一种多重pcr法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法
【专利摘要】本发明公开了一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法。所述引物组包括三对引物，第一对引物的上下游序列分别如SEQ?ID?No.1～2所示，第二对引物的上下游序列分别如SEQ?ID?No.3～4所示，第三对引物的上下游序列分别如SEQ?ID?No.5～6所示。该引物组有极强的特异性，每一对引物仅能扩增相应病害的病原菌特异性片段，因此可用于对水稻白枯叶病原菌、水稻细菌性条斑病原菌和水稻细菌性谷枯病原菌这三种病原菌进行同时、快速、准确的检测鉴定。
【专利说明】—种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法【技术领域】[0001]本发明属于植物病原菌检验检疫领域，具体涉及一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法。【背景技术】[0002]水稻是最重要的粮食作物，世界上一半人口以水稻为生。随着水稻种质资源的调运日益频繁，一些水稻病害随种子调运而严重扩散，对稻米产量造成了不可挽回的损失。因此，重视并加强检验检疫工作，对切实保障稻米生产安全及产地生态安全有着重要的意义。 此外，我国加入WTO后，在植物出入境检疫方面亦面临着空前的挑战。为确保我国农业的可持续发展，必须一方面有效制止病虫害传入我国，另一方面则要保证我国出口的农产品符合进口国的要求。而这些检疫、防疫工作的落实则依赖灵敏、准确以及便捷的病原检测技术的发展和应用。[0003]2007年，农业部汇同国家质量监督检验检疫总局共同制定了《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该目录中明确规定水稻白叶枯病(Rice bacterial leaf blight)、水稻细菌性条斑病(Rice bacterial leaf streak)和水稻细菌性谷枯病 (Bacterial grain rot)为水稻的检疫性病害。由于带菌种子是这三种病害的主要初侵染源与传播途径，因此及早检测发现种子上的病原菌及有无症状病害，对于预防及采取相应措施加以防治、指导生产、减少经济损失等均有着重要的意义。[0004]现阶段已有许多技术应用到对水稻白叶枯病、细菌性条斑病和细菌性谷枯病的检验检疫，例如经典的产地检验、育苗生长观察法、选择性分离、噬菌体检测、致病性测定、免疫分离、血清学检测技术等，但主要还是依据三种病原菌的生理生化差异来区分。根据《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》中关于水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测方法规定，对于出入境种子首先需要进行样品的清洗、研磨并获得提取液，然后进行 SPA的平板培养，或利用ELISA试剂盒对提取液进行快速筛选检测。对于检测结果呈阳性的还需进行进一步的平板分离和生化鉴定。整个过程程序复杂，耗时长，且仍有可能造成假阳性。[0005]近年来，随着分子生物学技术的发展，PCR技术已广泛用于水稻白叶枯病、细菌性谷枯病和细菌性条斑病的检测(TakeuchiT, Sawada H, Suzuki F，et al.Specific detection of Burkholderia plantarii and B.glumae by PCR using primers selected from thel6S_23S rDNA spacer regions [J].The Phytopathological Society of Japan，1997，63 (6):455—462.；Cottyn Bj Bautista A Tj Nelson R J，et al.Polymerase chain reaction amplification of DNA from bacterial pathogens of rice using specific oligonucleotide primers.1nt Rice Notes，1994，19:30~32.；GnanamanickamSSj Sakthivel N，Nelson R J，et al.Evaluation of Culture Media and Molecular Probesfor Detection of Xanthomonas oryzae pv.0ryzae in Rice.1n:Verma J Pj VarmaA,KUMAR Dj ed.Detection of Plant Pathogens and Their Management.New Delh1: Angkor Publishers, 1995，336~349.;张华，姜英华，胡白石，等.利用PCR技术专化性检测水稻细菌性条斑病菌.植物病理学报，2008，38(1):1~5.;怀雁，等.水稻细菌性谷枯病菌的实时荧光PCR检测技术研究.中国水稻科学，2003，23(1):107~110.;张华，胡白石，刘凤权.双重PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌.植物检疫，2007，21增刊)。