柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和产毒条件的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和产毒条件。本发明保藏号为CCTCC M2014484的柑橘褐斑病菌，用于提取粗毒素，所得柑橘褐斑病菌粗毒素含量高、纯度高，产量大，周期短，易于规模化制备。此外，用毒素代替病原菌作为研究对象，可以避免消除生物间的相互干扰和交叉污染等。本发明建立了一套简便、经济、高效的柑橘褐斑病菌毒素提取方法，为该病菌及其毒素的致病机理研究奠定了良好的基础。CCTCC M201448420141015
【专利说明】柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和产毒条件
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和产毒条 件。
【背景技术】
[0002] 病原真菌在与寄主植物相互作用的过程中能产生引起寄主生理生化反应的代谢 产物，主要包括酶、激素和毒素。其中毒素具有对寄主植物诱发病害的敏感性诱导因子，是 近几年研究的热点。病原真菌产生的毒素根据其对寄主致病范围不同可分为寄主选择性毒 素（HST)和非寄主选择性毒素（NHST)。目前已知约20种病原真菌产生HST，其中大多数 HST是病原菌的次级代谢产物。1933年Tanaka从梨黑斑病菌-菊池链格孢（Alternaria kikuchiana)中首次分离到链格孢菌产生的HST-AK毒素（Tanaka)。引起柑橘褐斑病的链 格孢菌主要是橘致病型链格孢菌，其专化性为害橘及其杂种，产生ACT毒素。Nakatsuka等 于1989年，纯化了该病菌产生的毒素并将其命名为ACT毒素 I b和II b。其中I b是主要 成分。ACT毒素由三个部分组成即EDA(9, 10-环氧基-8-羟基-9-甲基三烯酸）、缬氨酸和 一个聚酮化合物。Kohmoto等研究发现在理查德培养基中25°C，静置培养24d产毒量最高， 同时在培养基中加入微量的Zn 2+，能增加产毒量。目前已知的病原菌毒素均为有机类物质， 因此可以通过萃取、层析、色谱等方法提取。优化病菌产生毒素的条件是研究病原物生物学 特性的重要方面，对毒素的大量制备与提取等研究工作有重要作用。
[0003] 现有技术中，尚未有提取柑橘褐斑病菌粗毒素的相关报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种适合该柑橘褐斑病菌提取粗 毒素的技术和产毒条件，为研究柑橘褐斑病菌粗毒素的生物学特性奠定基础。
[0005] 本发明首先公开了一种柑橘褐斑病菌株，其保藏号为：CCTCC M 2014484。
[0006] 本发明从采自重庆万州陈家坝红橘果实中分离筛选到一柑橘褐斑病菌株 CJBHJF-2,该菌株已于2014年10月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2014484。在PDA培养基上，菌落呈灰色至橄榄色或青褐色，分生孢子梗单生或数根簇生， 直立或顶端微弯曲，有分隔，未见分枝，色泽从基部到顶部深褐色渐变为浅褐色，分生孢子 单生或链生，倒棍棒形、倒梨形或近椭圆形，淡褐色至褐色，具纵横隔膜，幼龄孢子多为卵圆 形，颜色淡褐色，〇?1个横隔，老龄孢子多为棍棒形，颜色深褐色或黑褐色，纵横隔膜较多。
[0007] 经形态学和分子生物学鉴定，确定该菌株为链格孢属链格孢菌[Alternaria alternata (Fr.) Keissler]，在柑橘上引起褐斑病，命名为柑橘褐斑病菌CJBHJF-2,中国典 型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2014484。所述柑橘褐斑病菌，生物学特性稳定， 菌株产毒量高。
[0008] 本发明第二方面公开了从柑橘褐斑病菌中提取粗毒素的方法，具体包括以下步 骤：
[0009] (1)产毒培养：转接柑橘褐斑病菌于PDA培养基上培养至形成菌落，然后取一定大 小的菌丝块，于液体培养基中继续培养一段时间，至菌丝开始变黑，得产毒培养液；
[0010] (2)滤液制备：将步骤（1)中所得产毒培养液，过滤除去菌丝，离心弃去沉淀，上清 液即为培养滤液；
[0011] (3)粗毒素提取：采用小分子萃取法，在步骤（2)中所得培养滤液中加入有机溶 齐?，萃取，去除有机溶剂，得浓缩物。然后将浓缩物复溶于水中，得粗毒素。
