获得人类松弛素-2粗品
[0108] 将碘（10. 2g，40mmol)用IL甲醇溶解后，加入到步骤2制备的溶液中，室温搅拌2 小时，得到人类松弛素-2的粗品溶液，即：
[0109]
[0110] 4、RP-HPLC纯化，获得人类松弛素-2精肽
[0111] 将步骤3中制备的人类松弛素-2粗品，旋干甲醇，过滤，采用Waters600RP-HPLC 系统，波长230nm，色谱柱为50 X 250mm反相C18柱，常规0. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目 的峰馏分，得到纯度大于98. 5%的精肽。将精肽溶液采用Waters600RP-HPLC系统，色谱柱 为50 X 250mm反相C18柱，0. 2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓 缩，冻干得到人类松弛素-2精肽40g，HPLC大于纯度98. 5%，总收率为33% (以起始20mmol 计算)。
【主权项】
1. 人类松弛素-2的A链衍生物A-1，其具有如下所示的结构， pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys(Acm)-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys -Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys-OH02. 制备权利要求1所述的A链衍生物A-I的方法，包括如下步骤： 1. Fmoc-Cys (Trt) -OH和树脂反应，获得Fmoc-Cys (Trt)-树脂，其中树脂优选为2-CTC 树脂； 2. Fmoc-Cys (Trt)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得 A链肽树脂； 3. A链肽树脂经裂解反应，获得A链衍生物A-I。3. 人类松弛素-2的A链衍生物A-2,其具有如下所示的结构，4. 制备权利要求3所述的A链衍生物A-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求2所述的方法制备A链衍生物A-I; 2. A链衍生物A-I经氧化获得A链衍生物A-2。5. 人类松弛素-2的A链衍生物A-3,其具有如下所示的结构，6. 制备权利要求5所述的A链衍生物A-3的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求4所述的方法制备A链衍生物A-2 ; 2. A链衍生物A-2与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得A链衍生物A-3。7. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤2)所述的Fmoc保护基团的其他氨基酸分 别为 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser (tbu)-OH、 Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Lys(boc)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His (trt)-OH、Fmoc-Cys (Acm)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、 Fmoc-Lys (boc)-OH、Fmoc-Asn (trt)-OH、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ala-〇H、 Fmoc-Ser(tbu) -OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Leu-OH 和 pGlu-OH。8. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤3)中采用的裂解液为TFA:PHOH:PHSME:EDT: H20=80:5:5:2.5:5 (v:v)〇9. 人类松弛素-2的B链衍生物B-1，其具有如下所示的结构， H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Ar g-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH10. 制备权利要求9所述的B链衍生物B-I的方法，包括如下步骤： 1. Fmoc-Ser (tbu)-OH和树脂反应，获得Fmoc-Ser (tbu)-树脂，其中树脂优选为wang 树脂； 2. Fmoc-Ser (tbu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得 B链肽树脂； 3. B链肽树脂经裂解反应，获得B链衍生物B-I。11. 人类松弛素-2的B链衍生物B-2,其具有如下所示的结构，12. 制备权利要求11所述的B链衍生物B-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求10所述的方法制备B链衍生物B-I; 2. B链衍生物B-I与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得B链衍生物B-2。13. 根据权利要求10所述的方法，其中步骤2)所述的Fmoc保护基团的其他氨基 酸分别为 Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Ser (tbu)-〇H、Fmoc_Met-〇H、 Fmoc-Gly--OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Ile_OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-IIe_OH、 Fmoc-Gln (trt) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Glu(OtBu) --OH> Fmoc-Arg(Pbf) -OH、Fmoc-Gly - OH、Fmoc-Cys(Acm) - OH、 Fmoc-Leu - OH、Fmoc-Lys (boc) - OH、Fmoc-Ile - OH、Fmoc-Val - OH、Fmoc-Glu(OtBu)- OH、Fmoc-Glu (OtBu) - OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc) -OH、Fmoc-Ser (tbu) -OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。14. 根据权利要求10所述的方法，其中步骤3)中采用的裂解液为TFA:PHOH:PHSME:ED T:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇15. -种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求12所述的方法制备人类松弛素-2的B链衍生物B-2 ; 2) 按照权利要求4所述的方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-2 ; 3) 将步骤1)制备的B链衍生物B-2与步骤2)制备的A链衍生物A-2反应，获得具有 如下所示的A-B:4) 步骤3)获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品； 5) 步骤4)获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯品。16. -种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求6所述的方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-3 ; 2) 按照权利要求10所述的方法制备人类松弛素_2的B链衍生物B-I ; 3) 将步骤1)制备的A链衍生物A-3与步骤2)制备的B链衍生物B-I反应，获得具有 如下所示的A-B:4) 步骤3)获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品； 5) 步骤4)获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯品。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中步骤4)所述的氧化采用碘作为氧化剂。
【专利摘要】本发明属于药物合成技术领域，公开了人类松弛素-2的A链衍生物和B链衍生物以及由上述衍生物制备人类松弛素-2的方法，其中A链衍生物中的一对二硫键采用自然氧化法，并且采用PySSPy活化巯基，便于形成第二对二硫键，最后采用碘氧化形成第三对二硫键，成功避免了一步自然氧化法易产生错位的二硫键。此外，本发明采用简单、常用的巯基保护基，避免了采用Stbu等需要特殊切割试剂的巯基保护基，更有利于工业化生产。
【IPC分类】C07K1/04, C07K14/575, C07K1/06
【公开号】CN104892748
【申请号】CN201410076755
【发明人】肖庆, 潘俊锋, 马亚平, 袁建成
【申请人】深圳翰宇药业股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月4日