[0006]但是，现有技术只能对水稻白枯叶病原菌、水稻细菌性条斑病原菌和水稻细菌性谷枯病原菌中的一种或两种进行检测鉴定，能同时对这三种病原菌进行检测鉴定的方法仍未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明公开了一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组，利用该引物组可以同对水稻白枯叶病原菌、水稻细菌性条斑病原菌和水稻细菌性谷枯病原菌这三种病原菌进行快速、准确的检测鉴定。[0008]多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组，包括三对引物:[0009]第一对引物的碱基序列为:[0010]上游引物:5'-CCTCTATGAGTCGGGAGCTG-3'；[0011]下游引物:5'-ACACCGTGATGCAATGAAGA-3'；[0012]第二对引物的碱基序列为:[0013]上游引物:5'-CAAGACAGACATTGCTGGCA-3'；[0014]下游引物:5'-GGTCTGGAATTTGTACTCCG-3'；[0015]第三对引物的碱基序列为:[0016]上游引物:5'-TCATCCTCTGACTGGCTCAA-3'；[0017]下游引物:5'-CGCTTCCGCTATCCACTTTA-3'。[0018]在GenBank中搜索水稻白叶枯病原菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzae)和细菌性条斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola)的基因并进行BLAST比对,分别获得了水稻白叶枯病原菌的特异性基因Glycosyltransferase (GenBank号为:AF169030.1，编码糖基转移酶Glycosyltransferase),以及细菌性条斑病原菌的特异性基因AvrRxo (GenBank号为: AY395713.1)。针对X.0ryzae pv.0ryzae 在 Glycosyltransferase 基因的特异性位点设计了所述第一对引物，针对X.0ryzae pv.0ryzicola在AvrRxo基因的特异位点设计了所述第二对引物。[0019]对水稻细菌性谷枯病原菌(Burkolderia glumae)的16s rDNA (GenBank号为: D87080)进行 BLAST 搜索,获得了与其同源性极高的 B.plantarii, B.gladioli, B.cepalia 的16s rDNA序列；对这些序列进行比对,发现了 B.glumae的16s rDNA的保守区和特异性区域，针对该特异性区域设计了所述第三对引物。[0020]本发明还提供了一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的方法，包括:[0021 ] (I)提取待检样品的DNA ;[0022](2)以提取的DNA为模板，利用所述引物组进行PCR扩增；[0023](3)将PCR扩增产物进行凝胶电泳分离、染色，根据扩增条带判定待测样品中水稻检疫性病原菌的种类；[0024]所述水稻检疫性病原菌为水稻白叶枯病原菌、水稻细菌性条斑病原菌和水稻细菌性谷枯病原菌。[0025]若待检样品中病原侵染的程度很低，容易导致无法检测到相应的病原菌。为避免出现“假阴性”结果，作为优选，PCR扩增体系中，水稻白叶枯病原菌DNA的浓度不低于0.01ng/ μ L ;水稻细菌性条斑病原菌DNA的浓度不低于0.05ng/ μ L ;水稻细菌性谷枯病原菌 DNA 的浓度不低于 0.1ng/μ L0 0.01ng/μ L,0.05ng/yL、0.1ng/μ L 即是相应病原菌 DNA 的检出限，本发明中，“检出限(limit of detection)”是指在本发明的PCR条件下,相应病原菌DNA能够被检测出来的最低浓度。[0026]作为优选，PCR扩增体系为50 μ L，其中，2XTaq PCR Master Mix缓冲液25 μ L， 10 μ M的引物各I μ L，DNA模板的终浓度不低于检出限，灭菌去离子水补至50 μ L ;所述 2 X Taq PCR Master Mix 缓冲液中含有 1.5mMMg2+、200 μ M dNTPUU Taq 酶。[0027]PCR 反应程序为:94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 个循环；最后72°C延伸5min。[0028]本发明还提供了一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的试剂盒，包括PCR缓冲液，MgCl2, dNTP, Taq酶，引物，阳性对照DNA和灭菌去离子水，所述引物即为本发明所述引物组。[0029]作为优选，所述试剂盒中采用2XTaq PCR Master Mix缓冲液，该缓冲液中含有 Mg2+、dNTP、Taq酶，因此不必另外设置上述的MgCl2, dNTP, Taq酶，试剂盒内只配备2 XPCR Master Mix缓冲液、引物、阳性对照DNA和灭菌去离子水即可,不仅节约试剂盒内空间也大大简化了 PCR过程，只需在2 X Taq PCR Master Mix缓冲液中加入模板、引物组和灭菌去离子水，即可进行反应。[0030]作为优选，所述试剂盒还包括核酸提取液和胶回收提取液。如此一来，利用该试剂盒即可完成对待测样品进行核酸提取、胶回收纯化的一系列步骤，不必再另外使用其他的核酸提取试剂盒以及胶回收试剂盒。[0031]与现有技术相比，本发明的有益效果为:本发明的引物组具有极强的特异性，仅能扩增相应病害的病原菌特异性片段，因此可用于对水稻白枯叶病原菌、水稻细菌性条斑病原菌和水稻细菌性谷枯病原菌这三种病原菌进行同时、快速、准确的检测鉴定。此外，由于本发明仅在一个PCR管中即可实现对三种病原菌的同时检测，因此大大降低了成本。【专利附图】