[0012] 优选的，步骤⑴中，所述柑橘褐斑病菌为CJBHJF-2,其保藏号为：CCTCC Μ2014484。
[0013] 优选的，步骤（1)中，PDA培养基上培养的方式为：28°C，连续黑暗，培养5?7d。
[0014] 优选的，步骤（1)中，所述液体培养基选自PSK培养基、理查德培养基、改良理查德 培养基、Fries培养基或改良Fries培养基中的任意一种。更优选为改良理查德培养基。
[0015] 优选的，步骤（1)中，于液体培养基中培养的时间为5?30d，更优选为8?10d。
[0016] 优选的，步骤（1)中，于液体培养基中培养的温度为10?35°C，更优选为28°C。
[0017] 优选的，步骤（1)中，于液体培养基中培养的光照条件为连续光照、12光照/12h黑 暗或全黑暗，更优选为连续光照。
[0018] 优选的，步骤（1)中，于液体培养基中培养的方式为静置培养或振荡培养，更优选 为振荡培养，最优选为ll〇r/min振荡培养。
[0019] 优选的，步骤（1)中，液体培养基的pH值为3?7,更优选为4?5。
[0020] 优选的，步骤（3)中，所述有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿或四氯化碳中 的任意一种或多种。更优选甲醇。
[0021] 优选的，步骤（3)中，所述有机溶剂与培养滤液等体积。
[0022] 优选的，步骤（3)中，去除有机溶剂时采用旋转蒸发法。
[0023] 本发明第三方面公开了由前述方法提取获得的柑橘褐斑病菌粗毒素。
[0024] 本发明第四方面公开了前述柑橘褐斑病菌在提取柑橘褐斑病菌粗毒素中的应用。
[0025] 本发明的有益效果如下：
[0026] 本发明系统比较了时间、温度、光照、通气量、pH值和培养基，优化了柑橘褐斑病菌 毒素的产生条件。该方法比较了丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳五种萃取剂，甲醇萃 取效果最好。选择甲醇作萃取剂，采用旋转蒸发法去除有机溶剂，方法简单易行，操作简便， 成本低。所得柑橘褐斑病菌粗毒素含量高、纯度高，产量大，周期短，易于规模化制备。此外， 用毒素代替病原菌作为研究对象，可以避免消除生物间的相互干扰和交叉污染等。本发明 建立了一套简便、经济、高效的柑橘褐斑病菌毒素提取方法，为该病菌及其毒素的致病机理 研究奠定了良好的基础。
[0027] 本发明菌株保藏信息如下：
[0028] 菌株名称：CJBHJF-2 ;
[0029] 保藏号为：CCTCC M 2014484。
[0030] 保藏日期：2014年10月15日；
[0031] 保减单位名称：中国典型培养物保减中心；
[0032] 保藏单位简称：CCTCC ;
[0033] 保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1有机溶剂萃取柑橘褐斑病菌毒素致病性测定
[0035] 图2不同培养时间对柑橘褐斑病菌产毒的影响
[0036] 图3不同培养温度对柑橘褐斑病菌产毒的影响
[0037] 图4不同培养条件对柑橘褐斑病菌产毒的影响
[0038] 图5不同pH值对柑橘褐斑病菌产毒的影响
[0039] 图6不同培养基对柑橘褐斑病菌产毒的影响
[0040] 图7接种ACT毒素后两天叶片症状
【具体实施方式】
[0041] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0042] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0043] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本【技术领域】技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本【技术领域】的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0044] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds.),Academic Press, San Diego, 1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0045] 实施例I产毒菌株的筛选
[0046] I. 1.菌株与植物
[0047] 供试菌株：CJBHJF-2、TJCHJ35B、CJBHJL-2、SP-36等29个菌株分离自重庆、西班 牙、广东、广西、浙江等地的褐斑病典型发病叶片、枝条和果实。
[0048] 生物测定材料：采自网室内1年生3?4cm长红橘叶片。
[0049] 试验中涉及的培养基配方：
[0050] PDA培养基（PDA Medium):马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，加蒸馏水定容至 IL0
[0051] PSK培养基（PSK Medium):马铃薯200g，蔗糖30g，K2HPO4Ig,加蒸馏水定容至1L。
[0052] 理查德培养基（Richard，s Medium):蔗糖 50g，KNO3IOg, KH2P045g，MgS042. 5g， FeCl2O. 02g，加蒸馈水至1L。
[0053] 改良理查德培养基（Improved-Richard Medium):葡萄糖 50g，KNO3IOg, KH2P045g， MgS042. 5g，FeCl2O. 02g，ZnSO4O. 005g，加蒸馏水至 1L。
[0054] Frie' s培养基（Frie' s Medium):鹿糖30g，酒石酸铵5g，酵母浸出液0. 5g， NH4NO3Ig, KH2PO4Ig, MgSO4. 7H20 0· 5g，NaCl 0· lg，CaCl2. H2O 0· lg，加蒸馏水至 1L。
[0055] 改良Frie's培养基（Improved-Fries Medium):鹿糖20g，酒石酸铵5g，酵母浸出 液 lg，NH4NO3Ig, KH2PO4Ig, MgSO4. 7H20 0· 5g，NaCl 0· lg，CaCl2. H2O 0· 13g，加蒸馏水至 1L。
[0056] 查彼克培养基（Czapek-Dox Medium):鹿糖 30g，NaN032g，K2HPO4Ig, KCl 0· 5g， MgSO4. 7H20 0· 5g，FeSO4O. Olg，加蒸馏水至 1L。
[0057] I. 2产毒培养方法
[0058] 转接菌种于PDA培养基上培养5?7d (28°C，连续黑暗），然后取一定大小的菌丝 块放于盛有50ml改良Richard's液体培养基的250ml三角瓶中，28°C，12h光照/12h黑暗 (12L/12D)，110r/min培养8d，至菌丝开始变黑。
[0059] 1. 3粗毒素的制备及其接种方法
[0060] 粗毒素的制备方法：菌株按上述产毒方法培养后，先用4层纱布过滤，除去菌丝。 滤液经15000r/min离心30min，得上清。上清中加入等体积甲醇，300r/min，萃取30min。 然后旋转蒸发仪65°C蒸馏至近干，以去除甲醇，溶液用无菌水定容至5ml离心管中，经 0.22 μ m滤膜过滤，得粗毒素。
[0061] 接种方法：采用离体叶片针刺法测定毒力。培养皿中放入无菌滤纸（Thomma 2003),并用无菌水浸湿，叶片放于其中。在距叶片中脉2cm处针刺,滴加50 μ 1粗毒素,保 鲜膜保湿，置于培养箱中一段时间，测量产生的病斑直径。
[0062] 1. 4产毒菌株
[0063] 从本实验室保存的29个链格孢菌株中筛选出两个菌株。这两个菌株用于产毒特 性试验，同时比较国外和国内的这两个菌株的产毒条件是否有差异。
[0064] 实施例2产毒条件的优化
[0065] 2.1萃取剂的选择
[0066] 高产毒菌株按确定的产毒条件培养后，得到培养滤液。分别取15ml培养滤液加入 等体积的丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳，300r/min萃取30min。旋转蒸发仪蒸发去 除有机溶剂，得到的粗毒素用离体叶片针刺法进行生测。
[0067] 2. 2产毒培养条件的优化
[0068] 2. 2. 1按实施例1中方法筛选出的菌株用于产毒培养条件的优化实验。
[0069] 2. 2. 2时间：按实施例1中1.2方法在液体培养基中培养5、10、15、20、25、30d取 样，制备粗毒素。
[0070] 2. 2. 3温度：按实施例1中1. 2方法分别于5、10、15、20、25、28、30、35°C条件下，在 液体培养基中培养菌株一定时间，制备粗毒素。
[0071] 2. 2. 4光照条件：按实施例1中1. 2方法分别于连续光照、12L/12D、全黑暗三种条 件下，在液体培养基中培养菌株一定时间，制备粗毒素。
[0072] 2. 2. 5通气量：分别于静置和110r/min振荡条件下，在液体培养基中培养菌株一 定时间，制备粗毒素。
[0073] 2.2.6?!1值：调节改良1^1^(1'8培养基的？!1值为2、3、4、5、6、7，培养菌株一定 时间，制备粗毒素。