【附图说明】[0032] 图1为引物JLXooF/JLXooR对各水稻病原菌的扩增产物电泳图；其中，M为DNA分子量标准，1-4 泳道依次为 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173, 5-9 泳道依次为 X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1，10-20 泳道依次为:X.maltophilia, X.campestris, B.gladioli pv.alliicola, B.cepacia, B.glumae, Pellicularia sasakii，Fusarium oxysporumf.sp.niveum, Magnaporthe oryzae C30， Magnaporthe oryzae CHL441， Ustilaginoidea oryzae LN, Ustilaginoidea oryzae SX0201 ；[0033]图2为引物JLXocF/JLXocR对各水稻病原菌的扩增产物电泳图；其中，M为DNA 分子量标准，1~5泳道依次为X.0ryzae pv.0ryzicola的五个菌株AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1，6-9 泳道依次为 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、 Z173，10-20 泳道依次为:X.maltophilia, X.campestris, B.gladioli pv.alliicola, B.cepacia, B.glumae, Pellicularia sasakii，Fusarium oxysporumf.sp.niveum, Magnaporthe oryzae C30， Magnaporthe oryzae CHL441， Ustilaginoidea oryzae LN, Ustilaginoidea oryzae SX0201 ；[0034]图3为引物JLBgF/JLBgR对各水稻病原菌的扩增产物电泳图；其中，M为DNA分子量标准，I 泳道为 B.glumae，2 泳道为 B.gladioli pv.alliicola，3 泳道为 B.cepacia， 4-7 泳道依次为 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173，8_12 泳道依次为 X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1，13-20 泳道依次 为:X.maltophilia，X.campestris，Pellicularia sasakii，Fusarium oxysporumf.sp.niveum, Magnaporthe oryzae C30，Magnaporthe oryzae CHL441，Ustilaginoidea oryzae LN，Ustilaginoidea oryzae SX0201 ；[0035]图4为引物JLXooF/JLXooR的灵敏度检测结果图；[0036]图5为引物JLXocF/JLXocR的灵敏度检测结果图；[0037]图6为引物JLBgF/JLBgR的灵敏度检测结果图；[0038]图4-6中，M为DNA分子量标准，1-9泳道对应的DNA模板浓度依次为:lng/uL， 5X10 1Iig/ μ L，I X 10 1Iig/ μ L，5 X 10 2ng/ μ L，I X 10 2ng/ μ L，5 X 10 3ng/ μ L，I X 10 3ng/ μ L，5 X 10 4ng/ μ L，I X 10 4ng/ μ L ；[0039]图7为本发明引物组对三种水稻检疫性病原菌的多重PCR同步检测结果图；其中， M 为 DNA 分子量标准，1-3 泳道依次为 X.0ryzae pv.0ryzae Ζ173、Χ.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-K B.glumae 的 DNA ；4 泳道为 X.0ryzae pv.0ryzae Z173 和 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 的 DNA 混合物；5 泳道为 X.0ryzae pv.0ryzae Z173 和 B.glumae 的 DNA 混合物；6泳道为 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 和 B.glumae 的 DNA 混合物；7 泳道为 X.0ryzae pv.0ryzae Ζ173、Χ.