[0074] 2. 2. 7 培养基：PSK、Richard' s、改良 Richard' s、Fries、改良 Fries、Czapek 六种 培养基培养菌株，一定时间后制备粗毒素。
[0075] 各处理得到的粗毒素在用于生物测定前均可保存于4°C。离体叶片针刺法进行 生物测定。以无菌水和经0.22 μ m滤膜过滤的培养基分别作为清水对照（CKO)和负对照 (CKl)。
[0076] 2. 3数据分析
[0077] 每个条件处理3个重复，离体叶片接种粗毒素两天后拍照，应用IMGEJ软件计算 病斑直径。实验结果采用Microsoft Excel 2007进行数据统计，利用SPSS软件进行数据 的方差分析和多重比较。
[0078] 2. 4 结果
[0079] 2. 4. 1产毒菌株
[0080] 从本实验室保存的29个链格孢菌株中筛选出两个菌株：西班牙菌株SP-36和万州 菌株CJBHJF-2。这两个菌株用于产毒特性试验。
[0081] 2. 4. 2萃取剂的选择
[0082] 结果表明：不同的萃取剂分层特征不同（见表1)，萃取效果也不同（见图1)。ACT 毒素是小分子物质，主要存在于水相中。四氯化碳、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮这五种萃取 剂的极性分别是I. 60、3. 40、4. 30、5. 10、5. 40。由图1可以看出，用极性强、与水互溶的甲醇 和丙酮萃取，均产生少量白色絮状沉淀物。经离心除去沉淀后的溶液基本为澄清状态，把有 机溶剂和水的混合相经减压蒸发去除有机溶剂，分别将得到的浓缩物和离心获得的沉淀物 复溶于水中进行生物活性测定。甲醇有机相减压蒸发后得到的浓缩物所产生的病斑直径较 大，而絮状沉淀引起的病斑较小，说明甲醇的有机相中含有大量的毒素，而且柑橘褐斑病菌 在液体培养基中产生的毒素成分是小分子物质，甲醇萃取效果最好。由此可知，毒素的极性 较大，在5. 10?5. 40之间。
[0083] 表1有机溶剂萃取柑橘褐斑病菌毒素有机相和水相的外观性状
[0084]
【权利要求】
1. 一种柑橘褐斑病菌株，其保藏号为：CCTCC M 2014484。
2. -种从柑橘褐斑病菌株中提取粗毒素的方法，具体包括以下步骤： (1) 产毒培养：转接柑橘褐斑病菌株于PDA培养基上培养至形成菌落，然后取一定大小 的菌丝块，于液体培养基中继续培养一段时间，至菌丝开始变黑，得产毒培养液； (2) 滤液制备：将步骤（1)中所得产毒培养液，过滤除去菌丝，离心弃去沉淀，上清液即 为培养滤液； (3) 粗毒素提取：采用小分子萃取法，在步骤（2)中所得培养滤液中加入有机溶剂，萃 取，去除有机溶剂，得浓缩物。然后将浓缩物复溶于水中，得柑橘褐斑病菌粗毒素。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，所述柑橘褐斑病菌株为 CJBHJF-2,其保藏号为：CCTCC M 2014484。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液体培养基选自PSK培养基、理查德 培养基、改良理查德培养基、Fries培养基或改良Fries培养基中的任意一种。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，于液体培养基中培养的时间 为5?30d ;于液体培养基中培养的温度为10?35°C ;于液体培养基中培养的光照条件为 连续光照、12光照/12h黑暗或全黑暗。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，于液体培养基中培养的方式 为静置培养或振荡培养。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤⑴中，液体培养基的pH值为3? 7。
8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，所述有机溶剂选自丙酮、甲 醇、乙酸乙酯、氯仿或四氯化碳中的任意一种或多种。
9. 一种由权利要求2-8任一项权利要求所述的方法制备获得的柑橘褐斑病菌粗毒素。
10. 根据权利要求1所述的柑橘褐斑病菌株在提取柑橘褐斑病菌粗毒素中的应用。
【文档编号】C07K14/37GK104388319SQ201410578773
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】唐科志, 王玲杰, 李中安, 周常勇 申请人:中国农业科学院柑桔研究所