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 和 Β.glumae 的 DNA 混合物；[0040]图8为利用现有引物对各水稻病原菌的扩增产物电泳图；其中，M为DNA分子量标准，1-6 泳道为 X.0ryzae pv.0ryzicola JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1、AHB4-75 以及 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225，7-11 泳道为 X.0ryzae pv.0ryzae 0S86、0S198、0S225、Z173 以及 X.0ryzae pv.0ryzicola JSB322 ；[0041 ] 图9为引物JLXooF/JLXooR和JLXocF/JLXocR对带菌水稻叶片的扩增产物电泳图；其中，M为DNA分子量标准，1，2泳道分别为X.0ryzae pv.0ryzae Z173、0S198，3， 4 泳道分别为 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1、AHB4_75，5，6 分别为人工接种 X.0ryzae pv.0ryzae Z173、0S198的水稻叶片提取物，7，8分别为人工接种X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1、AHB4-75的水稻叶片提取物，9泳道为同时接种X.0ryzae pv.0ryzae Z173 和X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1的水稻叶片提取物，10泳道为同时接种X.0ryzae pv.0ryzae 0S198 和 X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75 的水稻叶片提取物，11，12 为健康水稻叶片。【具体实施方式】[0042]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细说明。[0043]I引物设计[0044]在GenBank中搜索水稻白叶枯病原菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzae)和细菌性条斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola)的基因并进行BLAST比对,分别获得了水稻白叶枯病原菌的特异性基因Glycosyltransferase (GenBank号为:AF169030.1，编码糖基转移酶Glycosyltransferase),以及细菌性条斑病原菌的特异性基因AvrRxo (GenBank号为: AY395713.1)。针对X.0ryzae pv.0ryzae 在 Glycosyltransferase 基因的特异性位点设计了第一对引物JLXooF/JLXooR,针对X.0ryzae pv.0ryzicola在AvrRxo基因的特异位点设计了第二对引物 JLXocF/JLXocR。[0045]第一对引物JLXooF/JLXooR的碱基序列为:[0046]JLXooF:5/ -CCTCTATGAGTCGGGAGCTG-3' (SEQ ID N0.1)；[0047]JLXooR:5/ -ACACCGTGATGCAATGAAGA-3' (SEQ ID N0.2)；[0048]第二对引物JLXocF/JLXocR的碱基序列为:[0049]JLXocF:5/ -CAAGACAGACATTGCTGGCA-3' (SEQ ID N0.3)；[0050]JLXocR:5/ -GGTCTGGAATTTGTACTCCG-3' (SEQ ID N0.4)；[0051]对水稻细菌性谷枯病原菌(Burkolderia glumae)的16s rDNA (GenBank号为: D87080)进行 BLAST 搜索,获得了与其同源性极高的 B.plantarii, B.gladioli, B.cepalia 的16s rDNA序列；对这些序列进行比对,发现了 B.glumae的16s rDNA的保守区和特异性区域，针对该特异性区域设计了第三对引物JLBgF/JLBgR，其碱基序列为:[0052]JLBgF:5/ -TCATCCTCTGACTGGCTCAA-3' (SEQ ID N0.5)；[0053]JLBgR:5/ -CGCTTCCGCTATCCACTTTA-3' (SEQ ID N0.6)。[0054]2引物的特异性检测[0055]分别提取水稻白叶枯病原菌(X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、 Z173)、水稻细菌性条斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、 GXB3-14、SCB4-1)、水稻细菌性谷枯病原菌(B.glumae)、以及其他植物病原菌(B.cepacia, B.gladioli pv.alliicola、X.maltophilia、X.campestris、Pellicularia sasaki1、 Fusarium oxysporumf.sp.niveum、Magnaporthe oryzae C30、Magnaporthe oryzae CHL441>Ustilaginoidea oryzae LN>Ustilaginoidea oryzae SX0201)的 DNA,这些植物病原菌由浙江省农业科学研究院、浙江大学、浙江师范大学提供或购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。DNA 的提取方法为参见生工细菌DNA提取试剂盒的说明书。[0056]以上述提取的DNA为模板，分别用设计的三对引物进行PCR扩增，检测这三对引物的特异性。[0057]PCR 扩增体系为 50μ L，其中，2XTaq PCR Master Mix 缓冲液 25 μ L (含 1.5mM Mg2+、200 μ M dNTP、IU Taq 酶)，10 μ M 的引物各 I μ L，10ng/ul 的 DNA 模板 I μ L，灭菌去离子水补至50 μ L0[0058]PCR 反应程序为:94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 个循环；最后72°C延伸5min。[0059]检测结果分别见图1、图2和图3。[0060]由图1可见，当用引物JLXooF/JLXooR分别对上述DNA模板进行PCR扩增时， X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173均出现了特异性条带，而其他病原菌未出现条带，说明引物JLXooF/JLXooR对水稻白叶枯病原菌X.0ryzae pv.0ryzae具有较高的特异性。[0061 ] 由图2可见，当用引物JLXocF/JLXocR分别对上述DNA模板进行PCR扩增时， X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1 均出现了特异性条带，而其他病原菌未出现条带，说明引物JLXocF/JLXoCR对水稻细菌性条斑病原菌 X.0ryzae pv.0ryzicola具有较高的特异性。[0062]由图3可见，当用引物JLBgF/JLBgR分别对上述DNA模板进行PCR扩增时，仅B.glumae出现了特异性条带,其他病原菌均未出现条带,说明引物JLBgF/JLBgR对水稻细菌性谷枯病原菌B.glumae具有较高的特异性。[0063]3引物的灵敏度检测[0064]用无菌水分别对水稻白叶枯病原菌X.0ryzae pv.0ryzae Z173的DNA、水稻细菌性条斑病原菌X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1的DNA、水稻细菌性谷枯病原菌B.glumae 的 DNA 进行一系列稀释,使其浓度依次为:lng/ μ L, 5xl0_1ng/ μ L, lxlO_1ng/ μ L, 5xl0_2ng/ μ L,IxlO2ng/μ L,5x103ng/μ L,IxlO3ng/μ L,5x104ng/μ L 和 IxlO 4ng/μ L0[0065]分别取I μ L的各浓度DNA作为模板，利用相应的特异性引物进行PCR扩增，检测引物的灵敏度。PCR扩增体系和反应程序同上，检测结果见图4、图5、图6。[0066]由图4 可见，引物 JLXooF/JLXooR 对 X.0ryzae pv.0ryzae Z173 的检出限为 0.01ng/ μ L0 由图 5 可见，引物 JLXocF/JLXocR 对 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 的检出限为0.05ng/yL。由图6可见，引物JLBgF/JLBgR对B.glumae的检出限为0.1ng/μ L。由此可见，本发明的三对引物均具有较高的灵敏度。[0067]4多重PCR同步检测[0068]为实现对三种水稻检疫性病原菌的同步检测，以X.0ryzae pv.0ryzae Z173、 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4_1、B.glumae为例，分别将三种病原菌的DNA等量混合、两种病原菌的DNA等量混合、仅一种病原菌DNA作为模板，在每个扩增体系中均同时加入引物 JLXooF/JLXooR,引物JLXocF/JLXocR、引物JLBgF/JLBgR，进行PCR扩增，扩增体系和反应程序同上。扩增产物的电泳结果见图7。[0069]由图7可见，在以一种病原菌DNA为模板的扩增产物中，只有一条特异性条带；在以两种病原菌的DNA等量混合为模板的扩增产物中，可以得到两条特异性条带；在以三种病原菌的DNA等量混合为模板的扩增产物中，可以得到三条特异性条带；说明利用本发明的引物组进行多重PCR可以用于对三种水稻检疫性病原菌进行同步检测，并且，检测结果精确可/[目。[0070]5、利用已公开引物检测水稻白叶枯病原菌和水稻细菌性条斑病原菌[0071]分别以X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173, X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1这九个菌株的DNA为模板，分别利用文献 (Cho M, Kang M, Kim C, Sensitive and Specific Detection of Xanthomonas oryzae pv.0ry zae by RealTime Bio-PCR Using Pathovar-Specific Primers Based on an rhs Family Gene,Plant Disease，2011，95 (5)589-594.)中公开的引物 Xoo290F/Xoo290R (SEQ ID N0.7~8)、文献(张华，姜英华，胡白石，刘凤权，许志刚.利用PCR技术专化性检测水稻细菌性条斑病菌，植物病理学报，2008，38 (I) 1-5.)中公开的引物XoocF/XoocR (SEQ IDN0.9~10)进行PCR扩增，检验该引物对水稻白叶枯病原菌和水稻细菌性条斑病原菌的特异性，PCR扩增体系和反应程序同上。扩增产物的电泳结果见图8。[0072]由图8 可见，引物 XoocF/XoocR 从 X.0ryzae pv.0ryzicola 各菌株以及 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225 中扩增出条带，引物 Xoo290F/Xoo290R 则从 X.0ryzae pv.0ryzae 各菌株以及X.0ryzae pv.0ryzicola JSB322中扩增出条带。表明这两对引物对水稻白叶枯病原菌和水稻细菌性条斑病原菌的检测特异性较低。[0073]6对水稻带病叶片的检测[0074]分别用剪叶法和针孔注射法对水稻9311叶片进行白叶枯病原菌(X.0ryzae pv.0ryzae Z173、0S198)和细菌性条斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1>AHB4-75) 的人工接种，并提取病斑(含病斑周围水稻组织)的DNA。以提取的DNA为模板，利用引物 JLXooF/JLXooR和JLXocF/JLXocR进行扩增，PCR扩增体系和反应程序同上。扩增产物的电泳结果见图9。[0075]由图9可见，经相应病原菌接种后，在水稻叶片的病斑组织中检测到相应的病原菌侵染，体现为电泳图谱中出现了特异性的条带。表明本发明的引物JLXooF/JLXooR和 JLXocF/JLXocR能够在实际应用中用于检测鉴定水稻白叶枯病原菌和水稻细菌性条斑病原菌。由于水稻谷枯病在国内尚属少见，人工接种方法仍未建立，因此较难找到带菌叶片或对其进行活体接种。[0076]7试剂盒[0077]利用上述设计的引物制备多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的试剂盒，该试剂盒中含有:核酸提取液、2XTaq PCR Master Mix 缓冲液(含 1.5mM Mg2\200yM dNTPUU Taq 酶)、引物 JLXooF/JLXooR、引物 JLXocF/JLXocR、引物 JLBgF/JLBgR、阳性对照 DNA、灭菌去离子水以及胶回收提取液。利用该试剂盒可以实现对待测样品进行核酸提取、多重PCR扩增、 胶回收纯化获得扩增片段的一系列步骤。
【权利要求】
1.一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组，其特征在于，包括三对引物:第一对引物的碱基序列为:上游引物:5' -CCTCTATGAGTCGGGAGCTG-3'；下游引物:5' -ACACCGTGATGCAATGAAGA-3'；第二对引物的碱基序列为:上游引物:5' -CAAGACAGACATTGCTGGCA-3'；下游引物:5' -GGTCTGGAATTTGTACTCCG-3'；第三对引物的碱基序列为:上游引物:5' -TCATCCTCTGACTGGCTCAA-3'；下游引物:5' -CGCTTCCGCTATCCACTTTA-3'。
2.—种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的方法，包括:(1)提取待检样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增；(3)将PCR扩增产物进行凝胶电泳分离、染色，根据扩增条带判定待测样品中水稻检疫性病原菌的种类；所述水稻检疫性病原菌为水稻白叶枯病原菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzae)、水稻细菌性条斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola)和水稻细菌性谷枯病原菌(Burkolderia glumae)。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系中水稻白叶枯病原菌DNA的浓度不低于0.01ng/μ L0
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系中水稻细菌性条斑病原菌DNA 的浓度不低于0.05ng/ μ L。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系中水稻细菌性谷枯病原菌DNA 的浓度不低于0.1ng/μ L0
6.如权利要求2~5任一所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系为50μ L，其中， 2 X Taq PCR Master Mix缓冲液25 μ L，10 μ M的引物各I μ L，DNA模板的终浓度不低于检出限，灭菌去离子水补至50 μ L ;所述2XTaqPCR Master Mix缓冲液中含有1.5mM Mg2+、 200 μ M dNTPUU Taq 酶。
7.一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的试剂盒，包括PCR缓冲液，MgCl2, dNTP，Taq 酶，引物，阳性对照DNA和灭菌去离子水，其特征在于，所述引物为权利要求1所述的引物组。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特`征在于，还包括核酸提取液和胶回收提取液。
【文档编号】C12R1/01GK103498000SQ201310473978
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】王雪艳, 陆雯, 潘潞琪, 姚含笑 申请人:中国计量学院